一種抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體是由分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6分泌產(chǎn)生的，該小鼠雜交瘤細胞株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC?No.8960。本發(fā)明所提供的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體的特異性好，效價高，與瓜類果斑病菌不同分離物均起反應(yīng)，具有較好的廣譜性。應(yīng)用于瓜類果斑病菌血清學診斷試劑中，特異性好，避免了交叉反應(yīng)。本發(fā)明研制的瓜類果斑病菌的單克隆抗體可用于研制瓜類果斑病菌的免疫學診斷試劑，如酶聯(lián)診斷試劑，膠體金免疫試紙條，抗體芯片，生物傳感器等。
【專利說明】一種抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]瓜類果斑病是西瓜、甜瓜上的一種毀滅性病害，由曬酸菌屬燕麥種西瓜亞種(Acidovorax citrulli )引起,是我國對內(nèi)和對外的重要植物檢疫性有害生物。該病主要通過種子帶菌傳播。苗期和成株均可發(fā)病。瓜苗染病沿中脈出現(xiàn)不規(guī)則褐色病變，有的擴展到葉緣，從葉背面看呈水潰狀，種子帶菌的瓜苗在發(fā)病后I~3周即死亡。西瓜果實染病，初在果實上部表面現(xiàn)數(shù)個幾毫米大小灰綠色至暗綠色水潰狀斑點，后迅速擴展成大型不規(guī)則的水浸狀斑，變褐或龜裂，致果實腐爛，分泌出一種粘質(zhì)琥珀色物質(zhì)，進一步發(fā)展，細菌透過瓜皮進入果內(nèi)。該病多始于成瓜向陽面，與地面接觸處未見發(fā)病，瓜蔓不萎蔫，病瓜周圍病葉上現(xiàn)褐色小斑，病斑通常在葉脈邊緣，有時被一個黃色組織帶包圍，病斑周圍呈水潰狀是該病別于其他細菌病害的重要特征。
[0003]對于該細菌病害，較為可行的控制措施是實行檢疫控制其擴展，而這有賴于準確、快速、靈敏的檢測技術(shù)的應(yīng)用。酶聯(lián)檢測技術(shù)是一種較為快速準確的檢測方法，而瓜類果斑病菌單克隆抗體的研制是酶聯(lián)檢測方法的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體及其應(yīng)用。
[0005]所述抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體是由分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6分泌產(chǎn)生的，該小鼠雜交瘤細胞株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.8960。`
[0006]上述分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCC N0.8960分泌產(chǎn)生的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0007]將所述抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體用標記酶進行標記后形成的酶標抗體，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0008]在本發(fā)明中，所述標記酶具體為堿性磷酸酯酶。
[0009]本發(fā)明所提供的分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCCN0.8960,或所述抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體,或所述酶標抗體在如下(al)或(a2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0010](al)檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌；
[0011](a2)制備檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的試劑或試劑盒中。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的試劑盒。
[0013]本發(fā)明所提供的試劑盒中含有獨立包裝的所述抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體或所述酶標抗體。
[0014]本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨立包裝的瓜類果斑病菌包被抗體和/或瓜類果斑病菌標準品。
[0015]其中，所述瓜類果斑病菌包被抗體可為抗瓜類果斑病菌的多抗；在本發(fā)明中，所述瓜類果斑病菌包被抗體具體為ACD公司生產(chǎn)的抗瓜類果斑病菌的多抗，其產(chǎn)品目錄號為B260-C1。
[0016]本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨立包裝的如下I) -6)試劑中的至少一種:
[0017]1)包被緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為碳酸鈉、碳酸氫鈉；所述碳酸鈉、所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的終濃度分別為1.59g/L、2.93g/L，pH值為9.6 ;
[0018]2)封閉液:含20g/L牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；
[0019]3)洗滌緩沖液:含有體積分數(shù)0.05%的吐溫20的磷酸鹽緩沖液；
[0020]4)樣品抽提緩沖液:溶劑為洗滌緩沖液,溶質(zhì)為亞硫酸鈉和聚乙烯基吡咯烷酮；所述亞硫酸鈉和所述聚乙烯基吡咯烷酮在所述樣品抽提緩沖液中的終濃度分別為1.3g/L和 20g/L ；
[0021]5)酶標抗體稀釋緩沖液:溶劑為所述洗滌緩沖液，溶質(zhì)為聚乙烯基吡咯烷酮和牛血清白蛋白；所述聚乙烯基吡咯烷酮和所述牛血清白蛋白在所述酶標抗體稀釋緩沖液中的終濃度分別為20g/L和2g/L ；
[0022]6)底物溶液:溶劑為水，溶質(zhì)為二乙醇胺；所述二乙醇胺在所述底物溶液中的終濃度分別為97mL/L，pH值為9.8。
[0023]在本發(fā)明中，以上I) -6)試劑中的所述聚乙烯基吡咯烷酮的分子量為24000~40000。
[0024]在本發(fā)明中，以上1)-6)試劑中的所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)為氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和氯化鉀；所述氯化鈉、所述磷酸二氫鉀、所述磷酸氫二鈉和所述氯化鉀在所述洗滌緩沖液中的終濃度分別為8.0g/L、0.2g/L、l.15g/L、0.2g/L，pH值為
7.4。
[0025]本發(fā)明的還一個目的是提供一種檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的方法。
[0026]本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的方法，包括使用所述試劑盒對待測樣品(如植物樣品)進行檢測的步驟。
[0027]所述試劑盒在定性或定量檢測瓜類果斑病菌中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0028]在本發(fā)明中，以上所有的所述瓜類果斑病菌均可具體為瓜類果斑病菌(Acidovorax citrulli)ATCC29625。
[0029]實驗證明，本發(fā)明所提供的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體的特異性好，效價高，與瓜類果斑病菌不同分離物均起反應(yīng)，具有較好的廣譜性。應(yīng)用于瓜類果斑病菌血清學診斷試劑中，特異性好，避免了交叉反應(yīng)。本發(fā)明研制的瓜類果斑病菌的單克隆抗體可用于研制瓜類果斑病菌的免疫學診斷試劑,如酶聯(lián)診斷試劑,膠體金免疫試紙條,抗體芯片，生物傳感器等。
[0030]保藏說明
[0031]參據(jù)的生物材料(株):4C6
[0032]科學描述:分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株
[0033]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心[0034]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0035]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0036]保藏日期:2014年3月19日
[0037]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8960
【具體實施方式】
[0038]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040]瓜類果斑病菌(Acidovoraxcitrulli):引自 ATCC,其 ATCC 編號為 29625。
[0041]Balb/c小鼠:6_8周齡,雌性,購自中國軍事科學院。
[0042]SP2/0骨髓瘤細胞:記載于“李桂芬、馬潔、魏梅生等，番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體的制備及檢測.植物檢疫，2009，23 (6):16-18”一文，公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。
[0043]弗氏完全佐劑=Sigma公司，產(chǎn)品目錄編號為F5881。
[0044]弗氏不完全佐劑=Sigma公司，產(chǎn)品目錄編號為F5506。
[0045]下述實施例中ELISA檢測中所用到的各溶液配方具體如下:
[0046]包被緩沖液:將碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g溶于水，用水定容至1L;PH值為
9.6。
[0047]封閉液:含20g/L牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液。其中，磷酸鹽緩沖液的配方為:將氯化鈉8.0g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.15g，氯化鉀0.2g，溶于水中，用水定容至1L;PH值為7.4。
[0048]洗滌緩沖液:含有體積分數(shù)0.05%的吐溫20的磷酸鹽緩沖液。其中,磷酸鹽緩沖液的配方為:將氯化鈉8.0g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.15g，氯化鉀0.2g，溶于水中，用水定容至IL ;pH值為7.4。
[0049]樣品抽提緩沖液液:將亞硫酸鈉1.3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于所述洗滌緩沖液中，用所述洗滌緩沖液定容至1L。
[0050]酶標抗體稀釋緩沖液:將聚乙烯基吡咯烷酮20g和牛血清白蛋白(BSA) 2g溶于所述洗滌緩沖液中，所述用洗滌緩沖液定容至1L。
[0051]底物溶液:將二乙醇胺97mL溶于水中，調(diào)節(jié)pH值至9.8，然后用水定容至1L。
[0052]如上各溶液中的聚乙烯基吡咯烷酮的分子量為24000~40000。
[0053]實施例1、小鼠雜交瘤細胞株的獲得及抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體的制備
[0054]一、動物免疫
[0055]1、細菌培養(yǎng)
[0056]挑取KB平板培養(yǎng)基上的瓜類果斑病菌(Acidovorax citrulli )ATCC29625的單菌落，劃線于KB平板培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)48h，用生理鹽水洗滌菌落至2ml離心管中，生理鹽水洗滌2次，調(diào)濃度至108CFU/mL，用于小鼠免疫試驗。
[0057]2、 小鼠免疫
[0058]第一次免疫:取等體積的弗氏完全佐劑與步驟I獲得的瓜類果斑病菌的菌懸液，乳化完全后腹腔注射Balb/c小鼠，每只小鼠用量為IO8CFU瓜類果斑病菌。[0059]第二次免疫:第一次免疫2周后進行第二次免疫，取等體積的弗氏不完全佐劑與步驟I獲得的瓜類果斑病菌的菌懸液，乳化后進行腹腔注射，每只小鼠用量同第一次免疫。
[0060]第三次免疫:第二次免疫2周后,進行第三次免疫,方法和劑量同第二次免疫。
[0061]加強免疫:第三次免疫后I周尾靜脈采血進行血清效價測定(間接ELISA法)，當血清效價達到1:104以上時用步驟I獲得的瓜類果斑病菌的菌懸液直接腹腔注射Balb/c小鼠加強免疫，用量為IO8CFU瓜類果斑病菌。
[0062]上述間接ELISA法測定血清效價的步驟具體如下:
[0063]I)包被:在96孔酶標板中加入100 μ L濃度108CFU/ml的瓜類果斑病菌的菌懸液(溶劑為包被緩沖液)，37°C孵育2小時，用洗滌緩沖液洗滌3次。
[0064]2 )封閉:用封閉液封板,37 °C孵育30min，用洗滌緩沖液洗滌3次。
[0065]3)加待測樣本:將100 μ L按一定比例稀釋的待測的免疫后小鼠血清樣本加至酶標板中，置濕盒中37°C條件下2小時，洗板4次。同時設(shè)置以未經(jīng)免疫的小鼠血清作為待測樣品的對照孔。
[0066]4)加酶標抗體:將馬抗小鼠酶標抗體(購自中山金橋公司-美國VECTOR公司產(chǎn)品，商品目錄號為W0426)用酶標抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下2小時，用洗漆緩沖液洗板3次。
[0067]5)顯色:將底物對硝基苯磷酸二鈉(P NPP,現(xiàn)配現(xiàn)用)按lmg/mL的濃度溶于底物溶液中，混勻，加入 到酶標板孔中，每孔100 μ L。
[0068]6)讀數(shù):以405nm單波長測定各待測孔OD值，以與陰性對照孔(以未經(jīng)免疫的小鼠血清作為待測樣品的對照)OD值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷血清效價的臨界點。ELISA結(jié)果判定方法:效價用P/N>2.1的血清的最大稀釋倍數(shù)表示。
[0069]二、細胞融合和克隆化
[0070]在加強免疫后80小時進行細胞融合試驗。將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合(脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞的數(shù)量比例為9:1)。采用有限稀釋法篩選分泌單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株；用濃度為108CFU/ml的瓜類果斑病菌的菌懸液包被酶標板，采用間接ELISA進行測定，篩選分泌抗體效價高且與對照菌不發(fā)生反應(yīng)(見實施例2特異性實驗)的陽性單克隆細胞株。對陽性孔的細胞用有限稀釋法克隆3次，使陽性率達
100% ο
[0071]上述間接ELISA法篩選陽性細胞及測定抗體效價的步驟具體如下:
[0072]I)包被:在96孔酶標板中加入100 μ L濃度108CFU/ml的瓜類果斑病菌的菌懸液(溶劑為包被緩沖液)，37°C孵育2小時，用洗滌緩沖液洗滌3次。
[0073]2 )封閉:用封閉液封板,37 °C孵育30min，用洗滌緩沖液洗滌3次。
[0074]3)加待測樣本:將100 μ L待測的雜交瘤細胞培養(yǎng)液加至酶標板中，置濕盒中37°C條件下2小時，洗板4次。同時設(shè)置以SP2/0細胞培養(yǎng)上清代替待測樣品的對照孔。
[0075]4)加酶標抗體:將馬抗小鼠酶標抗體(購自中山金橋公司-美國VECTOR公司產(chǎn)品，商品目錄號為W0426)用酶標抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下2小時，用洗漆緩沖液洗板3次。
[0076]5)顯色:將底物對硝基苯磷酸二鈉(P NPP)按lmg/mL的濃度溶于底物溶液中，混勻，加入到酶標板孔中，每孔100 μ L。[0077]6)讀數(shù):以405nm單波長測定各待測孔OD值，以與陰性對照孔(以SP2/0細胞培養(yǎng)上清代替待測樣品的對照)OD值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為陽性或確定效價的臨界點。ELISA結(jié)果判定方法:若P/N>2.1，則判別為陽性細胞；效價用P/N>2.1的細胞培養(yǎng)液上清的最大稀釋倍數(shù)表示。
[0078]經(jīng)間接ELISA法篩選，3次亞克隆化獲得了 I株能穩(wěn)定分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為4C6。該小鼠雜交瘤細胞株已于2014年3月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC N0.8960。
[0079]三、細胞凍存和復蘇
[0080]用凍存液將分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCC N0.8960制成5 X IO6個/mL的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時，取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0081]四、單克隆抗體的制備、純化及亞型鑒定
[0082]1、增量培養(yǎng)制備單克隆抗體及效價測定
[0083]細胞培養(yǎng)基的制備方法:向DMEM培養(yǎng)基中添加小牛血清(購自GIBC0BRL，產(chǎn)品目錄號為26170-043)，小牛血清的終濃度為20% (體積分數(shù))，pH為7.0。
[0084]將分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCC N0.8960置于上述細胞培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，期間每天觀察，并及時擴增培養(yǎng)。采用間接ELISA法對培養(yǎng)上清進行效價測定，具體操作參見步驟二中“間接ELISA法篩選陽性細胞及測定抗體效價”。實驗重復三次。
[0085]結(jié)果顯示，分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CG`MCC N0.8960細胞培養(yǎng)上清的抗體效價為1:4000。`
[0086]2、單克隆抗體的純化
[0087]用G蛋白柱(GE公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為17-0404-01)對步驟I獲得的細胞培養(yǎng)液上清中抗體進行純化(具體操作參見產(chǎn)品說明書進行)，純化后的抗體(即分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCC N0.8960分泌的單克隆抗體)_20°C保存。
[0088]3、單克隆抗體Ig類型的鑒定
[0089]將步驟2得到分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCCN0.8960分泌的單克隆抗體溶液采用Sigma公司單抗分型試劑(產(chǎn)品編號為IS02)檢測單克隆抗體的Ig類型，具體操作參見試劑盒說明書。
[0090]結(jié)果顯示，分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCC N0.8960分泌的單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgGl型。
[0091]實施例2、實施例1獲得的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體的檢測
[0092]一、實施例1獲得的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體的特異性檢測
[0093]1、供試菌株
[0094]瓜類果斑病菌(Acidovorax citrulli) ATCC29625和表1中的對照菌。
[0095]表1抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體特異性檢測所用對照菌
[0096]
【權(quán)利要求】
1.分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.8960。
2.抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體，其特征在于:所述單克隆抗體是由權(quán)利要求1所述的分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCC N0.8960分泌產(chǎn)生的。
3.將權(quán)利要求2所述的單克隆抗體用標記酶進行標記后形成的酶標抗體，其特征在于:所述標記酶為堿性磷酸酯酶。
4.權(quán)利要求1所述的分泌瓜類果斑病菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C6CGMCCN0.8960，或權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，或權(quán)利要求3所述的酶標抗體在如下(al)或(a2)中的應(yīng)用: (al)檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌； (a2)制備檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的試劑或試劑盒。
5.一種檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中含有獨立包裝的權(quán)利要求2所述的抗瓜類果斑病菌的單克隆抗體或權(quán)利要求3所述的酶標抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有獨立包裝的瓜類果斑病菌包被抗體和/或瓜類果斑病菌標準品。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有獨立包裝的如下I) -6)試劑中的至少一種: 1)包被緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為碳酸鈉、碳酸氫鈉；所述碳酸鈉和所述碳酸氫鈉在所述包被緩沖液中的終濃度分別為1.59g/L和2.93g/L ； 2)封閉液:含20g/L牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液； 3)洗滌緩沖液:含有體積分數(shù)0.05%的吐溫20的磷酸鹽緩沖液； 4)樣品抽提緩沖液:溶劑為所述洗滌緩沖液，溶質(zhì)為亞硫酸鈉和聚乙烯基吡咯烷酮；所述亞硫酸鈉和所述聚乙烯基吡咯烷酮在所述樣品抽提緩沖液中的終濃度分別為1.3g/L和 20g/L ； 5)酶標抗體稀釋緩沖液:溶劑為所述洗滌緩沖液，溶質(zhì)為聚乙烯基吡咯烷酮和牛血清白蛋白；所述聚乙烯基吡咯烷酮和所述牛血清白蛋白在所述酶標抗體稀釋緩沖液中的終濃度分別為20g/L和2g/L; 6)底物溶液:溶劑為水，溶質(zhì)為二乙醇胺；所述二乙醇胺在所述底物溶液中的終濃度為 97mL/L。
8.—種檢測或輔助檢測瓜類果斑病菌的方法，包括使用權(quán)利要求5-7中任一所述的試劑盒對待測樣品進行檢測的步驟。
9.權(quán)利要求5-7中任一所述的試劑盒在定性或定量檢測瓜類果斑病菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/577GK103881980SQ201410111292
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】李桂芬, 馬潔, 田茜, 魏梅生, 趙文軍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院