專利名稱：一種煙草野火病病菌分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種操作簡(jiǎn)便、快捷，適合于田間作業(yè)條件下采集病菌的煙草野火病病菌分離方法。
背景技術(shù)：
煙草野火病(tobacco wild fire)是世界煙草生產(chǎn)中危害較嚴(yán)重的細(xì)菌病害之一，也是我國(guó)煙草的主要病害之一。野火病主要為害葉片，也能侵害花、蒴果和種子。葉上癥狀初為水潰狀圓形褪色的小斑點(diǎn)，后來(lái)斑點(diǎn)擴(kuò)大，中心變成褐色，周圍有一圈很寬的黃綠色暈環(huán)，于幼苗期或氣候潮濕時(shí)最為明顯，直徑可達(dá)f 2厘米。煙草受害后，一般發(fā)病率1(Γ30%，嚴(yán)重地塊發(fā)病率7(Γ100%，能夠?qū)е陆^收。要實(shí)現(xiàn)煙草野火病抗病品種選育、病害的控制都與病菌小種的分化、群體遺傳的多樣性密切相關(guān)，因此煙草野火病病菌分離是最基本的工作。目前，煙草野火病的分離多采用組織破碎法進(jìn)行，選取病組織表面消毒后，破碎組織，稀釋涂布或劃線分離。這種方法在有效去除病組織表面腐生微生物的同時(shí)，也殺滅了大量的目標(biāo)病菌，致使大量的病樣難以分離到病菌，分離效率比較低下，浪費(fèi)了大量標(biāo)本。為此，開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、快捷，適合于田間作業(yè)條件下采集病菌的煙草野火病病菌分離方法，對(duì)于煙草野火病防治工作是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種操作簡(jiǎn)便、快捷，適合于田間作業(yè)條件下采集病菌的煙草野火病病菌分離方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟:
Α、選擇病斑:選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；
B、收集噴菌液:將病斑的中心點(diǎn)切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3 1/2處；在凹槽中滴加15(Γ300μ 無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；
C、分離擴(kuò)繁:在無(wú)菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液10(Γ200 μ L涂布于KMB培養(yǎng)基平板，在24 28°C下培養(yǎng)48 72h ；
D、菌落選取:取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的1(Γ15個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成1(T 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，每株接種7、個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)接種0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度大于80%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。

本發(fā)明根據(jù)煙草野火病病菌能局限于發(fā)病死體組織中的特性，以葉片上的病斑作為分離煙草野火病病菌的基礎(chǔ)材料，不經(jīng)過(guò)表面消毒，利用細(xì)菌的噴菌現(xiàn)象，病菌從完整的病組織釋放，以收集到噴菌液實(shí)現(xiàn)分離擴(kuò)繁。本發(fā)明收集噴菌液可以在田間采樣時(shí)進(jìn)行，不必回到實(shí)驗(yàn)室，能夠減少雜菌污染，也提高了工作效率；本發(fā)明的分離效率高、病樣用量少，與普通組織破碎法分離比較，可以節(jié)約3(Γ50%的病樣標(biāo)本；本發(fā)明的分離的純度高，病菌在噴菌液中處于優(yōu)勢(shì)，分離純化一步到位，減少了轉(zhuǎn)代的次數(shù)，保持了病菌野生型特性，特別是對(duì)保持病菌的致病力有利。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限定，任何基于本發(fā)明的技術(shù)思路的等同替換，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的方法包括以下步驟:
Α、選擇病斑:選典型煙 草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；
B、收集噴菌液:將病斑的中心點(diǎn)切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3 1/2處；在凹槽中滴加15(Γ300μ 無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；
C、分離擴(kuò)繁:在無(wú)菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液10(Γ200 μ L涂布于KMB培養(yǎng)基平板，在24 28°C下培養(yǎng)48 72h ；
D、菌落選取:取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的1(Γ15個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成1(T 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，每株接種7、個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)接種0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度大于80%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。C步驟所述的KMB培養(yǎng)基按以下配比制備:懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g或硫酸鎂0.738g、甘油10ml、瓊脂17 20g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)整pH值至
7.0 7.2。D步驟所述的煙草樣本植株為易感病品種K326、G28、紅花大金元或云煙85生長(zhǎng)至6 7片真葉時(shí)的植株。D步驟所述的接種點(diǎn)選擇于側(cè)脈之間，接種點(diǎn)間距為1.(Tl.5cm。所述的煙草野火病菌分離方法還包括目標(biāo)菌落保存操作，取D步驟確定的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成10卜107CFU/mL的菌懸液，在-2(T-70°C下保存；所述的保存液為15^40%的甘油蒸餾水溶液。本發(fā)明的工作原理:
本發(fā)明根據(jù)煙草野火病病菌能局限于發(fā)病死體組織中的特性，以葉片上的病斑作為分離煙草野火病病菌的基礎(chǔ)材料，不經(jīng)過(guò)表面消毒，利用細(xì)菌的噴菌現(xiàn)象，病菌從完整的病組織釋放，以收集到噴菌液實(shí)現(xiàn)分離擴(kuò)繁。實(shí)施例1
按懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g、甘油10ml、瓊脂17g配比,加蒸懼水至1000ml，調(diào)整pH值至7.0,制備KMB培養(yǎng)基。
實(shí)施例2
按懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、硫酸鎂0.738g、甘油10ml、瓊脂20g配比，加蒸餾水至1000ml，調(diào)整pH值至7.2，制備KMB培養(yǎng)基。實(shí)施例3
按懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g、甘油10ml、瓊脂19g配比,加蒸懼水至1000ml，調(diào)整pH值至7.1，制備KMB培養(yǎng)基。實(shí)施例4
選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點(diǎn)切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3處；在凹槽中滴加150 μ L無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；在無(wú)菌條件下將噴菌液5倍倍比梯度稀釋，取稀釋53倍的稀釋液100 μ L涂布于實(shí)施例1制備的KMB培養(yǎng)基平板上，在24 28°C下培養(yǎng)48h ;取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的10個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成IO6 107CFU/mL的菌懸液 ；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本K326植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，接種點(diǎn)選擇于側(cè)脈之間，間距1.(Tl.5cm，每株接種7個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)接種0.1mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度82%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。實(shí)施例5
選典型是煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點(diǎn)切成“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/2處；在凹槽中滴加300 μ L無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；在無(wú)菌條件下將噴菌液10倍倍比梯度稀釋，取稀釋IO3倍的稀釋液200 μ L涂布于實(shí)施例2制備的KMB培養(yǎng)基平板上，在24 28°C下培養(yǎng)72h ;取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的15個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成IO6 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本云煙85植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，選擇側(cè)脈間距1.(Tl.5厘米的位點(diǎn)，每株接種9個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)接種0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度83%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。實(shí)施例6
選典型是煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點(diǎn)切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3處；在凹槽中滴加200 μ L無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；在無(wú)菌條件下將噴菌液5倍倍比梯度稀釋，取稀釋55倍的稀釋液150 μ L涂布于實(shí)施例3制備的KMB培養(yǎng)基平板上，在24 28°C下培養(yǎng)60h ;取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的12個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成IO6 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本G28植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，選擇側(cè)脈間距1.(Tl.5厘米的位點(diǎn)，每株接種8個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)接種0.15mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度84%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。
實(shí)施例7
選典型是煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點(diǎn)切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/2處；在凹槽中滴加250 μ L無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；在無(wú)菌條件下將噴菌液10倍倍比梯度稀釋，取稀釋IO5倍的稀釋液180 μ L涂布于實(shí)施例2制備的KMB培養(yǎng)基平板上，在24 28°C下培養(yǎng)54h ;取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的11個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成106^107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本紅花大金元植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，選擇側(cè)脈間距1.(Tl.5厘米的位點(diǎn)，每株接種7個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)接種0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度81%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。實(shí)施例8
將實(shí)施例4選擇的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_20°C下保存，保存液為15%的甘油蒸餾水溶液。實(shí)施例9
將實(shí)施例5選擇的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_70°C下保存，保存液為40%的甘油蒸餾水溶液。實(shí)施例10
將實(shí)施例7選擇的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_45°C下保存，保存液為30%的甘油蒸餾水溶液。實(shí)施例11
將實(shí)施例4選擇的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_30°C下保存，保存液為15%的甘油蒸餾水溶液。實(shí)施例12
將實(shí)施例6選擇的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_60°C下保存，保存液為35%的甘油蒸餾水溶液。
權(quán)利要求
1.一種煙草野火病病菌分離方法，其特征在于包括以下步驟: A、選擇病斑:選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下； B、收集噴菌液:將病斑的中心點(diǎn)切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3 1/2處；在凹槽中滴加15(Γ300μ 無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液； C、分離擴(kuò)繁:在無(wú)菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液10(Γ200 μ L涂布于KMB培養(yǎng)基平板，在24 28°C下培養(yǎng)48 72h ； D、菌落選取:取培養(yǎng)基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當(dāng)、形態(tài)相似的有綠色熒光的1(Γ15個(gè)單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成1(T 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，每株接種7、個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)接種0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養(yǎng)，每12h光照/黑暗交替一次，相對(duì)濕度大于80%，如此培養(yǎng)7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于C步驟所述的KMB培養(yǎng)基按以下配比制備:懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g或硫酸鎂0.738g、甘油10ml、瓊脂17 20g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)整pH值至7.0 7.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于D步驟所述的煙草樣本植株為易感病品種K326、G28、紅花大金元或云煙85生長(zhǎng)至6 7片真葉時(shí)的植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于D步驟所述的接種點(diǎn)選擇于側(cè)脈之間，接種點(diǎn)間距為1.(Tl.5cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于還包括目標(biāo)菌落保存操作，取D步驟確定的目標(biāo)菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在-2(T-70°C下保存；所述的保存液為15 40%的甘油蒸餾水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種煙草野火病菌分離方法，選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點(diǎn)切成“+”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3~1/2處；在凹槽中滴加150~300μL無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現(xiàn)象的凹玻片收集噴菌液；在無(wú)菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液100~200μL涂布于KMB培養(yǎng)基平板，在24~28℃下培養(yǎng)48~72h；在紫外光下選擇有綠色熒光的單菌落，經(jīng)致病力測(cè)定，形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標(biāo)菌落。本發(fā)明集分離、純化、鑒定為一體，分離病菌效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，適用于田間采樣的及時(shí)分離，分離病菌的純度高，保持了病菌野生型特性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103173393SQ201310087788
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者方敦煌, 陳學(xué)軍, 李永平, 肖炳光, 秦西云 申請(qǐng)人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院