專(zhuān)利名稱：一種瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)的方法。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基富集分離、免疫吸附磁性分離病菌和PCR技術(shù)以使瓜類(lèi)種子帶菌檢測(cè)快速、靈敏和準(zhǔn)確。
本發(fā)明的研究背景瓜類(lèi)果斑病是由燕麥?zhǔn)乘嵛鞴蟻喎N(Acidovorax avenae subsp.citrulli)(Willems，A.，Goar，M.et al.Int.J.Syst.Bacteriol.1992，42107～119)引起的細(xì)菌性病害，該病病菌現(xiàn)已分布美國(guó)，澳大利亞，巴西、日本、馬利亞納群島，印度尼西亞，土耳其等國(guó)家(趙廷昌，孫福在，王兵萬(wàn)，《植保技術(shù)與推廣》，2001(3)37～38)，寄主包括西瓜、哈密瓜、羅馬甜瓜、黃瓜、南瓜、白蘭瓜、蜜露洋香瓜和網(wǎng)文洋香瓜等多種瓜類(lèi)(Walcott R R，Langston D B Jr.，F(xiàn).H.Sanders，Jr.，et al.Plant Disease，2000，84(3)372；Assouline，I.et al.Phytoparasitica，1997，25(2)117～118；Martin H L，O’Brien R G..Plant Disease，1999，10965；O’Brien R G.，Martin H L.Australian Journalof Experimental Agriculture，1999，39479～485.)。該病菌以人工接種，可以感染其他葫蘆科(包括甜瓜、節(jié)瓜、瓠瓜、絲瓜、苦瓜、西葫蘆等)、菠菜、番茄、胡椒及茄子等作物。該病為種子帶菌病害，病菌可附著在瓜種子表面，也可以侵入種子的內(nèi)部組織，帶菌的種子成為本病的主要初侵染源，病菌于低溫下在種子上可存活相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，帶菌的種子保存在12℃下，經(jīng)一年后傳病率也沒(méi)有降低。
以哈密瓜為例就可知此瓜類(lèi)果斑病的嚴(yán)重危害性。哈密瓜又稱厚皮甜瓜，汁多味甜，清涼爽口，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。哈密瓜作為新疆的主要特產(chǎn)聞名于世，種植面積60余萬(wàn)畝，年總產(chǎn)值12.64億元，為新疆的經(jīng)濟(jì)發(fā)展發(fā)揮了非常重要的作用。哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli(Schaad et al.)Willemset al.)是我國(guó)檢疫性有害生物，該病為害葉片和果實(shí)，一般生產(chǎn)田發(fā)病率在45％以上，特別是在陰雨天較多，空氣濕度大，露水大的天氣條件下，該病迅速發(fā)展，并且可在暴風(fēng)雨后1-2天大流行，其發(fā)病率高達(dá)100％。如果防治不及時(shí)，葉片會(huì)出現(xiàn)干枯，瓜被侵染，病菌進(jìn)入瓜體內(nèi)部，侵染瓜肉，成熟時(shí)腐爛。哈密瓜細(xì)菌性果斑病為種子帶菌病害，近年在新疆和內(nèi)蒙古發(fā)生嚴(yán)重，嚴(yán)重影響哈密瓜生產(chǎn)和瓜類(lèi)種子的進(jìn)出口貿(mào)易，該病的發(fā)生受到國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的高度關(guān)注，因此必須建立快速準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)種子進(jìn)行檢驗(yàn)，防止病害的傳播和危害。
種子帶菌檢測(cè)的方法很多，傳統(tǒng)的種子傳病原細(xì)菌的檢測(cè)方法有肉眼檢測(cè)法、過(guò)篩檢測(cè)法、比重檢測(cè)法、解剖檢測(cè)法、洗滌檢測(cè)法、分離培養(yǎng)檢測(cè)法、化學(xué)染色檢測(cè)法、噬菌體檢測(cè)法、生物測(cè)定檢測(cè)法、離體培養(yǎng)檢測(cè)法等。這些方法的基本特點(diǎn)是精確度低，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度差。
應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)植物病原細(xì)菌已是一種成熟的技術(shù)，適合應(yīng)用于種子帶菌診斷，尤其是對(duì)大批量的種子進(jìn)行檢疫檢測(cè)。主要方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、直接瓊脂雙擴(kuò)散、免疫放射分析法、免疫熒光分析法、免疫熒光菌落染色、免疫吸附免疫熒光、免疫分離法、免疫親合分離。但血清學(xué)檢測(cè)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。
近年來(lái)人們開(kāi)始應(yīng)用PCR的方法來(lái)對(duì)病菌進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。PCR方法靈敏、準(zhǔn)確、方便、快速，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列的拷貝。目前研究人員已在檢測(cè)種子帶菌方面應(yīng)用PCR技術(shù)做了大量工作，設(shè)計(jì)得到了大量相關(guān)引物。利用特異引物的新方法使細(xì)菌性病害檢測(cè)能力得到加強(qiáng)。如用對(duì)16S和23S rRNA基因通用的引物來(lái)擴(kuò)增病原物及其親緣關(guān)系相近的細(xì)菌菌系，然后分析得到的擴(kuò)增片段?；趯?duì)DNA序列數(shù)據(jù)的對(duì)比分析，特別是非同源部分的表現(xiàn)分析，可設(shè)計(jì)特異引物用專(zhuān)一性檢測(cè)某病原。
現(xiàn)已證明PCR要比ELISA或免疫熒光等方法檢測(cè)病原要靈敏得多。免疫學(xué)和PCR技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方法包括免疫PCR和免疫磁性分離-PCR。免疫磁性分離所用的磁性免疫微球(IMMS)是近年發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型功能性材料，它是磁性微球(MMS)載體表面通過(guò)化學(xué)或物理方法連接上具有一定免疫活性的物質(zhì)作為配體而研制成的。由于磁性微球粒徑一般很小，比表面積大，故而偶聯(lián)容量較高，懸浮穩(wěn)定性較好，便于各種反應(yīng)高效而方便地進(jìn)行；又因其具有順磁性，在外電場(chǎng)的作用下固液相的分離十分簡(jiǎn)單，可省去過(guò)濾、離心等繁雜操作，并可在磁場(chǎng)作用下定位，方便地進(jìn)行分離同配體相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。該方法應(yīng)用于種子帶菌檢測(cè)的具體做法是包被于IMMS上的抗體選擇性吸附目標(biāo)菌，洗掉未吸附的污染物，然后對(duì)目標(biāo)菌擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，根據(jù)所得結(jié)果判斷目標(biāo)菌是否存在。對(duì)病原菌的檢測(cè)也可以在液體或固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行預(yù)富集后進(jìn)行PCR(即BIO-PCR)，可獲得更強(qiáng)的敏感性。BIO-PCR作為PCR的一種輔助手段，正越來(lái)越多地被人們所采用(Schaad N W，Berthier-Schaad Y，Sechler A，et al.Plant Dis.，1999，831095～1100.)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的出現(xiàn)，成為DNA或RNA檢測(cè)方法的又一突破性進(jìn)步。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)已開(kāi)始在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域中使用(Stead D E，Elphinstone J G，Simpkins S，et al.Phytopathology92S110.Publication no.P-2002-0120-SSA)。
目前已有的種子帶菌單項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)都有自己的優(yōu)點(diǎn)，但單項(xiàng)技術(shù)也存在漏檢和假陽(yáng)性問(wèn)題，結(jié)合生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，我們提出BIO-免疫磁性分離-PCR技術(shù)(BIO-IMS-PCR)，BIO-IMS-PCR的特點(diǎn)是對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行三步逐級(jí)檢測(cè)一是選擇性培養(yǎng)基的篩選作用，二是血清的免疫富集作用，三是PCR特異性擴(kuò)增作用。經(jīng)過(guò)逐級(jí)檢測(cè)，能夠提高靈敏度，防止檢測(cè)時(shí)的漏檢和假陽(yáng)性。這一檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌技術(shù)，與在種子帶菌檢測(cè)上已用的多種方法如種植、選擇性培養(yǎng)基、ELISA的檢測(cè)方法、IMS-PCR方法、BIO-PCR方法、實(shí)時(shí)PCR相比，更加準(zhǔn)確和靈敏。哈密瓜種子帶菌BIO-IMS-PCR檢測(cè)技術(shù)可為瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病種子帶菌的快速檢驗(yàn)提供技術(shù)支持，對(duì)保障我國(guó)種子貿(mào)易和哈密瓜等瓜類(lèi)的安全生產(chǎn)具有重要意義。
本發(fā)明的目的針對(duì)上述各種種子帶菌檢測(cè)技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是為瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌提供一種快速、可靠和靈敏的檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用生物特性分離培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、免疫磁性分離-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IMS-PCR)技術(shù)以及實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)相結(jié)合的技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌，與單一的種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA的檢測(cè)方法相比，更能夠省時(shí)、省空間、準(zhǔn)確、靈敏。因此可有益于對(duì)瓜類(lèi)種子帶果斑病菌進(jìn)行帶菌檢驗(yàn)，以防止病害的傳播和危害。
本發(fā)明的技術(shù)方案1.果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的分離培養(yǎng)檢測(cè)選常規(guī)供試菌株(見(jiàn)表1和表2，供試菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供)在KB培養(yǎng)基上活化后在改良的ASCM培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)48小時(shí)，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況。制備果斑病菌株的3×104CFU/ml菌懸液，吸取100μl置于ASCM液體培養(yǎng)基中于37℃，200rpm培養(yǎng)。每3小時(shí)吸取培養(yǎng)液100μl，連續(xù)取10次，涂布于KB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后記錄菌落個(gè)數(shù)。通過(guò)菌落數(shù)繪制的生長(zhǎng)曲線圖。
表1供試果斑病(靶標(biāo))菌株
表2供試非果斑病(非靶標(biāo))菌株
改良的ASCM(Acidovorax avenae subsp.citrulli Semiselective Culture Medium)培養(yǎng)基的制備依照白川隆(白川隆，《日本NARO(National Agriculture andBio-oriented Research Organization)報(bào)告》，2003)提供的培養(yǎng)基成分，根據(jù)我國(guó)果斑病菌的特性，經(jīng)過(guò)多次摸索，確定最合適的改良ASCM培養(yǎng)基成分和制作方法為KH2PO40.5gNa2HPO4·12H2O 2.0g(NH4)2SO42.0g己二酸二胺5g酵母浸膏 10gMgSO4·7H2O29mgCaCl251mgNa2MoO4·2H2O25mgBTB(溴麝香草酚藍(lán)) 12.5mg瓊脂 15g加水至1000ml。調(diào)pH為7.0～7.2之間，121℃滅菌20分鐘；冷卻后加入氨芐青霉素 20mg苯氧乙基青霉素 100mg新生霉素 5mg放線菌酮 25mgASCM液體培養(yǎng)基除不含瓊脂外，其他成分與固體培養(yǎng)基相同。
2.果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的免疫學(xué)檢測(cè)參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》(曹澍澤等，北京北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992)、《植病研究方法》(方中達(dá)，北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998)、《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F·奧斯伯等，北京科學(xué)出版社，1998)中的方法進(jìn)行菌體細(xì)胞(去鞭毛)抗原的制備、菌體全蛋白抗原的制備、免疫家兔、測(cè)定血清效價(jià)、抗體專(zhuān)一性(試管凝集法、間接ELISA法)、間接ELISA法測(cè)定抗原的檢測(cè)精度和模擬種子帶菌檢測(cè)精度。
模擬種子帶菌懸液的配制取1000粒健康瓜種子，放入250ml三角瓶中，蓋上棉塞，在121℃下高壓滅菌20分鐘，向其中加入PBS(pH7.4)100ml，室溫下200rpm搖動(dòng)4小時(shí)，移去種子，用種子浸泡液配制成的Pslb-27的3×108CFU/ml菌懸液，以模擬種子帶菌懸液。
3.細(xì)菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的常規(guī)PCR檢測(cè)參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，采用CTAB法提取所有靶標(biāo)及非靶標(biāo)細(xì)菌的染色體DNA。
以2826和7733染色體DNA為模板，引物采用已報(bào)道的16S-23S rDNA ITS的通用(簡(jiǎn)并)引物(Bomeman J，Triplett E W.，Applied and Environmental Microbiology，1997，63(7)2647～2653；Fisher M M，Triplett E W.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(10)4630～4636)，由上海生工生物公司(中國(guó)上海市松江工業(yè)區(qū)茸興路111號(hào))合成。參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(盧圣棟，北京高等教育出版社，1993)進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS。其中Primer1(+)(正向引物)5’TGYACACACCGCCCGT 3’16bp(小亞基rDNA通用序列)Primer1(-)(反向引物)5’GGGTTBCCCCATTCRG 3’16bp(細(xì)菌23SrDNA通用序列)注Y＝C/T，B＝G/T/C，R＝A/G按照天為時(shí)代公司(中國(guó)北京清華大學(xué)學(xué)研大廈B座1115室)提供的PCRFragment Recovery Kit使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。
PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，置于16℃反應(yīng)2～4h后取5μL用于轉(zhuǎn)化。參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備。轉(zhuǎn)化參照Promega公司(277 Granada Drive，San Luis Obispo CA 93401，USA)的《Protocols and Applications Guide》(1996，Promega Corporation)進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。堿裂解法提取重組質(zhì)粒、重組質(zhì)粒的PCR鑒定、重組質(zhì)粒的酶切鑒定、采用Sanger雙脫氧終止法對(duì)經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海市龍吳路1594號(hào))完成。使用ITS通用(簡(jiǎn)并)引物，以2826和7733菌株的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，分別得到長(zhǎng)度為897bp和872bp的片段。經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物的回收、與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109、提取重組質(zhì)粒并檢測(cè)、測(cè)序和拼接，獲得兩個(gè)亞種16S-23S rDNA ITS的全序列。
由于細(xì)菌的ITS區(qū)的DNA核酸序列決定種下分類(lèi)的地位，即用各個(gè)菌株的ITS區(qū)DNA核酸序列可以鑒定和區(qū)分其菌株。根據(jù)Vector NTI v7.0對(duì)食酸菌屬各亞種16S-23SrDNA間ITS序列比對(duì)的結(jié)果，分析2826和7733菌株ITS的編碼功能。運(yùn)用Beacon Designer 2.0和DNA Club等軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)4對(duì)引物，最終經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，確定其中一對(duì)。
Primer1(+)(正向引物)5’gttggaagaattcggtgctacc 3’22bpPrimer1(-)(反向引物)5’attcgtcattactgaatttcaacaag 3’26bp使用所設(shè)計(jì)的果斑病菌引物進(jìn)行引物專(zhuān)一性檢測(cè)，以全部靶標(biāo)菌和非靶標(biāo)菌的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司(中國(guó)上海市松江工業(yè)區(qū)茸興路111號(hào))的Taq DNA Polymerase，選用Mg2+分裝buffer，以50μl體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
使用所設(shè)計(jì)的果斑病菌引物，以菌株P(guān)slb-27的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司的Taq Plus DNA Polymerase及相應(yīng)buffer，以50μl體系進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物的回收、與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株、提取重組質(zhì)粒并檢測(cè)、測(cè)序，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的全序列。通過(guò)Vector NTI進(jìn)行序列比對(duì)及分析，確定PCR產(chǎn)物確為16S-23S rDNA ITS序列，分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株ITS中均含有兩個(gè)tRNA的編碼序列，且編碼的tRNA種類(lèi)相同，分別為識(shí)別和運(yùn)輸異亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)的tRNA。
用無(wú)菌水配制果斑病菌菌株plsb-27的3×108～3×101CFU/ml菌懸液，吸取1ml置于1.5ml離心管中，沸水煮15分鐘。分別取2μl作為菌體PCR的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。確定以PSlb-27進(jìn)行直接菌體PCR，其反應(yīng)呈陽(yáng)性的最小菌濃度。
取1000粒瓜種子，放入250ml三角瓶中，蓋上棉塞，在121℃下高壓滅菌20分鐘，向其中加入用PBS(pH7.4)100ml，室溫下200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)，移去種子，用種子浸泡液配制成Pslb-27的3×108～3×101CFU/ml菌懸液，取1ml分別置于1.5ml離心管中，沸水煮15分鐘，分別吸取2μl作為菌體PCR的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。菌體PCR反應(yīng)的體系和條件與上述PCR反應(yīng)一致。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。確定模擬種子帶菌檢測(cè)的最小菌濃度。
4.免疫吸附PCR(IMS-PCR)檢測(cè)果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)使用MOPS與PBS同時(shí)對(duì)相同的種子浸泡液配置的菌懸液進(jìn)行分離，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。配制果斑病菌菌株P(guān)slb-27的3×105CFU/ml菌懸液，吸取100μl，分別置于100ml PBS(pH7.4)、MOPS分離液和由PBS、MOPS制成的無(wú)菌種子浸泡懸液中，室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)，吸取100ul，涂布KB平面培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落個(gè)數(shù)。
用PBS(pH7.4)洗滌免疫磁珠(IMBs)3～4次，加入3ml PBS重懸磁珠，加入純化的IgG 100μg，于4℃緩慢搖動(dòng)孵育24h。用4ml PBS-BSA洗滌IMBs 3～4次，并將IMBs重懸于3ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最終濃度約為1×107個(gè)/ml。
將1000粒瓜種子滅菌，在無(wú)菌條件下加入100ml PBS中，于室溫150rpm搖動(dòng)培養(yǎng)2h，移去種子，保留懸濁液，用該懸濁液配制105～101CFU/ml的菌懸液各1ml，置于1.5ml離心管中，用于模擬不同濃度的種子帶菌分離液。免疫吸附果斑病菌(IMS)、處理后進(jìn)行菌體PCR、電泳后在凝膠成像儀中檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定檢測(cè)瓜果斑病菌的最小濃度。將Pslb-27菌株及各種非靶標(biāo)菌株分別用無(wú)菌水和MOPS種子浸泡液制成菌懸液，混合后各菌株終濃度約為3×103CFU/ml，進(jìn)行IMS-PCR，電泳檢測(cè)結(jié)果。
5.實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)依據(jù)瓜果斑病菌16S-23S ITS的引物之間的保守序列區(qū)，進(jìn)行探針設(shè)計(jì)(5’ACGCTCTGCGGTAGGGCGAAGAAACC 3’)，如SEQ ID NO2所示。采用Pslb-27的染色體DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，40循環(huán)后檢測(cè)熒光曲線；在專(zhuān)一性測(cè)定中，以2μl煮沸15分鐘的Pslb-27和非靶標(biāo)菌的3×108CFU/ml的菌懸液為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。
采用滅菌的種子浸泡液配制不同濃度的菌懸液，煮沸15分鐘后，吸取2μl溶液作為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。確定檢測(cè)最小濃度。
6.瓜種子帶菌快速檢測(cè)方法的建立帶菌種子抽樣的模擬，將健康瓜種子1000粒置于500ml三角瓶，121℃滅菌20分鐘，商品種子不滅菌，待用。制備Pslb-27 3×108CFU/ml菌懸液，浸泡無(wú)菌正常種子30分鐘，于超凈工作臺(tái)吹干。將不同數(shù)量(滅菌)的種子放入三角瓶中，模擬0/1000，1/1000，5/1000，1/100帶菌種子樣本。模擬0/1000，1/1000商品種子的帶菌樣本。向含有不同帶菌種子樣本的三角瓶中加入MOPS分離液200ml，室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)。吸取培養(yǎng)液1ml，置于100ml ASCM液體選擇性培養(yǎng)基內(nèi)，37℃搖動(dòng)培養(yǎng)8小時(shí)。吸取1ml培養(yǎng)液，置于1.5ml EP管中。加入包被過(guò)的IMBs 50μl，室溫緩慢搖動(dòng)孵育1h，將離心管置于磁性分離架上，靜置5分鐘，吸取上清液，用PBS-BSA洗滌2遍，無(wú)菌水洗滌1遍，用50μl無(wú)菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15分鐘，取2μl上清液用于常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。確定檢測(cè)精度。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明應(yīng)用生物特性分離培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)或?qū)崟r(shí)定量PCR技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌，與單一的種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA的檢測(cè)方法相比，更能夠省時(shí)、省空間、準(zhǔn)確、靈敏，更能建立快速、準(zhǔn)確的種子帶菌檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于對(duì)瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌進(jìn)行快速分子檢測(cè)，可為瓜類(lèi)的安全生產(chǎn)、種子引進(jìn)和外銷(xiāo)提供技術(shù)保障，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為Pslb-27在KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落形態(tài)。
圖2為Pslb-27在ASCM上培養(yǎng)的菌落形態(tài)。
圖3為空白(左)與長(zhǎng)有果斑病菌的ASCM培養(yǎng)基(右)對(duì)比。
圖4為ASCM培養(yǎng)基的選擇性效果測(cè)定。
圖5為細(xì)菌細(xì)胞個(gè)數(shù)在ASCM中培養(yǎng)的變化曲線。
圖6為菌體全蛋白抗原的SDS-PAGE電泳結(jié)果。
其中，道1、2分別代表Aac13；Pslb-27。
圖7為試管凝集法檢測(cè)Pslb-27抗菌體全蛋白血清效價(jià)的結(jié)果。
其中，管1～10管分別代表1∶20；1∶40；1∶80；1∶160；1∶320；1∶640；1∶1280；1∶2560；1∶5120；1∶10240。
圖8為試管凝集法檢測(cè)抗Pslb-27菌體抗原的抗血清的專(zhuān)一性。
其中，管1～12分別代表陰性對(duì)照；Pslb-27陽(yáng)性對(duì)照；Pslb-3；Pslb-16；Aacwl；7500；Pslb-7；Pslb-11；Aac13；Pslb-60；Pslb-51；Pslb-82。
圖9為部分非靶菌的試管凝集陰性反應(yīng)。
其中，管1～9分別代表陰性對(duì)照；Pst47；008；SM-15；141；EccZ4-2；TE-6；Psl-1；Pslb-27陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D10為食酸菌屬非靶標(biāo)菌的假陽(yáng)性試管凝集反應(yīng)。
其中，管1～5分別為陰性對(duì)照；2826；7733；3183；Pslb-27陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D11為試管凝集反應(yīng)中陽(yáng)性與陰性反應(yīng)對(duì)比。
其中，管1～6都為陽(yáng)性反應(yīng)；管7為陰性反應(yīng)。
圖12為部分靶標(biāo)菌與非靶菌間接ELISA檢測(cè)結(jié)果。
其中，A1-E7都為靶標(biāo)菌株；E8、E9、E11、E12都為陰性對(duì)照；E10為Aac13陽(yáng)性對(duì)照；F1-G12為非靶標(biāo)菌，G8、G9、G10分別為2826；3183；7733。
圖13為間接ELISA法對(duì)不同濃度Pslb-27抗原的檢測(cè)結(jié)果。
其中，孔1、2、3、4、5、6、7、8、9分別代表3×108CFU/ml Pslb-27菌懸液；3×107CFU/ml Pslb-27菌懸液；3×106CFU/ml Pslb-27菌懸液；3×105CFU/ml Pslb-27菌懸液；3×104CFU/ml Pslb-27菌懸液；3×103CFU/ml Pslb-27菌懸液；3×102CFU/mlPslb-27菌懸液；3×101CFU/ml Pslb-27菌懸液；空白對(duì)照。
圖14為間接ELISA法進(jìn)行模擬種子帶菌(Pslb-27)檢測(cè)的結(jié)果。
其中，孔1、2、3、4、5、6、7、8、9分別代表Pslb-273×108CFU/ml的純水菌懸液(陽(yáng)性對(duì)照)；200μl模擬種子帶菌懸液；150μl模擬種子帶菌懸液；100μl模擬種子帶菌懸液；50μl模擬種子帶菌懸液；10μl模擬種子帶菌懸液；5μl模擬種子帶菌懸液；1μl模擬種子帶菌懸液；CK。
圖15為部分菌株染色體DNA的電泳圖譜。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8分別代表λDNA/HindIII；Aacl3；Pslb-27；Pslb-10；7500；Pslb-14；Pslb-8；Pslb-30；Pslb-70。
圖16為2826和7733的ITS PCR、重組質(zhì)粒及質(zhì)粒PCR檢測(cè)電泳圖譜。
其中，道M1、1、2、3、4、5、6、7、8、M2分別代表λDNA/Hind III；2826質(zhì)粒；7733質(zhì)粒；2826 ITS PCR；7733ITS PCR；空白對(duì)照；2826質(zhì)粒PCR；7733質(zhì)粒PCR；空白對(duì)照；DNA Marker II(天為時(shí)代)。
圖17以各菌株染色體DNA為模板進(jìn)行PCR的結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分別代表DNA Marker(天為時(shí)代)；Aac13；2826；3183；Pslb-27；7733；Psl-1；7500；B-1；Pslb-31；Pslb-50；CK。
圖18部分靶標(biāo)菌株DNA的PCR反應(yīng)的電泳圖譜。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分別代表DNA Marker；Pslb-9；Pslb-10；Pslb-22；Pslb-25；Pslb-31；Pslb-35；Pslb-47；Pslb-48；Pslb-76；Pslb-84；CK。
圖19重組質(zhì)粒及其酶切、PCR檢測(cè)結(jié)果。
其中，道M1、1、2、3、M2分別代表DNA/Hind III；質(zhì)粒；質(zhì)粒Hind III/EcoR I雙酶切；質(zhì)粒PCR；DNA marker。
圖20 Pslb-27擴(kuò)增序列與國(guó)外報(bào)道Aac對(duì)應(yīng)序列的單核苷酸差異。
圖21擴(kuò)增產(chǎn)物與報(bào)道序列的相似性和復(fù)雜性分析。
圖22濃度梯度菌體PCR結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表DNA marker(天為時(shí)代)；Pslb-27DNA PCR；3×108CFU/ml菌懸液；3×107CFU/ml菌懸液；3×106CFU/ml菌懸液、3×105CFU/ml菌懸液、3×104CFU/ml菌懸液、3×103CFU/ml菌懸液、3×102CFU/ml菌懸液；3×101CFU/ml菌懸液；無(wú)模板對(duì)照。
圖23菌體PCR模擬種子檢測(cè)結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表DNA marker；純水3×108CFU/ml菌懸液；3×108種子浸泡液配制的菌懸液；3×107種子浸泡液配制的菌懸液；3×106種子浸泡液配制的菌懸液；3×105種子浸泡液配制的菌懸液；3×104種子浸泡液配制的菌懸液；3×103種子浸泡液配制的菌懸液；3×102種子浸泡液配制的菌懸液；3×101CFU/ml種子浸泡液配制的菌懸液；無(wú)模板對(duì)照。
圖24MOPS與PBS細(xì)菌分離效果比較。
圖25MOPS與PBS分離效果比較(菌落數(shù))。
其中，左、右分別代表MOPS；PBS。
圖26MOPS與PBS分離種子帶菌的效果比較(菌落數(shù))。
其中，左、右分別代表MOPS；PBS。
圖27IMS-PCR模擬種子帶菌檢測(cè)結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7分別代表DNA Marker(天為時(shí)代)；3×108CFU/ml菌體PCR；3×105CFU/ml模擬種子帶菌懸液；3×104CFU/ml模擬種子帶菌懸液；3×103CFU/ml模擬種子帶菌懸液；3×102CFU/ml模擬種子帶菌懸液；3×101CFU/ml模擬種子帶菌懸液；無(wú)菌種子懸液。
圖28多菌株及種子浸泡液配制的多菌株菌懸液進(jìn)行IMS-PCR的檢測(cè)結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6分別代表DNA marker；Pslb-27的3×103CFU/ml菌懸液；含有Pslb-27及非靶標(biāo)菌株的3×103CFU/ml菌懸液；僅含非靶標(biāo)菌株的3×103CFU/ml菌懸液；含有Pslb-27及非靶標(biāo)菌株的3×103CFU/ml種子浸泡液；僅含非靶標(biāo)菌株的3×103CFU/ml種子浸泡液；無(wú)菌種子浸泡液。
圖29以Pslb-27DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的熒光曲線。
圖30用Pslb-27和非靶標(biāo)菌的3×108CFU/ml的菌懸液進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果。
圖31實(shí)時(shí)定量PCR模擬種子帶菌檢測(cè)。
圖32模擬種子帶菌IMS-PCR電泳結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4分別代表DNA Maker(天為時(shí)代)；10/1000；5/1000；1/1000；CK。
圖33IMS-realtime-PCR檢測(cè)中的熒光曲線。
圖34商品種子帶菌IMS-PCR檢測(cè)電泳結(jié)果。
其中，道M、1、2、3分別代表DNA Marker(天為時(shí)代)；3×108CFU/ml菌懸液；1/1000；未加帶菌種子的CK。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)該說(shuō)明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明只有說(shuō)明作用，而沒(méi)有限制作用。
需特別指出的是，盡管在實(shí)施例中詳盡描述了哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌特異性引物的設(shè)計(jì)、實(shí)時(shí)PCR探針、燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R蘭亞種(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)和蘑芋亞種(Acidovorax avenae subsp.konjaci)的2826菌株、7733菌株16S-23S ITS全序列、哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌的部分16S-23S ITS序列，然而這并不意味本發(fā)明的基因只限于用哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè)。因此，使用本發(fā)明所描述的瓜細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè)技術(shù)(BIO-免疫磁性分離一(實(shí)時(shí)熒光定量)PCR技術(shù)(BIO-IMS-PCR))，檢測(cè)用引物，探針，燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R蘭亞種(Acidovoraxavenae subsp.cattleyae)和蘑芋亞種(Acidovorax avenae subsp.konjaci)的2826菌株、7733菌株16S-23S ITS全序列、哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌的部分16S-23SITS序列及改良ASCM配方，以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具有的任何涉及上述的引物、探針、序列、配方的方法檢測(cè)其他作物病原細(xì)菌和其他方面的應(yīng)用，均包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。由于本發(fā)明是對(duì)果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的檢測(cè)，因此應(yīng)用本發(fā)明對(duì)任何種子帶果斑病菌的檢測(cè)均也包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1.哈密瓜果斑病菌的分離培養(yǎng)檢測(cè)選常規(guī)供試菌株(見(jiàn)以上表1和表2)在KB培養(yǎng)基上活化后在改良的ASCM培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)48小時(shí)，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況。制備果斑病菌株的3×104CFU/ml菌懸液，吸取100μl置于ASCM液體培養(yǎng)基中于37℃，200rpm培養(yǎng)。每3小時(shí)吸取培養(yǎng)液100μl，連續(xù)取10次，涂布于KB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后記錄菌落個(gè)數(shù)。
經(jīng)過(guò)37℃下培養(yǎng)48小時(shí)發(fā)現(xiàn)，哈密瓜果斑病菌在KB培養(yǎng)基上形成的菌落(如圖1所示)和在ASCM上形成的菌落(如圖2所示)在形態(tài)和顏色上有所不同。三個(gè)靶標(biāo)菌株Aac13、Pslb-27和Pslb-4均可長(zhǎng)出大量菌落，且有菌落生長(zhǎng)處的培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍(lán)色，如圖3所示。而所有供試非靶標(biāo)菌株在此培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，如圖4所示。與經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索，改良的ASCM哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌選擇性固體和液體培養(yǎng)基，均可專(zhuān)一性地培養(yǎng)出哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌，而且長(zhǎng)勢(shì)較好，而其它近源或常見(jiàn)菌株在其上不能生長(zhǎng)，初步達(dá)到分離培養(yǎng)的檢測(cè)目的。
通過(guò)取樣、涂布KB平板并在培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)數(shù)菌落個(gè)數(shù)，確定哈密瓜果斑病菌Pslb-27在ASCM液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速率。每次吸取的100μl培養(yǎng)液中所含細(xì)菌個(gè)數(shù)，如表3所示。通過(guò)菌落數(shù)繪制的生長(zhǎng)曲線圖，如圖5所示。測(cè)得了哈密瓜果斑病菌在ASCM培養(yǎng)基中培養(yǎng)初期的生長(zhǎng)曲線，為后繼實(shí)驗(yàn)中確定最佳的培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)菌數(shù)量提供依據(jù)。
表3隨時(shí)間增長(zhǎng)，每100μl培養(yǎng)液內(nèi)所含菌體細(xì)胞個(gè)數(shù)變化

實(shí)施例2.哈密瓜果斑病菌的免疫學(xué)檢測(cè)參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》、《植病研究方法》、《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中的方法進(jìn)行菌體細(xì)胞(去鞭毛)抗原的制備、菌體全蛋白抗原的制備(圖6)、免疫家兔、測(cè)定血清效價(jià)和抗體專(zhuān)一性(試管凝集法、間接ELISA法)、間接ELISA法測(cè)定抗原的檢測(cè)精度和模擬種子帶菌檢測(cè)精度。
模擬種子帶菌懸液的配制取1000粒健康哈密瓜種子，放入250ml三角瓶中，蓋上棉塞，在121℃下高壓滅菌20分鐘，向其中加入PBS(pH7.4)100ml，室溫下200rpm搖動(dòng)4小時(shí)，移去種子，用種子浸泡液配制成的Pslb-27的3×108CFU/ml菌懸液，以模擬種子帶菌懸液。
通過(guò)試管凝集法測(cè)定的Aac13和Pslb-27的菌體細(xì)胞抗原和全蛋白抗原的效價(jià)結(jié)果顯示，均達(dá)到1∶1280，滿足實(shí)驗(yàn)要求。如圖7，為測(cè)定用Pslb-27菌體全蛋白制得的抗血清的效價(jià)。
試管凝集法和間接ELISA法結(jié)果發(fā)現(xiàn)哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌所有菌株均呈陽(yáng)性反應(yīng)，與哈密瓜果斑病菌屬同一種的2826、3183、7733三個(gè)亞種呈現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，其余的非靶標(biāo)菌株均呈陰性。圖8所示為部分哈密瓜果斑病菌與抗血清的試管凝集反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果，圖9顯示了部分非靶標(biāo)菌與血清反應(yīng)的陰性結(jié)果，圖10為2826，3183和7733與血清反應(yīng)的假陽(yáng)性結(jié)果。圖11為陽(yáng)性反應(yīng)與陰性反應(yīng)的結(jié)果比較。圖12間接ELISA法結(jié)果，其對(duì)應(yīng)的OD值如表4所示。
表4間接ELISA檢測(cè)抗體專(zhuān)一性中各樣本的OD值

注A1-E7按照從左至右，從上至下順序，依次為靶標(biāo)菌株；E8、E9、E11、E12為陰性對(duì)照；E10為Aac13陽(yáng)性對(duì)照；F1-G12為非靶標(biāo)菌，其中G8、G9、G10分別為2826、3183和7733。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，間接ELISA法檢測(cè)抗原的最小濃度通過(guò)機(jī)器測(cè)定可達(dá)到約3×105CFU/ml，如圖13所示。但信號(hào)比較微弱，如表5所示。
表5間接ELISA檢測(cè)靶標(biāo)抗原精度中的OD值

注1-8依次為3×108～3×101CFU/ml Pslb-27菌懸液，9為空白對(duì)照。
用間接ELISA模擬種子帶菌檢測(cè)的精度為5μl 3×108CFU/ml細(xì)菌/種子懸液，如圖14所示。其對(duì)應(yīng)OD值如表6所示。
表6間接ELISA模擬種子帶菌檢測(cè)中的OD值

注1-9依次為Pslb-273×108CFU/ml的純水菌懸液(陽(yáng)性對(duì)照)、200μl、150μl、100μl、50μl、10μl、5μl、1μl、陰性CK實(shí)施例3.哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌的常規(guī)PCR檢測(cè)參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，采用CTAB法提取所有靶標(biāo)及非靶標(biāo)細(xì)菌的染色體DNA(圖15為部分菌株染色體DNA)。
以2826和7733染色體DNA為模板，引物采用已報(bào)道的16S-23S rDNA ITS的通用(簡(jiǎn)并)引物(Bomeman，et al.1997)(Fisher，et al.1999)，由上海生工生物公司合成。參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS。
Primer1(+)(正向引物)5’TGYACACACCGCCCGT 3’16bp(小亞基rDNA通用序列)Primer1(-)(反向引物)5’GGGTTBCCCCATTCRG 3’16bp(細(xì)菌23SrDNA通用序列)注Y＝C/T，B＝G/T/C，R＝A/G按照天為時(shí)代公司提供的PCR Fragment Recovery Kit使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，置于16℃反應(yīng)2～4h后取5μl用于轉(zhuǎn)化。參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備。轉(zhuǎn)化參照Promega公司的《Protocols and Applications Guide》(1996，PromegaCorporation)進(jìn)行連接產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。堿裂解法提取重組質(zhì)粒、重組質(zhì)粒的PCR鑒定、重組質(zhì)粒的酶切鑒定、采用Sanger雙脫氧終止法對(duì)經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。使用ITS通用(簡(jiǎn)并)引物，以2826和7733菌株的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR，分別得到長(zhǎng)度為897bp和872bp的片段。經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物的回收、與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109、提取重組質(zhì)粒并檢測(cè)、測(cè)序和拼接，獲得兩個(gè)亞種16S-23SrDNA ITS的全序列。結(jié)果見(jiàn)圖16。分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株ITS中均含有兩個(gè)tRNA的編碼序列，且編碼的tRNA種類(lèi)相同，分別為識(shí)別和運(yùn)輸異亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)的tRNA(表7)。
表7食酸菌各亞種16S-23S rDNA ITS所含tRNA的分布情況

由于細(xì)菌的ITS區(qū)的DNA核酸序列決定種下分類(lèi)的地位，即用各個(gè)菌株的ITS區(qū)DNA核酸序列可以鑒定和區(qū)分其菌株。根據(jù)Vector NTI v7.0對(duì)食酸菌屬各亞種16S-23S rDNA間ITS序列比對(duì)的結(jié)果，運(yùn)用Beacon Designer 2.0和DNA Club等軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)4對(duì)引物，最終經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，確定其中一對(duì)。
Primer1(+)(正向引物)5’gttggaagaattcggtgctacc 3’22bpPrimer1(-)(反向引物)5’attcgtcattactgaatttcaacaag 3’26bp使用所設(shè)計(jì)的果斑病菌引物進(jìn)行引物專(zhuān)一性檢測(cè)，以全部靶標(biāo)菌和非靶標(biāo)菌的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司的Taq DNA Polymerase，選用Mg2+分裝buffer，以50μl體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)過(guò)多次PCR，進(jìn)行反應(yīng)條件和Mg2+濃度的摸索，最終確定退火溫度為60℃，Mg2+濃度為1.5mM。在此反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR，以所有靶標(biāo)菌株染色體DNA為模板的反應(yīng)均成陽(yáng)性，擴(kuò)增產(chǎn)生448bp條帶一條，而全部非靶標(biāo)菌均呈陰性。圖17，圖18為以部分靶標(biāo)和非靶染色體DNA為模板進(jìn)行PCR的電泳結(jié)果。
使用所設(shè)計(jì)的果斑病菌引物，以菌株P(guān)slb-27的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司的Taq Plus DNA Polymerase及相應(yīng)buffer，以50μl體系進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物的回收、與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株、提取重組質(zhì)粒并檢測(cè)(圖19)、測(cè)序，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的全序列。通過(guò)Vector NTI進(jìn)行序列比對(duì)及分析，確定PCR產(chǎn)物確為16S-23S rDNAITS序列。分析還發(fā)現(xiàn)我國(guó)分離的Pslb-27的ITS相應(yīng)序列與國(guó)外報(bào)道的存在3個(gè)單核苷酸多態(tài)性，如圖20和圖21所示。
用無(wú)菌水配制果斑病菌菌株plsb-27的3×108～3×101CFU/ml菌懸液，吸取1ml置于1.5ml離心管中，沸水煮15分鐘。分別取2μl作為菌體PCR的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％ agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，(溴化乙錠)EB染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。確定以PSlb-27進(jìn)行直接菌體PCR，其反應(yīng)呈陽(yáng)性的最小菌濃度約為3×105CFU/ml，如圖22所示。
取1000粒哈密瓜種子，放入250ml三角瓶中，蓋上棉塞，在121℃下高壓滅菌20分鐘，向其中加入用PBS(pH7.4)100ml，室溫下200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)，移去種子，用種子浸泡液配制成Pslb-27的3×108～3×101CFU/ml菌懸液，取1ml分別置于1.5ml離心管中，沸水煮15分鐘，分別吸取2μl作為菌體PCR的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。菌體PCR反應(yīng)的體系和條件與上述PCR反應(yīng)一致。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進(jìn)行電泳，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。發(fā)現(xiàn)模擬種子帶菌檢測(cè)的最小菌濃度依然約為3×105CFU/ml，但信號(hào)較弱，見(jiàn)圖23。
實(shí)施例4.免疫吸附PCR(IMS-PCR)檢測(cè)哈密瓜果斑病菌使用MOPS與PBS同時(shí)對(duì)相同的種子浸泡液配置的菌懸液進(jìn)行分離，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。配制果斑病菌菌株P(guān)slb-27的3×105CFU/ml菌懸液，吸取100μl，分別置于100ml PBS(pH7.4)、MOPS分離液和由PBS、MOPS制成的無(wú)菌種子浸泡懸液中，室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)，吸取100ul，涂布KB平面培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落個(gè)數(shù)。發(fā)現(xiàn)MOPS緩沖液對(duì)果斑病菌的分離效果強(qiáng)于PBS，細(xì)菌個(gè)數(shù)明顯增加，表明果斑病菌可以在MOPS溶液中生長(zhǎng)，如表8和圖24、25、26所示。
表8MOPS與PBS細(xì)菌分離效果比較

注單位CFU/100μl用PBS(pH7.4)洗滌免疫磁珠(IMBs)3～4次，加入3ml PBS重懸磁珠，加入純化的IgG 100μg，于4℃緩慢搖動(dòng)孵育24h。用4ml PBS-BSA洗滌IMBs 3～4次，并將IMBs重懸于3ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最終濃度約為1×107個(gè)/ml。
將1000粒哈密瓜種子滅菌，在無(wú)菌條件下加入100ml PBS中，于室溫150rpm搖動(dòng)培養(yǎng)2h，移去種子，保留懸濁液，用該懸濁液配制105～101CFU/ml的菌懸液各1ml，置于1.5ml離心管中，用于模擬不同濃度的種子帶菌分離液。免疫吸附果斑病菌(IMS)、處理后進(jìn)行菌體PCR、電泳后在凝膠成像儀中檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果顯示檢測(cè)哈密瓜果斑病菌的最小濃度約可達(dá)到3×102CFU/ml，如圖27所示。將Pslb-27菌株及各種非靶標(biāo)菌株分別用無(wú)菌水和MOPS種子浸泡液制成菌懸液，混合后各菌株終濃度約為3×103CFU/ml，進(jìn)行IMS-PCR，電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明對(duì)非靶標(biāo)菌進(jìn)行IMS-PCR均呈陰性，且其存在對(duì)IMS-PCR的結(jié)果沒(méi)有影響。如圖28所示。
實(shí)施例5.實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)哈密瓜果斑病菌依據(jù)哈密瓜果斑病菌16S-23SITS的引物之間的保守序列區(qū)，進(jìn)行探針設(shè)計(jì)(5’ACGCTCTGCGGTAGGGCGAAGAAACC 3’)。采用Pslb-27的染色體DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR；在專(zhuān)一性測(cè)定中，以2μl煮沸15分鐘的Pslb-27和非靶標(biāo)菌的3×108CFU/ml的菌懸液為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以Pslb-27DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，40循環(huán)后檢測(cè)熒光曲線，結(jié)果如圖29所示，表明熒光探針可以正常使用。以煮沸15分鐘后的Pslb-27和各非靶標(biāo)菌3×108CFU/ml的菌懸液2μl為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，結(jié)果顯示，只有Pslb-27呈陽(yáng)性反應(yīng)，而各非靶標(biāo)菌均呈陰性，其熒光曲線如圖30所示。
采用滅菌的種子浸泡液配制不同濃度的菌懸液，煮沸15分鐘后，吸取2μl溶液作為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。其檢測(cè)最小濃度仍約為3×104CFU/ml，但其熒光信號(hào)明顯變?nèi)?，且較不穩(wěn)定。如圖31所示。
實(shí)施例6.哈密瓜種子帶菌快速檢測(cè)方法的建立帶菌種子抽樣的模擬，將健康哈密瓜種子1000粒置于500ml三角瓶，121℃滅菌20分鐘，商品種子不滅菌，待用。制備Pslb-273×108CFU/ml菌懸液，浸泡無(wú)菌正常種子30分鐘，于超凈工作臺(tái)吹干。將不同數(shù)量的種子放入三角瓶中，模擬0/1000，1/1000，5/1000，1/100帶菌種子樣本。模擬0/1000，1/1000商品種子帶菌樣本。向含有不同帶菌種子樣本的三角瓶中加入MOPS分離液200ml，室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)。吸取培養(yǎng)液1ml，置于100ml ASCM液體選擇性培養(yǎng)基內(nèi)，37℃搖動(dòng)培養(yǎng)8小時(shí)。吸取1ml培養(yǎng)液，置于1.5ml EP管中。加入包被過(guò)的IMBs 50μl，室溫緩慢搖動(dòng)孵育1h，將離心管置于磁性分離架上，靜置5分鐘，吸取上清液，用PBS-BSA洗滌2遍，無(wú)菌水洗滌1遍，用50μl無(wú)菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15分鐘，取2μl上清液用于常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。經(jīng)過(guò)分離、培養(yǎng)、IMS-PCR，發(fā)現(xiàn)每千粒種子中含有的一粒病種子仍可以檢測(cè)到(見(jiàn)圖32)。經(jīng)過(guò)分離、培養(yǎng)、IMS-realtime-PCR，仍可檢測(cè)出每千粒種子中含有的一粒病種子，即1粒帶菌種子/1000粒仍呈陽(yáng)性反應(yīng)，結(jié)果如圖33所示。經(jīng)過(guò)分離、培養(yǎng)、IMS-PCR，發(fā)現(xiàn)每千粒商品種子中含有的一粒病種子仍可以檢測(cè)到(見(jiàn)圖34)。
附本發(fā)明所涉及的核苷酸序列SEQ ID NO1(哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌檢測(cè)用引物)正向引物(22bp)5’gttggaagaa ttcggtgcta cc 3’反向引物(26bp)5’attcgtcatt actgaatttc aacaag 3’
SEQID NO2(哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌檢測(cè)用探針，26bp)5’acgctctgcg gtagggcgaa gaaacc 3’SEQID NO 3(2826菌株16s-23s ITS全序列)tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagc gggttctgcc agaagtaggt agcctaaccg 60taaggagggc gcttaccacg gcagggttcg tgactggggt gaagtcataa caaggtagcc 120gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctggaaaa cagcattcaa tattgaacgc 180ccacacttat cggttgttgg aagagtcggt gctaaccgac atgggtctgt agctcagctg 240gttagagcac cgtcttgata aggcgggggt cgttggttcg agcccaacta gacccaccaa 300atcttccgaa cataagatgc gaggatcagt gggggattag ctcagctggg agagcacctg 360ctttgcaagc agggggtcgt cggttcgatc ccgtcatcct ccaccaaacg atatgctccg 420cggtagggcg aagaaactaa caccaaagcg gcttcgcaag aggcctcttt gttgttggtc 480cggtatagac cgggtcaatc ggctgttctt taaaaattca tagagtcgaa tcagcgttgc 540cggcggaaag caggaaactg caccgtgccg tcggcaacaa taatttgatt gcgtcaaaac 600gaatgttcaa ttgagcgaaa gctgattgaa attcagtaat gacgaattgt tctcgaggta 660gcaataccga agaagaattc acattacggc ataacgcgcg aggtgaaaga cctcgcaagt 720ccttgaaaga aagcggagat gtctcgcaag agatgtcaaa gttatagggt caagtgacta 780agagcatgtg gtggatgcct tggcgatgat aggcgacgaa agacgtgata gcctgcgata 840agcttcgggg agctggcaaa taagctttga tccggagatt tctgaatggg gaaaccc897SEQ ID NO 4(7733菌株16s-23s ITS全序列)tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagc gggttctgcc agaagtaggt agcctaaccg 60taaggagggc gcttaccacg gcagggttcg tgactggggt gaagtcataa caaggtagcc 120gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctggaaga cagcattcaa tattgaacgc 180ccacacttat cggttgttgg aagaagtcgg tgcaaccgac atgggtctgt agctcagctg 240
gttagagcac cgtcttgata aggcgggggt cgttggttcg agcccaacta gacccaccaa300atacttccaa acatcagata cggggaatga agggggatta gctcagctgg gagagcacct360gctttgcaag cagggggtcg tcggttcgat cccgtcatcc tccaccaaac aattgaagat420agaaatcaac accaaagagg ctttgtaaaa ggcttctttg ttgttgaccg gtattgaccg480gatcaatcgg ctgttcttta aaaattcata gagtcgaatc agcgttgtcg gcggaaagca540ggaaactgca ccgtgccgcc gacaactaat ttgattgcgt caaaacgaat taaggctttg600ctttatttca agtaatgacg aattgttctc gaggtagcga taccgaagaa acattcacat660tacggcttaa cgcgcgaggt gaaagacctc gcaagtcctt gaagtaaacg gagatatttc 720gcaagagatg tcaaagttat agggtcaagt gactaagagc atgtggtgga tgccttggcg780atgataggcg aagaaagacg tgatagcctg cgataagctt cggggagctg gcaaacaagc840tttgatccgg agatttctga atggggaaac cc 872sEQ ID NO 5(哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌ITs區(qū)部分序列)ggaagaattc ggtgctaccc gacatgggtc tgtagctcag ctggttagag caccgtcttg60ataaggcggg ggtcgttggt tcgagcccaa ctagacccac caaatcttcc gaacataaga120tgcgaggatc agtgggggat tagctcagct gggagagcac ctgctttgca agcagggggt180cgtcggttcg atcccgtcat cctccaccaa ccaatacgct ctgcggtagg gcgaagaaac240caacaccaaa gcggcttcgc gagaggcctc tttgttgttg gtccggtata gaccggatca300atcggctgtt ctttaaaaat tcatagagtc gaatcagcgt tgccggcgga aagcaggaaa360ctgcaccgtg ccgccggtga caaaaatttg attgcgtcaa aacgaatatt caattgagcg420aaagcttgtt gaaattcagt aatgacga 448
權(quán)利要求
1.一種瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)的方法，其特征是該方法結(jié)合了如下步驟①應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行富集、篩選和分離；②應(yīng)用免疫吸附磁性分離技術(shù)進(jìn)行免疫富集；③應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的選擇性培養(yǎng)基是改良的ASCM培養(yǎng)基，其組成配方和配制過(guò)程為KH2PO40.5gNa2HPO4·12H2O 2.0g(NH4)2SO42.0g己二酸二胺 5g酵母浸膏 10gMgSO4·7H2O 29mgCaCl251mgNa2MoO4·2H2O 25mgBTB(溴麝香草酚藍(lán))12.5mg瓊脂 15g(液體ASCM培養(yǎng)基不含瓊脂)加水至1000ml，調(diào)pH為7.0～7.2之間，121℃滅菌20分鐘；冷卻后加入氨芐青霉素 20mg苯氧乙基青霉素 100mg新生霉素 5mg放線菌酮 25mg。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的應(yīng)用PCR技術(shù)是在PCR中應(yīng)用具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的一對(duì)引物序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的應(yīng)用PCR技術(shù)是在實(shí)時(shí)熒光PCR中應(yīng)用具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的探針。
5.一種來(lái)自哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌ITS區(qū)的DNA序列，其特征是該序列具有SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的應(yīng)用PCR技術(shù)是在PCR中應(yīng)用權(quán)利要求5的DNA序列。
7.一種來(lái)自燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R蘭亞種的決定其分類(lèi)地位的且含有編碼兩個(gè)分別識(shí)別和運(yùn)輸異亮氨酸和丙氨酸的tRNA的序列的16S-23S ITS DNA序列，其特征是該序列具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。
8.一種來(lái)自燕麥?zhǔn)乘峋⒂髞喎N的決定其分類(lèi)地位的且含有編碼兩個(gè)分別識(shí)別和運(yùn)輸異亮氨酸和丙氨酸的tRNA的序列的16S-23S ITS DNA序列，其特征是該序列具有SEQ IDNO 4所示的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的應(yīng)用PCR技術(shù)是應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)并在其中涉及權(quán)利要求5、7和8的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明為“一種瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)的方法”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的瓜類(lèi)種子帶細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)的方法，其特征是該方法應(yīng)用改良的ASCM選擇性培養(yǎng)基富集分離、免疫吸附磁性分離和(實(shí)時(shí)熒光)PCR相結(jié)合的方法，從而提高了靈敏度和準(zhǔn)確性并且快速。還涉及改良的ASCM培養(yǎng)基配方、PCR引物序列、實(shí)時(shí)定量PCR的探針、哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)ITS區(qū)部分序列、燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R蘭亞種(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)和麥?zhǔn)乘峋⒂髞喎N(Acidovorax avenae subsp.konjaci)16S－23S ITS全序列。本發(fā)明在哈密瓜等瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病防治和種子帶菌檢測(cè)方面，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1712538SQ200410009268
公開(kāi)日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者趙廷昌, 回文廣, 孫福在, 王建榮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)建設(shè)第六師科學(xué)技術(shù)委員會(huì)