專(zhuān)利名稱(chēng)：煙草野火病病原菌hrpZ基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種編碼植物多
功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的力rA 基因的克隆及其表達(dá)產(chǎn)物， 以及該基因與其表達(dá)產(chǎn)物在植物獲得抗病蟲(chóng)害方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物蛋白農(nóng)藥是對(duì)多種農(nóng)作物具有很強(qiáng)生物活性的一類(lèi)蛋白質(zhì) 藥物，按照作用機(jī)理的不同又可分為傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥和新型微生物 蛋白農(nóng)藥。傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥主要是來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(Bt)的殺蟲(chóng) 晶體蛋白(ICP)，新型微生物蛋白農(nóng)藥主要是蛋白激發(fā)子類(lèi)物質(zhì)，它與傳 統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥最大的區(qū)別在于其不直接殺滅害蟲(chóng)和病原物，而是激 發(fā)植物自身的抗病防蟲(chóng)基因的表達(dá)，并促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前研究 報(bào)道的具有代表性的新型微生物蛋白農(nóng)藥主要有過(guò)敏蛋白(Harpin)、隱 地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受關(guān)注、最有應(yīng)用 前景的是Harpin類(lèi)蛋白激發(fā)子。Harpin蛋白主要是由歐文氏桿菌屬 (五rw/"/fl)、假單胞菌屬(i^gwfifo附a"os)、 黃單孢菌屬(^3"http://zomo"os) 等細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)能激發(fā)植物過(guò)敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)，其可誘導(dǎo)植物體內(nèi)一 系列基因的表達(dá)，激活植物自身的生長(zhǎng)系統(tǒng)和防衛(wèi)系統(tǒng)，從而使植物能 抵御多種病害的侵染和逆境的脅迫，并獲得促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和提高增產(chǎn)的 效果。1992年，美國(guó)康乃爾大學(xué)的韋忠民等首先從梨火疫歐文氏桿菌
CE.a，/owra)中克隆出這類(lèi)過(guò)敏蛋白基因，迄今為止，所有這些Harpin 類(lèi)蛋白差不多都具有以下分子特征(l)親水性；(2)對(duì)熱穩(wěn)定，IO(TC處 理10min不會(huì)失活；(3)對(duì)蛋白酶K和紫外線(xiàn)敏感；(4)富含甘氨酸而缺 少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)。
最近的研究表明，Harpin類(lèi)蛋白可能在植物的信號(hào)通路中起著重要 作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥中Cl、 Ca、 K、 H、 Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、 抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等?，F(xiàn)在 通常認(rèn)為，植物細(xì)胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結(jié)合 蛋白(Harpin-binding proteins, HrBP)， Harpin可以通過(guò)與這些受體蛋白 HrBP結(jié)合激活植物中的多條信號(hào)通路。這些信號(hào)通路大致可以分為以 下三類(lèi)(l)與植物抗病和驅(qū)蟲(chóng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括過(guò)敏反應(yīng)與 細(xì)胞死亡、離子交換通道、水楊酸途徑、茉莉酸途徑、苯丙氨酸解氨酶
介導(dǎo)的途徑以及其它一些抗性基因介導(dǎo)的途徑；(2)與促進(jìn)植物生長(zhǎng)相關(guān)
的信號(hào)通路的激活，包括一般的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、胚軸延伸轉(zhuǎn)錄因子、生 長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成
酶等；(3)與植物抗逆相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括熱休克蛋白、COR 基因和耐鹽鋅蛋白等。另外可能還存在一條比較特殊的不依賴(lài)于NPR1 介導(dǎo)的植物對(duì)細(xì)菌抗性的信號(hào)通路。
Harpin蛋白雖然來(lái)源于病原菌，但作為一類(lèi)非特異性的激發(fā)蛋白因 子，卻能引起非寄主植物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)其抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗 逆性的增加，以及促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量等。在轉(zhuǎn)A/^^?；虻睦嫔?，
Harpin&對(duì)產(chǎn)生梨火疫病的宿主寄生菌五.^^/owra也表現(xiàn)出非常強(qiáng)的 抗性。
現(xiàn)代分子植物病理學(xué)揭示，植物病原細(xì)菌既有其致病性，也有誘導(dǎo) 植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)的能力，而決定這種能力的基因是植物病原 細(xì)菌的/wp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。/wp基因決 定著植物病原細(xì)菌在非寄主植物上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive respons eon non-host plants, HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病 性。HR是植物一種局部的、快速的細(xì)胞編程死亡形式，是植物主動(dòng)抗 性的結(jié)果，其抗性作用不僅表現(xiàn)在對(duì)病原細(xì)菌侵染擴(kuò)展的限制，而且能 進(jìn)一步誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生類(lèi)似免疫機(jī)制的系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)。
首次提出Harpin蛋白誘導(dǎo)植物的過(guò)敏反應(yīng)可能與其抗病性作用有 關(guān)，由此推動(dòng)了新型微生物蛋白農(nóng)藥研究的興起。經(jīng)過(guò)約IO年的努力， 以此為背景的美國(guó)Eden生物科技公司成功開(kāi)發(fā)和研制出具有廣譜抗病 防蟲(chóng)功能的新型微生物蛋白農(nóng)藥Messenger,該產(chǎn)品以其對(duì)大田作物和 經(jīng)濟(jì)作物抗病增產(chǎn)方面良好的效果以及對(duì)綠色無(wú)公害農(nóng)業(yè)卓越的貢獻(xiàn)， 曾兩度獲美國(guó)環(huán)境保護(hù)委員會(huì)頒發(fā)的總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。國(guó)內(nèi)南京農(nóng) 大以王金生教授為首的科研工作者對(duì)水稻黃單胞Harpin蛋白也進(jìn)行了 大量的研究并取得了豐碩的成果。但關(guān)于煙草野火病菌/7^基因的克隆 及Harpin蛋白應(yīng)用目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信 號(hào)因子的/2rpZ^a基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、防治病蟲(chóng)害方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的提供一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)
因子的/z^Z^?；?，其基因編碼區(qū)共計(jì)423個(gè)核苷酸，其基因的核苷 酸序列如SEQ ID No.l，該基因來(lái)源于煙草野火病假單胞菌(P""^w7 cwass_yn>zgaepv.to6ac0菌株，煙草是其寄主植物。該基因以/ir; Z基因 簇形式存在于煙草野火病假單胞菌的染色體DNA上。
本發(fā)明的所述基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和使植物獲得廣譜抗病蟲(chóng) 性方面的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的 /"pZp^基因編碼的Harpin蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)的氨基酸序列在列表SEQ ID No.2中，該蛋白共有140個(gè)氨基酸殘基，分子量14.8kda，等電點(diǎn)為 4.61，富含甘氨酸(Gly)，缺乏半胱氨酸(Cys)，并且具有Harpin類(lèi)蛋 白質(zhì)的基本屬性和生物活性。
煙草野火病病原菌/2wZp自基因編碼的Harpin蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)植物生 長(zhǎng)發(fā)育和使植物獲得廣譜抗病蟲(chóng)性方面的應(yīng)用。
本發(fā)明煙草野火病病原菌/wpZp^基因的克隆方法，包括下列步驟
(1)提取煙草野火病病原菌(尸雄fifo廳"os ,一m pv. totez')的 基因組DNA，根據(jù)Genebank中登錄號(hào)為AB112555的/z^Z序列，設(shè) 計(jì)完整開(kāi)放閱讀框(ORF)引物
坤Z-P 1: 5'-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC;
—Z-P2: 5'-TCACCATTGGAATTGCTGTTG。
(2) 以煙草野火病病原菌(尸化z^o附o"os ^n'wgae pv. ta6ac/)的基 因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)條件為94"C變性4min， 94'C變
性lmin， 56。C退火lmin， 72。C延伸35s，循環(huán)35次，72。C延伸10min，
4'C保存；
(3) 將PCR產(chǎn)物與PTA2載體連接得PTA2-ZwT7Z重組體，轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌菌株top10中，經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；
(4) 提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTA2-Z^Z的DNA并測(cè)序。 本發(fā)明煙草野火病病原菌/2VZ^。基因的表達(dá)方法，包括下列步驟 (1)根據(jù)所得的/^pZ基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF (剔
除起始密碼子)的引物P3和P4，在5'端分別引入&mHl和&oRl 酶切位點(diǎn)
/w^Z-P3: 5' -GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAATO，Hl); /wpZ-P4: 5'隱GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG (￡coRl); 以陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTA2-Z7^Z為模板，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)萬(wàn)"mHl和五co Rl雙酶切處理，插入到載體PGEX-4T-1的BawHl和五coRl酶切位點(diǎn) 之間，使得/^pZp^基因與PGEX-4T-1上的還原型谷胱甘肽標(biāo)簽形成融 合基因，從而得到原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-&pZp,,。；
(2)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21 (DE3)中，在LB培養(yǎng)基 (Ampl00ug/mL)中37。C振搖(120 250r/min)培養(yǎng)至OD60o=0.5 0.8， 取400 500ul接種于30ml LB表達(dá)培養(yǎng)基(AmplOOug/mL)中培養(yǎng)2 3h后加入IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3~5h。取誘導(dǎo)的菌液 1.5ml于L5ml的離心管中離心lmin，去除上清，將沉淀加入50ul 2xSDS 上樣緩沖液，100。C煮沸5min，取30ul進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)目的蛋白 的表達(dá)情況。
HrpZPsta蛋白質(zhì)具有以下主要生物學(xué)功能(l)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、 提高產(chǎn)量；(2)使植物獲得廣譜抗病性，包括對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒的抗性; (3)使植物獲得對(duì)某些有害昆蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)性。
由于HrpZ^,蛋白質(zhì)在增強(qiáng)植物抗病、驅(qū)蟲(chóng)、抗逆以及促進(jìn)生長(zhǎng)和 提高產(chǎn)量方面的良好效果，加之其對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人畜鳥(niǎo)魚(yú)無(wú)毒性，而 且不會(huì)引起病原物的抗藥性，也不會(huì)誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA) 的改變，在環(huán)境中容易分解、沒(méi)有殘留公害，可望成為未來(lái)逐步替代高 毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)調(diào)節(jié)劑的優(yōu)良環(huán)保型生物產(chǎn)品的首選。目前 正在就其對(duì)各種作物、蔬菜、水果、花卉、中草藥以及各種經(jīng)濟(jì)植物等 數(shù)十種植物在內(nèi)的抗病驅(qū)蟲(chóng)和促長(zhǎng)增產(chǎn)效果進(jìn)行廣泛的試驗(yàn)和比較。已 有試驗(yàn)結(jié)果顯示，HrpZp加蛋白對(duì)白菜、番茄、黃瓜、防風(fēng)、土豆、水 稻、玉米等的抗病驅(qū)蟲(chóng)和促長(zhǎng)增產(chǎn)效果明顯，同時(shí)對(duì)提高某些植物如葡 萄、藍(lán)莓的品質(zhì)亦有很好的效果，而且在同類(lèi)Harpin產(chǎn)品中對(duì)比效果 也很顯著。另外HrpZp^蛋白可直接應(yīng)用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲(chóng) 害防治，包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)植物、蔬菜、水果、花卉以及園林和草場(chǎng) 的養(yǎng)護(hù)等。使用方法有浸種、拌種、蘸根、種子包衣、植株注射、葉面 噴施、花果噴涂等。使用劑量因使用方法和品種而異， 一般 10^ig/ml 10(^g/ml均為有效濃度；施用后4 12小時(shí)內(nèi)即發(fā)生作用，藥 效可持續(xù)20d左右， 一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可用藥2 3次。
Eco// BL12(DE3)菌株及基因的高效表達(dá)載體PGEX-4T-1質(zhì)粒在國(guó) 內(nèi)外分子生物學(xué)研究及醫(yī)藥工業(yè)中己廣泛應(yīng)用，對(duì)環(huán)境安全可靠。


圖1、 PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒PTA2-hrpzpsta，圖中
M: DNA marker DL2000; h PTA2-hrpZpsta經(jīng)Ecor2-BamH1雙酶切；2: PCR產(chǎn) 物。
圖2、 PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒PGEX-hrpzpsta 圖中
M: DNA marker SM0191; 1:重組質(zhì)粒PGEXPGEX-hrpZpsta經(jīng)BamHl+EcoRl雙酶切鑒定；2;重組質(zhì)粒PGEX-hrpZpsta經(jīng)單酶切鑒定；3: PCR產(chǎn)物；4: DNAmarker DGL2000。
圖3、 PGEX- hrpZpsta重組質(zhì)粒經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的 SDS-PAGE分析；圖中
M:蛋白marker D530S; 1:含PGEX-hrpZpsta重組質(zhì)粒的寄主菌E.coliBL21(DE3) 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2-6:含PGEX-hrpZpsta加重組質(zhì)粒的寄主菌E.coliBL21 (DE3 )經(jīng)濃度為5， 4， 3， 2， lmmol/LIPTG的誘導(dǎo)。
圖4、上清及沉淀的表SDS-PAGE分析，圖中
1:經(jīng)超聲波處理離心后的上清；2:經(jīng)超聲波處理離心后沉淀；3:蛋白marker。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中使用的縮略語(yǔ)
LB:細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaC110g/L， pH7.0;
Amp:氨芐青霉素；IPTG:異丙基硫代-e-半乳糖苷；PMSF:苯甲 基磺酰氟；Tris:三羥甲基氨基甲烷；PBS:磷酸緩沖液。
實(shí)施例l:煙草野火病病原菌hrpZ基因的克隆與測(cè)序
1、 hrpZpsta基因的來(lái)源hrpZpsta基因來(lái)源于煙草野火病假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Psta218菌株(本菌株采集于通化地區(qū) 的柳河)，煙草是其寄主植物。該基因以hrpZ基因簇形式存在于Psta218 菌株的染色體DNA上。
2、 hrpZpsta218基因克隆與測(cè)序
(1) 把煙草野火病假單胞菌CPsew iomo"<M s少W"gae pv.to6ac/) Psta 218菌株首先KBA平板上篩選，該菌株能分泌熒光色素，并在紫外光下 發(fā)生熒光。
(2) 將選取的單克隆菌落，于28"C下在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1 2h，離心收集菌體，用于提取基因DNA。
(3)煙草野火病假單胞菌(戶(hù)s,/"g^ pv. to^c^基因組DNA的 提取及/z^z克隆。按照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第一版上細(xì)菌基 因組DNA的提取方法及DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)Genebank 中登錄號(hào)為AB112555的/^;^序列，設(shè)計(jì)完整ORF的PCR擴(kuò)增引物P ST-Ph 5，-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC; PST-P2: 5'-TCACCATT GGAATTGCTGTTG;
以戶(hù)s,/"gae pv. tok d基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng) 條件為94。C變性4min， 94。C變性lmin， 56。C退火lmin， 72。C延伸35s， 循環(huán)35次，72。C延伸10min， 4'C保存。
回收后的PCR產(chǎn)物與PTA2載體鏈接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 topl0中，篩選白色菌落，經(jīng)酶切進(jìn)一步鑒定得到構(gòu)建的克隆載體。
重組克隆提取的質(zhì)粒pTA2-^/^w送往上海生工測(cè)序。用DNAman 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI上登錄的Zz/pz.*登錄號(hào)為AB112555，進(jìn)行核 苷酸序列比對(duì)。利用特異性引物對(duì)PST-P1/ PST-P2擴(kuò)增/7vZ一，擴(kuò)增 產(chǎn)物在凝膠電泳道中只有一條特異性的染色帶，大小約420bp，與預(yù)計(jì) 的目的片段大小一致。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至PTA2載體上，篩選白色菌落， 進(jìn)一步用5amHl/EcoRl酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒2900和420bp左右有
相應(yīng)的條帶(圖l)，說(shuō)明重組質(zhì)粒中含有插入的片段。
實(shí)施例2煙草野火病病原菌/^Z基因表達(dá)蛋白的制備
1、 hrpZpsta218基因工程表達(dá)菌株的構(gòu)建據(jù)本試驗(yàn)測(cè)得的hrpZpsta基
因，設(shè)計(jì)剔除起始密碼子ORF并引入酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物P3: 5'-G GGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAACCg蘭朋，P4: 5，-GGGAATTCT CACCATTGGAATTGCTG (&oi 7)。以克隆載體為模板。PCR產(chǎn)物經(jīng) 5amHl和￡coW雙酶切處理，插入到PGEX-4T-1的上述5amHl和￡c oi /酶切位點(diǎn)之間，使得/^9Z-?；蚺cPGEX-4T-l的還原型谷胱甘肽 標(biāo)簽形成融合基因，從而得到原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-Zz^Z^。。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感 受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)中，通過(guò)選擇壓及酶切鑒定篩選出含PGEX-;^; Zp^質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(圖2)。將帶有表達(dá)質(zhì)粒PGEX-Z^/7Z^。的大 腸桿菌BL21 (DE3)接種與30ml的LB-Amp20pg/ml培養(yǎng)基中，在37 "C下培養(yǎng)9h后，吸取600ul菌液于1. 5ml的離心管內(nèi)再加入400ul的 甘油后置于-8(TC下存。
2、 大規(guī)模發(fā)酵(l)活化原種將帶有/2^Z^?；蚋咝П磉_(dá)質(zhì)粒P GEX-4T-1的工程菌￡."http://81^12(0￡3)菌株于甘油-1^+八11^20嗎/1111的保 存液中，37"C培養(yǎng)過(guò)夜。(2)制備母種將原種液按1%體積接種于加有 100mlLB+AMP20嗎/ml的250ml搖瓶中，于37°C110rpm振蕩培養(yǎng)12h。
(3) 制備生產(chǎn)種將母種菌液按1X體積比接種于加有3L LB+Amp 25^1 g/ml的5L發(fā)酵罐中，37°C 110rpm和0.5L/min通氣量條件下培養(yǎng)12h。
(4) 大規(guī)模發(fā)酵將50L以上的發(fā)酵罐加入70%體積的LB及終濃度40 嗎/ml的AMP后，原位滅菌30min(12(TC， l.lMPa);然后按1%體積比
接入生產(chǎn)種子菌，37"C200rpm和1L/min通氣量條件下發(fā)酵培養(yǎng)；待細(xì) 菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(006()()=0.6-0.8)后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，以保證發(fā)酵 環(huán)境有充足的供氧(DO〉30%)，并按特定程序進(jìn)行對(duì)數(shù)分期補(bǔ)料；在 細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束前1 2 h，通過(guò)微孔濾膜加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃 度lmM;繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵4 6h，即可下罐。此法可實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度 或高效培養(yǎng)。(5)HrpZp^蛋白質(zhì)的制備和純化。HrpZp^蛋白質(zhì)在大腸桿 菌細(xì)胞中50。/。左右以包涵體(inclusionbody)形式存在，必須對(duì)其細(xì)胞進(jìn) 行破碎。首先采用8M尿素破碎制備，然后按下列程序操作離心(5,00 Orpm， 10min)收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 6 h的大腸桿菌細(xì)胞，以20mMTris 緩沖液(pH9.0)充分懸浮后，力[]10(il/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10 min，力卩0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超聲波(20KHz)破碎10min，再加 0.5ml/25ml的PMSF，混勻后再超聲波破碎10min， 10,000rpm離心10 min，取上清液于IOO"C水浴10min，冷卻后12,000rpm離心10min，收 集上清液。此上清液中含有濃度3g/L的HrpZp^蛋白質(zhì)。 實(shí)例3 HrpZp^蛋白的表達(dá)特性及其生物活性檢測(cè)
1、重組載？0￡乂-11。2,導(dǎo)入表達(dá)寄主菌￡. //81^21 (DE3)中，誘 導(dǎo)表達(dá)，PG￡X-/zrpZftto經(jīng)終濃度為5mmol/L、 4mmol/L、 3mmol/L、 2mmol/L和lmmol/L IPTG誘導(dǎo)3h后，取誘導(dǎo)的菌液1.5ml于1.5ml的 離心管中離心lmin，去除上清，將沉淀加入50ul2XSDS上樣緩沖液， 10(TC煮沸5min，取30ul進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。 SDS-PAGE分析結(jié)果表明3h時(shí)后均高效表達(dá)，在41kDa左右有特異蛋 白條帶，大小與預(yù)測(cè)基本一致，IPTG終濃度5mmol/L到lmmol/L誘導(dǎo)
表達(dá)差異不明顯(圖3)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組載體PGEX-ZwpZp^的BL21 (DE3)無(wú)相應(yīng)的條帶。
將誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)化的￡.^//81^21 (DE3)菌體離心的 沉淀溶于相當(dāng)于1/20誘導(dǎo)培養(yǎng)基體積的PBS (5mmol/L ， pH6.5)中， 超聲波破碎離心收集沉淀與上清，將沉淀重懸于20ul的ddH20，上清 與懸浮的沉淀各吸取15ul加入15ul2XSDS上樣緩沖液混勻，煮沸5min， 取30ul進(jìn)行SDS-PAGE，對(duì)蛋白進(jìn)行可溶性分析。12%的SDS-PAGE分 析發(fā)現(xiàn)上清在41kDa左右有一條蛋白條帶(圖4)，與沉淀進(jìn)行電泳出 現(xiàn)的電泳條帶大小一致，證實(shí)融合表達(dá)蛋白可溶性，用BANDSCAN軟 件分析其百分比含量，結(jié)果顯示沉淀中融合蛋白約占45%，上清中約占 50%。對(duì)上清與沉淀總蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)換算得沉淀與上清中的融 合蛋白含量分別為0.72mg/ml， 0.88mg/ml，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物一半以上溶解 在上清中。將HarpinPSTA218蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離純化，并對(duì)HrpZp^蛋 白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析和HR檢測(cè)。根據(jù)/z^Z-?；虻暮塑账嵝蛄?推測(cè)，HrpZpsta蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNa2。該蛋白質(zhì)具有以下
屬性(l)由140個(gè)氨基酸殘基組成；(2)分子量41.2kda; (3)等電點(diǎn)pl:
4.61; (4)富含甘氨酸Gly，缺乏半胱氨酸Cys; (5)對(duì)溫度穩(wěn)定，在100 。C沸水中耐受10-15min仍有活性；(6)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。 2、HrpZp^蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性檢測(cè)目前公認(rèn)的Harpin類(lèi)蛋的生物活 性檢測(cè)方法主要有(l)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive responss， HR)， 通常以 煙草作被試植物，但由于本蛋白來(lái)源于煙草的宿主菌，所以我們把番茄做 為檢測(cè)植物，這也是Harpin類(lèi)蛋白生物活性檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便的方法；(2) 血清學(xué)反應(yīng)，即用標(biāo)準(zhǔn)的Harpin蛋白純品制成血清抗體，然后用這種 抗血清對(duì)對(duì)未知樣品進(jìn)行Western分析，通過(guò)抗體識(shí)別反應(yīng)，可以準(zhǔn)確 檢測(cè)出未知樣品中Harpin蛋白。 實(shí)施例4 HrpZptM蛋白質(zhì)的使用方法
HrpZp泡蛋白質(zhì)在使用上方法多樣，可因處理材料、處理部位、處 理時(shí)間以及處理目的不同而有所差異。具體可按以下介紹的方法使用
(1) 浸種首先用水將HrpZpsta蛋白質(zhì)配成40 8(Vg/ml的濃度，然后 將種子浸于其中10h左右。此法適宜作催芽的作物或蔬菜種子。浸種結(jié) 束后，將種子從HrpZp^蛋白質(zhì)浸種液中取出，即可催芽或播種。出苗 一周后，苗高比對(duì)照增長(zhǎng)10%以上，生長(zhǎng)量也提高10%以上，而且苗 期抗猝倒病的能力也明顯增強(qiáng)。
(2) 拌種將種子稍加濕潤(rùn)，加入種子量0.1%的HrpZptsa蛋白質(zhì)制 劑，充分拌勻后播種。出苗后苗齊苗壯，增強(qiáng)苗期抗猝倒病的能力。
(3) 蘸根適于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、水稻、玉米、防風(fēng) 等。首先將HrpZpsta蛋白質(zhì)制劑配成30pg/ml的水溶液，然后將被移栽 作物幼苗的根浸在該溶液中l(wèi)~2h。移栽后，植株恢復(fù)生長(zhǎng)快，緩苗時(shí) 間縮短，植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁。
(4) 葉面噴霧作物的整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)均可進(jìn)行噴施。將HrpZpsta蛋白 質(zhì)制劑配成20 30pg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘗期、初花期、 初果期或灌漿期進(jìn)行噴霧使用。作物生長(zhǎng)季節(jié)一般可噴霧2 3次。噴霧 后，可提高作物營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)量15% 20%，提高產(chǎn)量10% 15%，而且整 個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可省掉50%以上的化學(xué)農(nóng)藥。某些作物如白菜可抗60%的
黑斑病、黃瓜可抗50。^的灰霉病。另外還有一定的抗逆(抗旱、抗寒、
耐鹽堿等)和驅(qū)蟲(chóng)效果。
實(shí)施例5 /^/7Zp^基因的相關(guān)應(yīng)用
(1) 用基因重組技術(shù)將/2/pZ^?；蚩寺∵M(jìn)抗卡那霉素的PBI121質(zhì) 粒載體中，形成PBI121-Z^pZ a質(zhì)粒；
(2) 用PBI121-^/7Z^。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，篩選含PBI121-Z^Z腸 質(zhì)粒的陽(yáng)性表達(dá)農(nóng)桿菌；
(3) 經(jīng)外植體選擇、高滲和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化體 用PCR及Southen雜交鑒定獲得的轉(zhuǎn)化體；
(4) 該轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)/2^Z^a基因的馬鈴薯相比，具有明顯的生 長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和抗晚疫及病毒的特性。
實(shí)施例6 HrpZp^蛋白質(zhì)的應(yīng)用舉例
目前已對(duì)數(shù)十種作物、蔬菜、中草藥作了HrpZpsta蛋白質(zhì)的施用效 果試驗(yàn)，雖然在不同作物品種上表現(xiàn)程度有所不同，但HrpZpsta蛋白質(zhì) 的促長(zhǎng)增產(chǎn)、抗病驅(qū)蟲(chóng)、提高抗逆性等方面的作用是顯著的。
下面舉幾例加以說(shuō)明
(l)白菜選取兩塊5分地大小的4 5葉期白菜苗田，分別用作對(duì) 照和處理區(qū)。處理區(qū)分別在6葉期和8葉期用15-20pg/ml的HrpZPsta 蛋白質(zhì)溶液作了葉面噴霧，12h后接種白菜黑斑病菌，此外不使用任何 農(nóng)藥，其它方面的管理與對(duì)照區(qū)一樣。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用藥后一 周，白菜黑斑病發(fā)病率也比對(duì)照區(qū)低20%~30%;收獲時(shí)處理區(qū)產(chǎn)量比 對(duì)照增產(chǎn)15%以上。
(2) 玉米選取兩塊4分地大小的4葉期玉米苗田，分別用作對(duì)照 和處理區(qū)。處理區(qū)分別在4葉期和6葉期用15 20pg/ml的HrpZp^蛋白 質(zhì)溶液作了葉面噴霧，其它方面的管理與對(duì)照區(qū)一樣。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā) 現(xiàn)，用藥后2周，處理區(qū)平均株高比對(duì)照區(qū)高出4 5cm，同時(shí)處理區(qū)抽 雄比對(duì)照區(qū)提前2 3d，玉米大斑病發(fā)病病級(jí)比對(duì)照降低1 2級(jí)，灌漿 期雙苞率明顯高于對(duì)照。收獲后比較產(chǎn)量，處理區(qū)比對(duì)照區(qū)增產(chǎn)10%以 上。
(3) 防風(fēng)選取二塊5分地大小的4-5片真葉期防風(fēng)苗田，分別用 作對(duì)照和HrpZpsta蛋白質(zhì)處理區(qū)，處理苗棚的HrpZpsta蛋白處理液的濃 度為20pg/ml。處理區(qū)在4葉期、5葉期和7葉期進(jìn)行過(guò)葉面噴霧，其 它管理同對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明HrpZp^蛋白質(zhì)處理塊防風(fēng)葉斑病比 對(duì)照減少了 60。％。
(4)油菜HrpZp^蛋白對(duì)植物有害昆蟲(chóng)的驅(qū)殺性。油菜為蚜蟲(chóng) 易感植物。用25pg/ml濃度的HrpZp^蛋白制劑在25'C條件下對(duì)油菜種 子浸種24~48h，并以pH6.5的5mM磷酸鹽緩沖液作對(duì)照浸種處理， 然后分別播于三個(gè)培養(yǎng)缽中萌發(fā)，待出苗以后分組移栽于同一塊大田 中，隨后每天觀(guān)察記錄感染蚜蟲(chóng)的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照處理組第l、 2、 3、 6、 7、 8、 9、 IO天單株感染蚜蟲(chóng)的平均數(shù)分別為0、 3、 4、 6、 7、 8、 12、 15; HrpZpsta蛋白處理組單株感染蚜蟲(chóng)的平均數(shù)分別為0、 0、 0、 1、 1、 1、 2、 3。序列表
<110>吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>煙草野火病病原菌hrpZ基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用 <130> gj0801 <160> 2
< 170> Patentln version 3 5
<210> 1 <211> 423 <212> DNA
<213> Pseudomonas syringae pv.tabaci <400> 1
atgcagagtc tcagtcttaa cagcagcacg ctgcaaagcc cggcgatggc gctcgttctg 60 atccgtcctg aaaccgagac aaccgggccg agtacatcca gccgggcgct tcaggaagtg120 attgcgcagc ttgcccagga gctgactcac aatggtcaac tggacgagag ttcgccattg180 ggcaagttgc tcggcaaagc gatggccgcc agtggcaagg ctggcggcgg cctcgaggac 240 atcaaggctg cgctggacac gcttatccac gaaaagctgg gcgacaattt tggcgcttct 300 gccgacaacg cctcggatac cggacaaccc gacttgatga cacaggtgct caatggcctg 360 gccaagtcga tgctgaatga tcttctgacc cggccccgcc agcaacagca attccaatgg 420 tga 423
<210> 2 <211> 140 <212> PRT
<213> Pseudomonas syringae pv.tabaci <400> 2
Met Gin Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Thr Leu Gin Ser Pro Ala Met 15 10 15
Ala Leu Val Leu He Arg Pro Glu Thr Glu Thr Thr Gly Pro Ser Thr 20 25 30
Ser Ser Arg Ala Leu Gin Glu Val lie Ala Gin Leu Ala Gin Glu Leu 35 40 45
Thr His Asn Gly Gin Leu Asp Glu Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu 50 55 60
Gly Lys Ala Met Ala Ala Ser Gly Lys Ala Gly Gly Gly Leu Glu Asp 65 70 75 80
lie Lys Ala Ala Leu Asp Thr Leu lie His Glu Lys Leu Gly Asp Asn 85 90 95
Phe Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ala Ser Asp Thr Gly Gin Pro Asp Leu 腦 105 110
Met Thr Gin Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asn Asp Leu 115 120 125
Leu Thr Arg Pro Arg Gin Gin Gin Gin Phe Gin Trp 130 135 140
權(quán)利要求
1、一種煙草野火病病原菌hrpZPsta基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。
2、如權(quán)利要求1所述的煙草野火病病原菌/2VZMa基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和使植物獲得廣譜抗病蟲(chóng)性方面的應(yīng)用。
3、如權(quán)利要求1所述的煙草野火病病原菌/^7Zp^基因的克隆方法，包括下列步驟(1)提取'iS草野火病病原菌(尸化wdo附o"os ^n'"gae pv. to6ac/)的 基因組DNA，根據(jù)Genebank中登錄號(hào)為AB112555的/^ Z序列，設(shè) 計(jì)完整開(kāi)放閱讀框(ORF)引物—Z-P1: 5'-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC;—Z-P2: 5 '-TCACCATTGGAATTGCTGTTG 。(2) 以煙草野火病病原菌(戶(hù)廳t/omo"os甲/"gae pv. to6oc/)的基 因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)條件為94'C變性4min， 94'C變 性lmin， 56。C退火lmin， 72。C延伸35s，循環(huán)35次，72。C延伸10min， 4"C保存；(3) 將PCR產(chǎn)物與PTA2載體連接得PTA2-Z^pZ重組體，轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌菌株toplO中，經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；(4) 提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTA2-ZwT Z的DNA并測(cè)序。
4、如權(quán)利要求1所述的煙草野火病病原菌/^pZ&a基因的表達(dá)方法，包括下列步驟(1)根據(jù)所得的/^7Z基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF (剔 除起始密碼子)的引物P3和P4，在5'端分別引入^m/n和&oi l 酶切位點(diǎn)/^/ Z-P3: 5' -GGGGATCCCAGAGTCTCAGTCTTAACmHl); &/ Z-P4: 5' -GGGAATTCTCACCATTGGAATTGCTG (五coRl); 以陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTA2-/zr; Z為模板，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Bfl/wHl和五co Rl雙酶切處理，插入到載體PGEX-4T-1的SamHl和五coRl酶切位點(diǎn) 之間，使得/z^Z-a基因與PGEX-4T-l上的還原型谷胱甘肽標(biāo)簽形成融 合基因，從而得到原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-Zwt Z^。；(2)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21 (DE3)中，在LB培養(yǎng)基 (Ampl00ug/mL)中37。C振搖(120 250r/min)培養(yǎng)至OD,=0.5 0.8， 取400 500ul接種于30ml LB表達(dá)培養(yǎng)基(Amp 1 OOug/mL)中培養(yǎng)2 3h后加入IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3~5h。取誘導(dǎo)的菌液 1.5ml于1.5ml的離心管中離心lmin，去除上清，將沉淀加入50ul 2xSDS 上樣緩沖液，100。C煮沸5min，取30ul進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)目的蛋白 的表達(dá)情況。
5、 如權(quán)利要求1所述煙草野火病病原菌/z^Z^。基因編碼的Harpin 蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所述。
6、 煙草野火病病原菌/2/^Z^?；蚓幋a的Harpin蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)植 物生長(zhǎng)發(fā)育和使植物獲得廣譜抗病蟲(chóng)性方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙草野火病病原菌hrpZ基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，應(yīng)用在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和使植物獲得廣譜抗病蟲(chóng)性方面。由于HrpZ_Psta蛋白質(zhì)在增強(qiáng)植物抗病、驅(qū)蟲(chóng)、抗逆以及促進(jìn)生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量方面的良好效果，加之其對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人畜鳥(niǎo)魚(yú)無(wú)毒性，而且不會(huì)引起病原物的抗藥性，也不會(huì)誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA)的改變，在環(huán)境中容易分解、沒(méi)有殘留公害，可望成為未來(lái)逐步替代高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)調(diào)節(jié)劑的優(yōu)良環(huán)保型生物產(chǎn)品的首選。
文檔編號(hào)A01P3/00GK101386859SQ20081005136
公開(kāi)日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者姜兆遠(yuǎn), 張佳環(huán), 潔 高 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)