專利名稱：快速檢測和鑒定煙草野火病菌及角斑病菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物病原細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測鑒定方法，尤其是涉及一 種快速檢測和鑒定煙草野火病菌及角斑病菌的方法。
背景技術(shù)：
煙草野火和角斑病是煙草上最重要的細(xì)菌性葉斑病，發(fā)生普遍，條件合適 可以突發(fā)性流行，而且可與多種真菌性葉斑病混發(fā)。由于單純地依靠癥狀和常 規(guī)的分離鑒定不能準(zhǔn)確鑒別這些病害，往往無法指導(dǎo)病害的防治。
現(xiàn)行的植物病原Pseudomonas菌的鑒定主要是根據(jù)N. W. Schaad編著的《植 物病原細(xì)菌鑒定實(shí)驗指南》第二版(Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria, 2ndedition， 1988)、《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》 第八片反禾口第九豐反 (Bergry' s Manual of Determinative Bacteriology, 8"'edition， 1984， 1994)、《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology, 9th edition, 1974)等書描述的的規(guī)范方法進(jìn)行 形態(tài)學(xué)分析和理化性狀鑒定，包括培養(yǎng)性狀、革蘭氏染色反應(yīng)、鞭毛的數(shù)量和 著生位置、是否產(chǎn)生色素或熒光色素、一系列的生理生化特性，即采用Lellitt 等1966年提出的一套鑒定熒光菌的L0PAT試驗果聚糖產(chǎn)生試驗、氧化酶試 驗、馬鈴薯軟腐試驗、精氨酸雙水解酶試驗和煙草過敏性反應(yīng)(Schaad麗， 1998)、以及對寄主植物的致病性分析。這些傳統(tǒng)的鑒定方法不僅費(fèi)工費(fèi)時、 可靠性差、在結(jié)果的判別上受試驗條件和試驗者的主觀因素影響較大，而且目 前尚無法區(qū)分系列性狀幾乎完全近似的致病變種。在植物病原細(xì)菌的檢測技術(shù) 方面，現(xiàn)行的方法主要是血清學(xué)反應(yīng)，利用多克隆抗體檢測細(xì)菌菌體，但其靈 敏性和特異性明顯不足，不適于植物樣品中的待測細(xì)菌數(shù)量較少時的檢測。因 此，從基因組或分子水平上檢測鑒定植物病原細(xì)菌的分子生物學(xué)技術(shù)，己經(jīng)成 為發(fā)展的必然趨勢。
野火和角斑病菌親緣關(guān)系非常近，二者的培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征和理化性 狀完全一致，基因組具有高度的相似性，病理學(xué)上二者的重要區(qū)別在于野火病
菌可以產(chǎn)生野火毒素。但是它們都具有相同的hrpZ基因，基因全長僅有712bp， 它們的hrpZ基因在DNA長度上和堿基序列上不同于其它任何的病原細(xì)菌，但 在野火菌和角斑菌的菌株間卻非常保守(同源性高達(dá)99%以上)，是分子生物 學(xué)鑒定上非常有用的特征。因此，根據(jù)該基因特征序列設(shè)計引物擴(kuò)增其hrpZ 全長，完全可以將煙草野火菌和角斑菌同其他的細(xì)菌區(qū)分開來。此外，角斑菌 又缺乏野火病菌的煙毒素Us"ow'/^合成基因(如tblA、 tabA)，所以再依 據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公開的有關(guān)基因序列設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，便可進(jìn) 一步準(zhǔn)確地鑒別出野火病菌(/^ewGb/^/7assjri/^aepv. 和角斑病菌 (pv.朋g〃Jst3)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種效果良好的快速檢測和鑒定煙草野火病菌及 角斑病菌的方法。
本發(fā)明的目的可通過以下措施來實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001，角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的特異性寡核苷酸 PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成必需基 因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、 Seq ID 006。利用上 述引物對，以細(xì)菌基因組DNA或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為模板， 進(jìn)行Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，2Q 50ul反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物用0. 5 1. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢査，根據(jù)電泳結(jié)果即可于2 5小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火 病菌和角斑病菌。
本發(fā)明與傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法相比，不僅方便、快捷，而且準(zhǔn)確、可靠、 特異性強(qiáng)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，節(jié)約時間，提高了準(zhǔn)確性和特異性；PCR檢測鑒 定法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較形態(tài)鑒定和生理生化鑒定方法更 為準(zhǔn)確；適用于單個病斑、細(xì)菌分離物或單個菌落的檢測。既可進(jìn)行定性檢測
也可進(jìn)行半定量檢測。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例作以詳細(xì)的描述 實(shí)施例1
本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ SeQ ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核 苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物對，以細(xì)菌基因組DNA或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為 模板，進(jìn)行Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，20ul反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物用0. 5%的瓊 脂糖凝膠電泳檢查，根據(jù)電泳結(jié)果即可于2小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和 角斑病菌。
本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核 苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物對，以細(xì)菌基因組DNA或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為 模板，進(jìn)行Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，25ul反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物用0. 8%的瓊 脂糖凝膠電泳檢査，根據(jù)電泳結(jié)果即可于3小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和 角斑病菌。
實(shí)施例3
本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核 苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物對，以細(xì)菌基因組DNA或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為
模板，進(jìn)行Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，30ul反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂 糖凝膠電泳檢查，根據(jù)電泳結(jié)果即可于3. 5小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和
角斑病菌。 實(shí)施例4
本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核 苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物對，以細(xì)菌基因組DNA或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為 模板，進(jìn)行Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，40ul反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物用1. 2%的瓊 脂糖凝膠電泳檢査，根據(jù)電泳結(jié)果即可于4小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和 角斑病菌。
實(shí)施例5
本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌 株hrpZ Seq ID 001、角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核 苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、 Seq ID 004，以及野火毒素生物合成 必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、 Seq ID 006。 利用上述引物對，以細(xì)菌基因組DNA或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為 模板，進(jìn)行Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，50ul反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物用1. 4%的瓊 脂糖凝膠電泳檢査，根據(jù)電泳結(jié)果即可于5小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和 角斑病菌。
實(shí)施例6
在預(yù)加入適量無菌水的干凈PCR管中，再加入細(xì)菌基因組DNAl()0 200ng 或KB平板上的單菌落少許或KB振蕩培養(yǎng)液0. lul，然后加入引物對、反應(yīng) buffer和Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 ul,反應(yīng)條件為95。C X 2min; 5°C X 30s^ 61°C X 30s^72。C X 2min，30個循環(huán)；72°C X 5min， 4°C 保持。PCR產(chǎn)物用0.7%的瓊脂糖電泳檢測。能夠同時擴(kuò)增出大小720bp和 1262bp兩條片段者即為野火病菌，僅擴(kuò)增出720bp片段者為角斑病菌。
實(shí)施例7:取新鮮典型病斑，用70%酒精表面消毒1分鐘后再用無菌水漂洗千凈，然后用無菌剪刀剪碎后置于盛有無菌水(2 5ml/病斑)的干凈試管 中，室溫下放置約0.5 1小時，收集浸出液并離心(室溫下5000rpmX10分 鐘)，沉淀物用100 200ul的無菌水再懸浮后置于95"C左右水浴中熱激10分 鐘，立即冰浴5分鐘。取l一3ul熱激裂解液即可直接作為PCR擴(kuò)增的模板。 PCR方法和電泳結(jié)果的分析同上述實(shí)施例。
附Seq ID及序列清單
編號ID: 001
名稱煙草野火病菌中國菌株hrpZ全序列 大小712bp DNA序列
661GCGGCTGGTCAACATGCTGCTGCAAAGCACTAAAAACCAGGCTGCTGCCTGA 712 編號ID: 002
名稱煙草角斑病菌中國菌株hrpZ全序列
大小712bp
DNA序列
661GCGGCTGGTCAACATGCTGCTGCAAAGCACTAAAAACCAGGCTGCTGCCTGA 712 編號ID: 003 名稱hrpZ5'擴(kuò)增引物 大小27bp
DNA序列5，-GGAATTCATGCAAGCACTTAACAGCAT-3，
編號ID: 004
名稱hrpZ3'擴(kuò)增引物 大小28bp
DNA序列5'-CGGGATCCTCAGGCCACAGCCTGGTTAG-3，
編號ID: 005
名稱TabA上游引物
大小24bp
DNA序列5 ，墨GTGCC AAT ATCCGA AAGCTTCGCC-3'
編號ID: 006
名稱TabA下游引物
大小24bp
DNA序列5，-TTATTTAACGCACCTGGTGGGGTT-3,
權(quán)利要求
1. 一種快速檢測和鑒定煙草野火病菌及角斑病菌的方法，其特征在于本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火菌和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，即野火菌株hrpZ Seq ID 001，角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 003、Seq ID 004，以及野火毒素生物合成必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、Seq ID 006；利用上述引物對和Taq DNA聚合酶，以細(xì)菌基因組DNA 50～400ng或菌落或經(jīng)熱激處理的病斑組織浸提液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20～50ul；PCR產(chǎn)物用0.5～1.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢查，根據(jù)電泳結(jié)果即可于2～5小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和角斑病菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測和鑒定煙草野火病菌及角斑病菌的方法，本發(fā)明方法是根據(jù)煙草野火菌和角斑菌中國菌株的hrpZ全序列，角斑菌株hrpZSeq ID 002，所設(shè)計的序列特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，以及野火毒素生物合成必需基因的特異性寡核苷酸PCR擴(kuò)增引物對，即Seq ID 005、Seq ID 006等；利用上述引物對和Taq DNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果即可于2～5小時內(nèi)快速鑒定出煙草野火病菌和角斑病菌。與傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法相比，不僅方便、快捷，而且準(zhǔn)確、可靠、特異性強(qiáng)。
文檔編號G01N27/447GK101206193SQ20061012844
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者楓 王, 蔣士君, 志 趙 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)