本發(fā)明涉及一種檢測(cè)西瓜果斑病菌lamp引物及其快速檢測(cè)方法，專用于西瓜果斑病菌高靈敏度快速分子檢測(cè)，同時(shí)可用于田間西瓜疫病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

瓜類細(xì)菌性果斑病(bacterialfruitblotch,bfb)是西甜瓜等葫蘆科作物上重要的細(xì)菌病害。瓜類細(xì)菌性果斑病是一種典型的種傳病害，由西瓜噬酸菌(acidovoraxcitrulli)引起。該病能侵染葉片、果實(shí)和種子，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量，對(duì)瓜類生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了極大的威脅。我國(guó)自上世紀(jì)90年代首次報(bào)道后，現(xiàn)已在新疆、寧夏、河北、內(nèi)蒙古、北京、福建、海南、山東、吉林、湖南等地大量發(fā)生。瓜類細(xì)菌性果斑病造成大田西瓜和甜瓜減產(chǎn)甚至絕收，給西瓜和甜瓜生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，該病害目前的發(fā)生已呈上升趨勢(shì)。因此建立西瓜噬酸菌的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)是防止該病害發(fā)生的重要舉措。

pcr技術(shù)為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。然而，針對(duì)瓜類細(xì)菌性果斑病菌所選擇的擴(kuò)增靶點(diǎn)，目前多為16srrna或是16s及23s核糖體dna轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its。根據(jù)blast的結(jié)果，16srrna或是16s及23s核糖體dna轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its很難將西瓜果斑病菌與其它病菌分開(kāi)，這樣檢測(cè)時(shí)必然有假陽(yáng)性出現(xiàn)。同時(shí)，趙玉強(qiáng)和高必達(dá)分別根據(jù)瓜類細(xì)菌性果斑病菌菌株aac00-1的全基因組序列選擇aave_4063和aave_4064、iv型菌毛蛋自基因(genbank:cp000512.1)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)，但是上述序列的保守性有待進(jìn)一步的確認(rèn)。細(xì)菌中廣泛存在vapb-vapc基因編碼的毒性-去毒性系統(tǒng)，shavit等于2016發(fā)現(xiàn)西瓜果斑病菌中存在vapb-vapc并且其序列與其它的細(xì)菌相比差異顯著。

循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ioop-mediatedisothermalamplification，簡(jiǎn)稱lamp）是2000年由日本榮研株式會(huì)社notomi等人開(kāi)發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。lamp反應(yīng)針對(duì)靶基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)出4條引物，利用一種鏈?zhǔn)街脫Q活性的dna聚合酶（bstdnapolymerase），在恒溫條件下（60–65℃）保溫30–90分鐘，即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。由于lamp反應(yīng)的高效性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)，在90分鐘內(nèi)可擴(kuò)增10⁹–10¹⁰倍產(chǎn)物。lamp擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)一般采用熒光染料目測(cè)觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于lamp反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前l(fā)amp檢測(cè)主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測(cè)，在植物病原菌檢測(cè)中報(bào)道極少，西瓜果斑病菌的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外均報(bào)道較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中西瓜果斑病菌的生物學(xué)檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、檢測(cè)方法特異性差，靈敏度低的問(wèn)題，提供一種西瓜果斑病菌的lamp檢測(cè)引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的西瓜果斑病菌的快速檢測(cè)方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的包括以下技術(shù)方案：

1．lamp引物的設(shè)計(jì)

我們從genbank中下載西瓜果斑病菌vapb基因（登錄號(hào)：kt149413）序列，根據(jù)西瓜果斑病菌vapb基因，采用primerexplorerv4軟件設(shè)計(jì)一種lamp檢測(cè)引物，包括2條外引物(f3和b3)和2條內(nèi)引物(fip和bip)，引物序列分別為：

f3：5’-aagtggggcaatagcttgg-3’；

b3：5’-cggcctccggttactg-3’；

fip：5’-cactacgcgctagaagcagcttctgccggcgaacgtagt-3’；

bip：5’-gatgctggagcgcctccgtgttggtgaagttcaaccgcc-3’。

2．西瓜果斑病菌快速檢測(cè)體系的建立

lamp檢測(cè)：lamp反應(yīng)體系25μl，其中f3與b3各0.25-0.30μm，fip與bip各1.6-1.8μm，20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，0.1%tween-20，0.8mbetaine，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶大片段，10-50ngdna模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在60-65℃溫育30-90min，80℃保溫5-10min。

所述的檢測(cè)方法為熒光染料目測(cè)觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測(cè)觀察法：在lamp反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl顯色劑，所述顯色劑為50μmcalcein-500μmmncl2，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法：取2μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

本發(fā)明建立了西瓜果斑病菌快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的監(jiān)測(cè)技術(shù)體系，對(duì)于西瓜果斑病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，確定病害防治最佳時(shí)期具有十分重要的意義?？捎糜趲Ь闹仓甑母哽`敏度快速檢測(cè)。

當(dāng)在用于西瓜組織中存在西瓜果斑病菌時(shí)，采用naoh快速裂解法提取西瓜果斑病菌的dna，具體過(guò)程如下：(1)將西瓜病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按1mg病葉加入10μl（0.5mol/lnaoh，0.5%pvp）計(jì)量，將組織充分磨碎成糊，在12,000g離心機(jī)中離心5min；(3)取上清20μl與等體積的0.1mol/l的tris-hcl（ph8.0）混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取1μl原液、10倍、100倍、1000倍液作為pcr模板進(jìn)行擴(kuò)增。

按如下lamp反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行檢測(cè)：

①優(yōu)選的lamp反應(yīng)體系25μl：包含f3與b3各0.25μm，fip與bip各1.6μm，20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，0.1%tween-20，0.8mbetaine，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶大片段，25ngdna模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在64℃溫育60min，80℃保溫10min。

②在lamp反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl顯色劑，所述顯色劑為50μmcalcein-500μmmncl2，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光，或取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶，即可判斷所述的西瓜組織中存在西瓜果斑病菌；否則所述的西瓜組織中未存在西瓜果斑病菌。

本發(fā)明適用于發(fā)病組織中西瓜果斑病菌的快速可靠的檢測(cè)和鑒定，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中西瓜果斑病菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果：

1、結(jié)果可靠：本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的lamp檢測(cè)引物，對(duì)西瓜果斑病菌和帶西瓜果斑病菌的植物組織進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保證；

2、特異性強(qiáng)：本發(fā)明所采用的lamp引物是針對(duì)西瓜果斑病菌vapb序列中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出4條特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故特異性高。

3、靈敏度高：lamp對(duì)西瓜果斑病菌的檢測(cè)靈敏度和巢式pcr的靈敏度相當(dāng)，在dna水平上可達(dá)到10fg，比常規(guī)pcr檢測(cè)高1000倍。

4、實(shí)用性好：本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的lamp引物，可用于帶西瓜果斑病菌的組織的高靈敏度快速檢測(cè)，因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，滿足對(duì)帶菌組織中存在的西瓜果斑病菌進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要；

5、操作簡(jiǎn)便快速：應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)帶西瓜果斑病菌的組織進(jìn)行檢測(cè)可在1小時(shí)內(nèi)完成，且lamp核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，只需一個(gè)水浴鍋即可，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的分子試劑，結(jié)果肉眼直接可見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明西瓜疫病菌的特異lamp檢測(cè)結(jié)果圖。圖1中a表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中：泳道m(xù)為dl2000dnamarker，泳道1為陰性對(duì)照，泳道2為陽(yáng)性對(duì)照，泳道3為西瓜果斑病菌，泳道4-8為其他細(xì)菌及真菌菌株；圖1中b表示顯色結(jié)果，其中2號(hào)管出現(xiàn)綠色熒光，其他無(wú)顯色。

圖2為本發(fā)明西瓜疫病菌的lamp靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖。圖2中a表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中：泳道m(xù)為dl2000dnamarker，泳道7為陰性對(duì)照，1–6模板濃度分別為30ng,3ng,300pg,30pg,3pg,300fgand30fg；圖2中b表示顯色結(jié)果，1-5號(hào)顯示綠色熒光，6-7顯示橙色。

圖3為本發(fā)明對(duì)發(fā)病植株的檢測(cè)結(jié)果圖。其中：第1管為陽(yáng)性對(duì)照，第2管為陰性對(duì)照，第3管為發(fā)病組織，第4-7管為健康組織，第8管為發(fā)病組織。其中1、3、8顯示綠色熒光，其他不顯色。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括西瓜果斑病菌的lamp檢測(cè)引物，lamp引物序列分別為：

f3：5’-aagtggggcaatagcttgg-3’；

b3：5’-cggcctccggttactg-3’；

fip：5’-cactacgcgctagaagcagcttctgccggcgaacgtagt-3’；

bip：5’-gatgctggagcgcctccgtgttggtgaagttcaaccgcc-3’。

利用lamp引物檢測(cè)西瓜果斑病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶。

主要試劑：bstdna聚合酶大片段購(gòu)自英國(guó)neb公司；dnamarker購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；其余試劑均購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

實(shí)施例1：lamp引物對(duì)西瓜果斑病菌的特異性擴(kuò)增及引物序列的驗(yàn)證

本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是西瓜果斑病菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗(yàn)證西瓜果斑病菌的特異引物序列，本發(fā)明以西瓜果斑病菌、11種細(xì)菌及10種不同真菌為供試材料，采用ctab法提取組織中西瓜果斑病菌的dna。具體方法如下：取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900μl2%ctab(十六烷基三甲基溴化銨)提取液（提取液的配方為：2%ctab；100mmol/ltris-hcl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）,ph8.0；20mmol/ledta（乙二胺四乙酸二鈉）,ph8.0；1.4mol/lnacl）和90μl10%sds（十二烷基苯磺酸鈉）后混勻,于55～60℃水浴1.5h,每10min振蕩混勻一次,水浴1.5h后離心（12,000rpm）15min，取上清液加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇（酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1）,離心(12,000rpm)5min，取上清液（水相），加入與上清液等體積的氯仿抽提一次（12,000rpm）離心5min，吸上清(350μl），加0.1體積(35μl)的3mol/lnaac溶液和2體積（700μl）的冰無(wú)水乙醇,-20℃下沉淀30min后12,000rpm離心5min,輕輕地倒去上清液，加入700μl冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心，傾掉上清），在超凈工作臺(tái)上自然晾干無(wú)酒精味后用1×te（10mmol/ltris-hcl,0.1mmol/ledta,ph8.0）溶液進(jìn)行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)dna濃度并稀釋至50ng/μl待用。

對(duì)供試菌株和36株西瓜果斑病菌的特異性進(jìn)行l(wèi)amp驗(yàn)證。

①lamp反應(yīng)體系25μl：包含f3與b3各0.25μm，fip與bip各1.6μm，20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，0.1%tween-20，0.8mbetaine，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶大片段，25ngdna模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足。lamp反應(yīng)條件為在64℃溫育60min，80℃保溫10min。

②在lamp反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl顯色劑，所述顯色劑為50μmcalcein-500μmmncl2，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性?；蛉?μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

結(jié)果：除了西瓜果斑病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶外，檢測(cè)了11種其他細(xì)菌及10種真菌菌株顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。這說(shuō)明該引物具有很強(qiáng)的特異性，可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)病組織中西瓜果斑病菌快速可靠的檢測(cè)和鑒定。

實(shí)施例2：lamp引物對(duì)西瓜果斑病菌的靈敏性檢測(cè)

1．西瓜果斑病菌的lamp靈敏性檢測(cè)

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的西瓜果斑病菌dna稀釋成30ng,3ng,300pg,30pg,3pg,300fgand30fg，共10個(gè)不同濃度梯度。

①lamp反應(yīng)體系25μl：包含f3與b3各0.25μm，fip與bip各1.6μm，20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，0.1%tween-20，0.8mbetaine，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶大片段，25ngdna模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在64℃溫育60min，80℃保溫10min。

②在lamp反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl顯色劑，所述顯色劑為50μmcalcein-500μmmncl2，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性?；蛉?μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

2．檢測(cè)結(jié)果：西瓜果斑病菌lamp靈敏性檢測(cè)，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶，檢測(cè)靈敏度可達(dá)300fg（見(jiàn)圖2）。

實(shí)施例3：發(fā)病組織中西瓜果斑病菌的檢測(cè)

1．樣品采集：植物組織樣品采自福建福州、漳州、和寧德西瓜生產(chǎn)基地。

2．dna提取及檢測(cè)

發(fā)病植物組織采用naoh快速裂解法提取西瓜果斑病菌dna。具體過(guò)程如下：(1)將西瓜病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按1mg病葉加入10μl（0.5mol/lnaoh，0.5%pvp）計(jì)量，將組織充分磨碎成糊，在12,000g離心機(jī)中離心5min；(3)取上清20μl與等體積的0.1mol/l的tris-hcl（ph8.0）混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取1μl原液、10倍、100倍、1000倍液作為pcr模板進(jìn)行擴(kuò)增。

按下述方法進(jìn)行l(wèi)amp檢測(cè)：

①lamp反應(yīng)體系25μl：包含f3與b3各0.25μm，fip與bip各1.6μm，20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，0.1%tween-20，0.8mbetaine，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶大片段，25ngdna模板，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在64℃溫育60min，80℃保溫10min。

②在lamp反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μl顯色劑，所述顯色劑為50μmcalcein-500μmmncl2，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性。或取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

3．檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示，發(fā)病組織中感染西瓜果斑病菌，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光，健康組織顯色結(jié)果則觀察到橙色熒光。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種檢測(cè)西瓜果斑病菌lamp引物及其快速檢測(cè)方法

<130>4

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aagtggggcaatagcttgg19

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gatgctggagcgcctccgtgttggtgaagttcaaccgcc39