專(zhuān)利名稱(chēng)：快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，主要是針對(duì)西瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli (Schaad) Willems et al. 1992，Aac)快速定量檢測(cè)的蛋白芯片。
背景技術(shù)：
西瓜果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon)是嚴(yán)重危害西瓜、甜瓜等葫蘆科植物生產(chǎn)的病害。西瓜果斑病菌學(xué)名燕麥?zhǔn)伤峋鞴蟻喎N，是引起果斑病的特異性病原，該病菌是植物保護(hù)領(lǐng)域一種重要的檢疫性病害。西瓜果斑病最早于1965年由狗油和Goth首先報(bào)道，但一直未引起重視，直至 1989年，該病害在美國(guó)佛羅里達(dá)州、印第安納州等地區(qū)普遍發(fā)生，使發(fā)病區(qū)高達(dá)80%的西瓜不能上市銷(xiāo)售，導(dǎo)致當(dāng)?shù)匚鞴辖?jīng)濟(jì)損失慘重，才引起人們對(duì)該病的高度重視。我國(guó)自1986 年開(kāi)始，就不斷有疑似西瓜果斑病爆發(fā)的報(bào)道，但一直沒(méi)有確定的病原菌鑒定報(bào)告，直到 1998年，張榮意對(duì)海南樂(lè)東、東方兩縣采集的3個(gè)菌株進(jìn)行鑒定，首次確認(rèn)了西瓜果斑病菌。近些年，該病在我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古等哈密瓜、西瓜的主產(chǎn)地發(fā)病嚴(yán)重，記錄發(fā)病率最高達(dá) 70%-90%，給當(dāng)?shù)毓r(nóng)造成巨大損失。西瓜果斑病菌在分類(lèi)學(xué)上屬假單胞菌科噬酸菌屬，西瓜感染該菌后，主要在子葉、 真葉和果實(shí)期發(fā)病。西瓜子葉感染該病后，先出現(xiàn)暗棕色病斑，并沿主脈逐漸發(fā)展為黑褐色壞死斑。病菌侵染真葉后，形成周?chē)悬S色暈圈的暗棕色病斑。植株生長(zhǎng)中期，病征通常不顯著，當(dāng)田間濕度較大時(shí)，沿葉脈可觀察到水浸狀的斑點(diǎn)，病葉很少脫落。果實(shí)期，開(kāi)花后 2-3周的果實(shí)最容易感染，果實(shí)染病后，首先在果皮上出現(xiàn)幾毫米大小的水漬狀病斑，隨后迅速擴(kuò)展成幾厘米的橄欖色大型斑塊，斑塊邊緣不規(guī)則，并不斷擴(kuò)展，一周左右便可布滿接觸地面的整個(gè)果實(shí)表面。該病發(fā)病初期病變只限于果皮，內(nèi)部果肉組織依然正常。發(fā)病中期后，病菌蔓延到果肉，使果肉呈水漬狀。發(fā)病后期，由于早期在果皮形成的病斑老化導(dǎo)致表皮龜裂，使果實(shí)因同時(shí)感染雜菌而迅速腐爛。西瓜果斑病菌可在種子和土壤表面的病殘?bào)w上越冬，進(jìn)而成為來(lái)年的初浸染源。病害主要依靠帶菌種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。帶菌種子萌發(fā)后病菌又可感染子葉和真葉，引起幼苗發(fā)病。故而，在種子進(jìn)出口貿(mào)易中，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和清除帶菌種子，對(duì)遏制病害的傳播顯得尤為重要。目前，對(duì)西瓜果斑病菌的檢測(cè)主要有種子培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、ELISA和基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)方法(Direct-PCR、免疫-PCR、Bio-PCR等)。種子培養(yǎng)法需在溫室中進(jìn)行，全過(guò)程約需3周時(shí)間，耗時(shí)費(fèi)力且易漏檢無(wú)明顯病征的帶菌種子。分離培養(yǎng)和ELISA法也都具有與種子培養(yǎng)法類(lèi)似的缺陷?；赑CR的分子生物學(xué)方法可比較快速的檢測(cè)病菌，但檢測(cè)結(jié)果易受種子成分的抑制而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。蛋白芯片是近些年新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，主要是利用抗原/抗體等可特異性結(jié)合的原理制備而成。蛋白芯片誕生初期主要被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，隨后被逐漸推廣至生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，而將蛋白芯片用于植物病原的快速檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外目前仍未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。蛋白芯片用于植物病原的快速檢測(cè)，具有節(jié)約時(shí)間、節(jié)省抗體、靈敏度高、重復(fù)性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果既可用肉眼直接判定，也可通過(guò)分析灰度后作定量檢測(cè)，應(yīng)用前景極其廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，提供一種可快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片方法。本發(fā)明可有效彌補(bǔ)現(xiàn)行植物病原檢測(cè)方法普遍存在的周期長(zhǎng)、不能作定量檢測(cè)的缺點(diǎn)，為西瓜果斑病菌的定量檢測(cè)提供一種快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的新方法，為植物病原檢測(cè)開(kāi)創(chuàng)一種新思路。本發(fā)明還提供了一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制備方法和檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其主要特點(diǎn)在于是在芯片基片上固定至少一種西瓜果斑病菌捕獲抗體的生物 芯片。所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，所述基片上還固定有酶標(biāo)記的 IgG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照、點(diǎn)樣緩沖液作為陰性對(duì)照；所述基片為硝酸纖維素膜(NC)。所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，所述酶標(biāo)記的IgG是堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG，作為蛋白芯片質(zhì)量控制的陽(yáng)性對(duì)照固定于芯片
基上ο一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制備方法，其主要特點(diǎn)在于包括以下步驟
a.基片預(yù)處理基片使用前需以ddH20浸泡，并晾干恒定；所述的浸泡時(shí)間至少 15min，優(yōu)選30min ；所述的晾干溫度為15-37° C，優(yōu)選25° C ；
b.芯片的點(diǎn)樣制備以點(diǎn)樣緩沖液稀釋捕獲抗體，同時(shí)取酶標(biāo)記的IgG和點(diǎn)樣緩沖液分別作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，點(diǎn)樣并固定；所述的點(diǎn)樣緩沖液為0. 001-0. 5mol/L、pH值為7. 0-10. 0的碳酸鹽緩沖液，優(yōu)選0. 05 mol/L, pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液為 Na2CO3 1. 59 g, NaHCO3 2. 93 g, NaN3 0. 2 g, ddH20 1000 mL ；所述的捕獲抗體濃度為 20-80mg/L，優(yōu)選80 mg/L ；所述的點(diǎn)樣體積為0. 01-0. !3uL，優(yōu)選0. 2 uL ；所述的固定條件為 15-37° C，干燥固定 15-60min，優(yōu)選 37° C，20min。一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，其主要特點(diǎn)在于包括以下步驟
(1)繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線液體培養(yǎng)西瓜果斑病菌，無(wú)菌CldH2O梯度稀釋后，以平板計(jì)數(shù)法獲取菌懸液濃度；將梯度菌懸液分別與蛋白芯片雜交，洗滌液洗滌后，加入檢測(cè)抗體反應(yīng)，再與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)，最后以ddH20洗滌終止顯色；平板掃描儀獲取芯片結(jié)果進(jìn)行灰度分析，利用陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)灰度值校正各芯片檢測(cè)信號(hào)，繪制檢測(cè)信號(hào)灰度值與菌液濃度間的散點(diǎn)圖，擬合線性方程，得到定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)檢測(cè)實(shí)際樣品將待檢植物樣品研磨后與提取緩沖液配制樣品液，蛋白芯片孵育雜交，再與檢測(cè)抗體、相應(yīng)顯色底物分別反應(yīng)，利用肉眼判定或掃描儀掃描分析灰度，將檢測(cè)灰度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，便可定量得出樣品中目標(biāo)菌量。所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，所述步驟(1)中檢測(cè)抗體的稀釋液為含0. 01-2. 0% BSA和0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選含0. 2% BSA和0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選含0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述顯色底物為，與堿性磷酸酶相對(duì)應(yīng)的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物。所述步驟(1)中的本發(fā)明提供的西瓜果斑病菌蛋白芯片檢測(cè)方法，主要原理是將可特異性結(jié)合西瓜果斑病菌的捕獲抗體按陣列排布固定于芯片基片表面，芯片與樣品液孵育雜交后，樣品中的西瓜果斑病菌被芯片表面的特異性抗體捕獲結(jié)合，進(jìn)一步與酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體反應(yīng)，芯片表面將形成特異性的捕獲抗體-病原菌-檢測(cè)抗體的復(fù)合體，最后檢測(cè)抗體標(biāo)記物相應(yīng)的顯色底物反應(yīng)，芯片表面便呈現(xiàn)特定的檢測(cè)信號(hào)。所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的試劑盒，其主要特點(diǎn)在于包括有權(quán)利要求1至3所述的蛋白芯片；還包括有檢測(cè)抗體原液，抗體稀釋液，洗滌液和顯色試劑所述抗體稀釋液為含0. 01-2. 0% BSA和0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選含 0. 2% BSA和0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選含0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述顯色底物為，與堿性磷酸酶相對(duì)應(yīng)的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將西瓜果斑病菌特異性捕獲抗體固定于蛋白芯片基片上，與被檢測(cè)樣品反應(yīng)后，樣品中可能存在的西瓜果斑病菌被相應(yīng)的特異性抗體捕獲結(jié)合至芯片表面，進(jìn)一步結(jié)合檢測(cè)抗體后，形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體”雙抗體夾心結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，最后利用檢測(cè)抗體上標(biāo)記物相應(yīng)的顯色底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)西瓜果斑病菌的快速定量檢測(cè)。本發(fā)明具有特異性好、經(jīng)濟(jì)、快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)傳統(tǒng)ELISA法，本發(fā)明以1/12的捕獲抗體用量，1/8的檢測(cè)時(shí)間，達(dá)到與ELISA同等的檢測(cè)能力。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果可長(zhǎng)期保存，經(jīng)簡(jiǎn)化后的可視化檢測(cè)芯片可用于種植一線的快速自檢，具良好的推廣前景。


圖1蛋白芯片點(diǎn)樣示意圖2蛋白芯片特異性驗(yàn)證結(jié)果； 圖3蛋白芯片重復(fù)性測(cè)試結(jié)果；
圖4蛋白芯片和ELISA對(duì)連續(xù)稀釋的種子樣品液檢測(cè)結(jié)果對(duì)比； 圖5蛋白芯片對(duì)種子樣品篩查的陽(yáng)性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 如圖1所示，一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，是在芯片基片上固定至少一種西瓜果斑病菌捕獲抗體D的生物芯片。上述基片上還固定有酶標(biāo)記的 IgG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照P、點(diǎn)樣緩沖液作為陰性對(duì)照N;所述基片為硝酸纖維素膜(NC)。所述酶標(biāo)記的IgG是堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG，作為蛋白芯片質(zhì)量控制的陽(yáng)性對(duì)照固定于芯片基上。見(jiàn)圖1，在基片上自左向右按陽(yáng)性對(duì)照P、陰性對(duì)照N、捕獲抗體D的順序，每點(diǎn)0. 2 μ L依次點(diǎn)樣，其中陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各4個(gè)重復(fù)，捕獲抗體8個(gè)重復(fù)。實(shí)施例2 —種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制備方法，包括以下步驟
a.基片預(yù)處理基片使用前需以ddH20浸泡，并晾干恒定；所述的浸泡時(shí)間至少 15min，優(yōu)選30min ；所述的晾干溫度為15-37° C，優(yōu)選25° C ；
b.芯片的點(diǎn)樣制備以點(diǎn)樣緩沖液稀釋捕獲抗體，同時(shí)取酶標(biāo)記的IgG和點(diǎn)樣緩沖液分別作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，按設(shè)計(jì)圖點(diǎn)樣并固定；所述的點(diǎn)樣緩沖液為0. 001-0. 5mol/ L、pH值為7. 0-10. 0的碳酸鹽緩沖液，優(yōu)選0. 05 mol/L，pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液為 Na2CO3 1. 59 g, NaHCO3 2. 93 g, NaN3 0. 2 g, ddH20 1000 mL ；所述的捕獲抗體濃度為20-80mg/L，優(yōu)選80 mg/L ；所述的點(diǎn)樣體積為0. 01-0. ;3uL，優(yōu)選0. 2 uL ；所述的固定條件為 15-37° C，干燥固定 15-60min，優(yōu)選 37° C，20min。實(shí)施例3 西瓜果斑病菌蛋白芯片的制備
將硝酸纖維素膜基片用ddH20浸泡30 min, 25° C干燥30 min。以0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體至80mg/L，同時(shí)以堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG為陽(yáng)性對(duì)照，碳酸鹽緩沖液為陰性對(duì)照。見(jiàn)圖1，在基片上自左向右按陽(yáng)性對(duì)照P、陰性對(duì)照N、捕獲抗體D的順序，每點(diǎn)0. 2 μ L依次點(diǎn)樣，其中陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各4個(gè)重復(fù)，捕獲抗體8個(gè)重復(fù)。點(diǎn)樣后將基片置于濕盒中，37°C固定20 min，4°C保存?zhèn)溆?。所用的捕獲抗體和檢測(cè)抗體購(gòu)自Agdia公司，貨號(hào) SRA 14800。實(shí)施例4:一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線液體培養(yǎng)西瓜果斑病菌，無(wú)菌ddH20梯度稀釋后，以平板計(jì)數(shù)法獲取菌懸液濃度；將梯度菌懸液分別與蛋白芯片雜交，洗滌液洗滌后，加入檢測(cè)抗體反應(yīng)，再與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)，最后以ddH20洗滌終止顯色；平板掃描儀獲取芯片結(jié)果進(jìn)行灰度分析，利用陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)灰度值校正各芯片檢測(cè)信號(hào)，即利用陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)灰度值對(duì)各芯片信號(hào)進(jìn)行“片間校正”處理，繪制檢測(cè)信號(hào)灰度值與菌液濃度間的散點(diǎn)圖，擬合線性方程，得到定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述“片間校正”，默認(rèn)各蛋白芯片陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)最終灰度值一致，檢測(cè)點(diǎn)灰度校正值=檢測(cè)點(diǎn)灰度實(shí)測(cè)值X(陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)灰度值/一定值)；
(2)檢測(cè)實(shí)際樣品將待檢植物樣品研磨后與提取緩沖液配制樣品液，蛋白芯片孵育雜交，再與檢測(cè)抗體、相應(yīng)顯色底物分別反應(yīng)，利用肉眼判定或掃描儀掃描分析灰度，將檢測(cè)灰度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，便可定量得出樣品中目標(biāo)菌量。所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，所述步驟(1)中的 “片間校正”，默認(rèn)各蛋白芯片陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)最終灰度值一致，檢測(cè)點(diǎn)灰度校正值=檢測(cè)點(diǎn)灰度實(shí)測(cè)值X(陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)灰度值/某一定值)。所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，所述步驟(1)中檢測(cè)抗體的稀釋液為含0. 01-2. 0% BSA和0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選含0. 2% BSA和0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選含0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述顯色底物為，與堿性磷酸酶相對(duì)應(yīng)的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物。5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物，購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)PA111。
所述步驟(1)中的本發(fā)明提供的西瓜果斑病菌蛋白芯片檢測(cè)方法，主要原理是將可特異性結(jié)合西瓜果斑病菌的捕獲抗體按陣列排布固定于芯片基片表面，芯片與樣品液孵育雜交后，樣品中的西瓜果斑病菌被芯片表面的特異性抗體捕獲結(jié)合，進(jìn)一步與酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體反應(yīng)，芯片表面將形成特異性的捕獲抗體-病原菌-檢測(cè)抗體的復(fù)合體，最后檢測(cè)抗體標(biāo)記物相應(yīng)的顯色底物反應(yīng)，芯片表面便呈現(xiàn)特定的檢測(cè)信號(hào)。實(shí)施例5 所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的試劑盒，在盒體內(nèi)包括有實(shí)施例1至3所述的蛋白芯片，3片；可特異性結(jié)合西瓜果斑病菌的堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體原液，1管；抗體稀釋液為含0. 01-2. 0% BSA, 0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，1管；洗滌液為含0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，1管；所述顯色底物為，與堿性磷酸酶相對(duì)應(yīng)的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物，1管。實(shí)施例6 蛋白芯片檢測(cè)特異性驗(yàn)證
(1)以西瓜果斑病菌(^cit/orarar a陽(yáng)subsp. citrulli, Aac)、黃瓜花葉病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、小西葫聲花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)、南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus, SqMV)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)液及 PBS (NaCl 8.0 g, Na2HPO4. 2H20 1. 15 g, KH2PO4 0.2 g, KCl 0.2 g, ddH20 1000 mL, pH 7.2-7.4)各 300 μ L，室溫下與蛋白芯片振蕩(60 r/min)反應(yīng) 45 min ；
(2)以PBST (0. 01mol/L PBS + 0. 05% Tween-20)振蕩(100 r/min)洗滌 1 min，重復(fù) 3次；
(3)用PBST(含0. BSA)按200:1稀釋檢測(cè)抗體，加于芯片表面，室溫下繼續(xù)振蕩反應(yīng)45 min，洗滌；
(4)加入適量的BCIP/NBT顯色底物避光反應(yīng)15min，SddH2O(蒸餾水或自來(lái)水)洗滌終止反應(yīng)，晾干分析結(jié)果。結(jié)果如圖2所示蛋白芯片對(duì)可感染西瓜等葫蘆科植物的4種病原(CMV、WMV、 ZYMV、SqMV)及PBS的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，只有陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)顯色，陰性對(duì)照和檢測(cè)點(diǎn)均無(wú)明顯顯色； 而在對(duì)西瓜果斑病菌陽(yáng)性液的檢測(cè)中，陽(yáng)性對(duì)照顯色、陰性對(duì)照不顯色，檢測(cè)點(diǎn)有明顯的陽(yáng)性結(jié)果，顯示本發(fā)明提供的蛋白芯片對(duì)西瓜果斑病菌良好的檢測(cè)特異性。實(shí)施例7 蛋白芯片檢測(cè)重復(fù)性測(cè)試
(1)將一份西瓜果斑病菌陽(yáng)性種子提取液分成3等份，分別與3組蛋白芯片振蕩反應(yīng) 45 min ；
(2)以PBST (0. 01mol/L PBS + 0. 05% Tween-20)振蕩(100 r/min)洗滌 1 min，重復(fù) 3次；
(3)用PBST(含0. BSA)按200:1稀釋檢測(cè)抗體，加于芯片表面，室溫下繼續(xù)振蕩反應(yīng)45min，洗滌；
(4)加入適量的BCIP/NBT顯色底物避光反應(yīng)15min，SddH2O(蒸餾水或自來(lái)水)洗滌終止反應(yīng)，晾干分析結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，蛋白芯片對(duì)西瓜果斑病菌陽(yáng)性種子提取液的檢測(cè)，3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果基本一致，顯示本發(fā)明提供的蛋白芯片具有較好的檢測(cè)重復(fù)性。實(shí)施例8 蛋白芯片檢測(cè)靈敏度測(cè)試取本實(shí)驗(yàn)室保存的西瓜果斑病菌陽(yáng)性種子提取液，PBS 10倍梯度稀釋?zhuān)魅?00 μ L， 參照實(shí)施例4操作步驟反應(yīng)。同時(shí)按照ELISA檢測(cè)試劑盒推薦流程，同步檢測(cè)上述陽(yáng)性種子梯度稀釋液，對(duì)比兩種方法對(duì)西瓜果斑病菌的檢測(cè)靈敏度差異。結(jié)果如圖4所示，以蛋白芯片檢測(cè)點(diǎn)灰度值、ELISA反應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，與4個(gè)梯度的種子樣品液(1(^10^10^10-3)繪制雙Y軸直方圖，對(duì)比本發(fā)明建立的蛋白芯片檢測(cè)方法與ELISA法對(duì)樣品的檢測(cè)靈敏度差異。兩種方法對(duì)100倍(10_2)稀釋的種子提取液檢測(cè)，都有明顯的陽(yáng)性結(jié)果，而在對(duì)1000倍(10_3)稀釋的種子提取液檢測(cè)，都無(wú)明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明建立的蛋白芯片方法對(duì)西瓜果斑病菌的檢測(cè)，與傳統(tǒng)ELISA具有幾乎等同的檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例9 進(jìn)出口種子樣品的蛋白芯片檢測(cè)試驗(yàn)
收集本實(shí)驗(yàn)室保存的60批葫蘆科植物種子樣品(西瓜、甜瓜、南瓜、西葫蘆等)，各隨機(jī)挑取20粒，在已滅菌的研缽中研碎。種子粉末與提取緩沖液(聚乙烯吡咯烷酮漏 24000-40000 20. 0 g, Na2SO3 1.3 g, NaN3 0.2 g,卵清蛋白 2.0 g, Tween-20 20. 0 g, PBST IOOOmL, pH 7.4)按1:10 (1 g種子粉末10 mL提取緩沖液)配制種子樣品液。以蛋白芯片和ELISA兩種方法，同時(shí)檢測(cè)此60份種子樣品提取液，對(duì)比兩種方法對(duì)西瓜果斑病菌帶菌種子的篩查能力。結(jié)果如圖5所示，蛋白芯片對(duì)60份種子樣品共檢出7個(gè)陽(yáng)性，這與ELISA的篩查結(jié)果一致，并且兩種方法所檢出的7份陽(yáng)性樣品編號(hào)完全吻合，顯示本發(fā)明提供的蛋白芯片檢測(cè)方法對(duì)種子樣品具有與傳統(tǒng)ELISA同等的篩查能力。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于是在芯片基片上固定至少一種西瓜果斑病菌捕獲抗體的生物芯片。
2.如權(quán)利要求1所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于所述基片上還固定有酶標(biāo)記的IgG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照、點(diǎn)樣緩沖液作為陰性對(duì)照；所述基片為硝酸纖維素膜。
3.如權(quán)利要求1或2所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于所述酶標(biāo)記的IgG是堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG，作為蛋白芯片質(zhì)量控制的陽(yáng)性對(duì)照固定于芯片基上ο
4.一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制備方法，其特征在于包括以下步驟a.基片預(yù)處理基片使用前需以ddH20浸泡，并晾干恒定；所述的浸泡時(shí)間至少 15min，優(yōu)選30min ；所述的晾干溫度為15-37° C，優(yōu)選25° C ；b.芯片的點(diǎn)樣制備以點(diǎn)樣緩沖液稀釋捕獲抗體，同時(shí)取酶標(biāo)記的IgG和點(diǎn)樣緩沖液分別作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，點(diǎn)樣并固定；所述的點(diǎn)樣緩沖液為0. 001-0. 5mol/L、pH值為7. 0-10. 0的碳酸鹽緩沖液，優(yōu)選0. 05 mol/L, pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液為 Na2CO3 1. 59 g, NaHCO3 2. 93 g, NaN3 0. 2 g, ddH20 1000 mL ；所述的捕獲抗體濃度為 20-80mg/L，優(yōu)選80 mg/L ；所述的點(diǎn)樣體積為0. 01-0. !3uL，優(yōu)選0. 2 uL ；所述的固定條件為 15-37° C，干燥固定 15-60min，優(yōu)選 37° C，20min。
5.一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線液體培養(yǎng)西瓜果斑病菌，無(wú)菌ddH20梯度稀釋后，以平板計(jì)數(shù)法獲取菌懸液濃度；將梯度菌懸液分別與蛋白芯片雜交，洗滌液洗滌后，加入檢測(cè)抗體反應(yīng)，再與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)，最后以ddH20洗滌終止顯色；平板掃描儀獲取芯片結(jié)果進(jìn)行灰度分析，利用陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)灰度值校正各芯片檢測(cè)信號(hào)，繪制檢測(cè)信號(hào)灰度值與菌液濃度間的散點(diǎn)圖，擬合線性方程，得到定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)檢測(cè)實(shí)際樣品將待檢植物樣品研磨后與提取緩沖液配制樣品液，蛋白芯片孵育雜交，再與檢測(cè)抗體、相應(yīng)顯色底物分別反應(yīng)，利用肉眼判定或掃描儀掃描分析灰度，將檢測(cè)灰度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，便可定量得出樣品中目標(biāo)菌量。
6.如權(quán)利要求5所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)中檢測(cè)抗體的稀釋液為含0. 01-2. 0% BSA和0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述顯色底物為，與堿性磷酸酶相對(duì)應(yīng)的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物。
7.如權(quán)利要求5所述的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)中檢測(cè)抗體的稀釋液為含0. 2% BSA和0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液； 所述洗滌液為含0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
8.一種快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片的試劑盒，其特征在于包括有權(quán)利要求1至3所述的蛋白芯片；還包括有檢測(cè)抗體原液，抗體稀釋液，洗滌液和顯色試劑 所述抗體稀釋液為含0. 01-2. 0% BSA和0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含0. 01-2. 0%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述顯色底物為，與堿性磷酸酶相對(duì)應(yīng)的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色底物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片及其制備使用方法。本發(fā)明提供的快速定量檢測(cè)西瓜果斑病菌的蛋白芯片，是在芯片基片上固定至少一種西瓜果斑病菌捕獲抗體的生物芯片。以硝酸纖維素膜為芯片載體，利用特異性抗體捕獲西瓜果斑病菌，同時(shí)以堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG作為陽(yáng)性對(duì)照、點(diǎn)樣緩沖液作為陰性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果既可用肉眼直接判定，也可通過(guò)灰度分析作定量檢測(cè)。相對(duì)傳統(tǒng)ELISA，本發(fā)明以1/12的捕獲抗體用量，1/8的檢測(cè)時(shí)間，達(dá)到與ELISA同等的檢測(cè)能力；并且本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果可長(zhǎng)期保存，可用于種植一線對(duì)西瓜果斑病菌的快速自檢，推廣前景廣闊。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102207503SQ201110061688
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月15日
發(fā)明者劉箐, 孔君, 熊亮斌 申請(qǐng)人:上海慧耘生物科技有限公司