專利名稱：利用鰒發(fā)光桿菌定量檢測(cè)氯霉素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)氯霉素的方法，特別是涉及一種利用海洋發(fā)光細(xì)菌/Vwto6a"er/M/w /efog"a/W YL 菌株進(jìn)行氯霉素定量檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)本發(fā)明人通過(guò)査閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，目前已知的海洋發(fā)光細(xì)菌只有三屬，分別是弧菌屬(l^n'o)， 明亮發(fā)光菌屬(P/io/o6a"eA7'"w)，及希瓦氏菌屬(幼ewa"e/Za)，陸地上則有異短桿菌屬(Ze oAaZ^ )。在 有氧的自然環(huán)境下，發(fā)光細(xì)菌可產(chǎn)生熒光素酶(LE)，催化黃素單核苷酸(FMNH2)及長(zhǎng)鏈脂肪醛類發(fā)生 氧化反應(yīng)，而發(fā)出藍(lán)綠色的熒光。
目前在我國(guó)應(yīng)用較廣的是明亮發(fā)光桿菌(尸toto6acten'鵬p/K^tore鵬)，利用明亮發(fā)光桿菌進(jìn)行環(huán)境 污染物檢測(cè)的研究有所報(bào)道。而除了明亮發(fā)光桿菌以外，均沒(méi)有利用其他種屬的發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行環(huán)境污染物 檢測(cè)的報(bào)道。本發(fā)明中涉及的菌種鰒發(fā)光桿菌(尸/^o6a"m'鵬/e!'ogra決/)與明亮發(fā)光桿菌(尸tototoc er/願(yuàn) /7//os/^we"加)為同屬異種，在菌體形態(tài)特征、生理生化特征及16SrDNA序列上二者均有很大差異。該菌 株尸/wtotocto7'wm fe/ogna^' YL表現(xiàn)出穩(wěn)定的發(fā)光性能，對(duì)氯霉素敏感，可以定量檢測(cè)氯霉素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用一株來(lái)源于海洋環(huán)境的發(fā)光細(xì)菌菌株iVw otoc/en'"附/eZogwfW YL (鰒發(fā)光桿菌 YL)進(jìn)行氯霉素的定量檢測(cè)。
本發(fā)明分離純化出一株來(lái)源于海洋環(huán)境的發(fā)光細(xì)菌YL為革蘭氏陰性桿菌，被鑒定為鰒發(fā)光桿菌 (尸/wtoto"e/7'ww fe/ogwaf/H')。該菌株于2006年12月27日委托中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC) 保藏，保藏號(hào)為M 206139。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，存取號(hào)為 EF017227。該菌株具有發(fā)光特性，能夠用來(lái)定量檢測(cè)氯霉素。
本發(fā)明利用該菌株具有生長(zhǎng)快、發(fā)光性能穩(wěn)定、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低、對(duì)氯霉素敏感的特點(diǎn)以及氯霉素濃度 與該菌株/^ototo"m'鵬to'og"WW YL發(fā)光強(qiáng)度抑制率呈正比的特點(diǎn)，通過(guò)選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)、發(fā)光細(xì)菌 的最佳生長(zhǎng)狀態(tài)、起始發(fā)光強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等指標(biāo)，建立定量檢測(cè)氯霉素的方法體系(接種 戶/e/og"a^' YL單菌落于150mL液體培養(yǎng)基中，26°C ， 150r/m搖床培養(yǎng)。在P/e/ogwafW YL菌液的發(fā)光強(qiáng) 度處于3.0X10S左右時(shí)，作為氯霉素檢測(cè)的菌液。菌液和受試物搖床培養(yǎng)30min后，于微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x中 在474nm下測(cè)量發(fā)光值，時(shí)間為30s。)，實(shí)現(xiàn)對(duì)氯霉素的定量檢測(cè)。利用本發(fā)明檢測(cè)氯霉素具有成本低、 操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠滿足氯霉素的快速定量檢測(cè)的需要。


附圖1發(fā)光細(xì)菌YL的發(fā)光光譜圖。
附圖2氯霉素濃度與發(fā)光強(qiáng)度抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
將Pto'ogwa WYL單菌落接于150mL液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、 FePO40.1g、 NaCl 20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml), 26°C ， 150r/m搖床培養(yǎng)6h左右，待發(fā)光值達(dá)到2.0X 105—4.0X 105 時(shí)，將菌液分別移至氯霉素濃度為0， 0.1ng/mL， 0.2ng/mL， 0.4ng/mL， 0.6ng/mL， 0.8ng/mL， 1.0ng/mL 的試管中，反應(yīng)體系中氯霉素5mL，菌液5mL?；旌暇鶆蚝笥?6'C， 150r/m搖床培養(yǎng)30min，測(cè)定發(fā)光 值。繪制氯霉素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖l)
3實(shí)施例2 魚肉前處理方法
(1) 將魚臟取出，剝除魚皮，勻漿。將魚漿每袋20.0g分裝在小包裝袋中，備用。
(2) 將冷凍的魚肉解凍，稱取5.0g到50mL離心管中，向離心管中加入標(biāo)準(zhǔn)CAP溶液(濃度為10ng/mL) 50uL，相當(dāng)于加標(biāo)后魚肉中氯霉素濃度為0.1ng/g，做三組平行。
(3) 將各離心管中樣品混勻lmin。
(4) 每個(gè)離心管中加20mL乙酸乙酯，混勻lmin，超聲10min，離心5min (4000r/m)。
(5) 將上清液倒入雞心瓶，4(TC水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。
(6) 加入lmL甲醇渦旋混合溶解殘留物。
(7) 加入15mL正己烷混合均勻，再加入25mL4%NaCl溶液，振蕩混合，提取脂肪。
(8) 將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，4000r/m，離心5min，棄去上層正己烷。
(9) 水相中加入10mL乙酸乙酯，混合2min，離心5min (4000r/m)。
(10) 吸取乙酸乙酯層于50ml雞心瓶中，40'C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。
(11) 向雞心瓶中加入5mL雙蒸水，渦旋混合lmin,將其轉(zhuǎn)移至試管中，待檢測(cè)使用。
實(shí)施例3
將冷凍的魚肉解凍，稱取5.0g到50mL離心管中，依次向離心管中加入標(biāo)準(zhǔn)CAP溶液(濃度為10ng/mL ) 50 u L、 100 u L、 200 u L、 30 u L、 400 u L、 500 u L，加標(biāo)后魚肉中的氯霉素濃度為0.lng/g、 0.2ng/g、 0.4ng/g、 0.6ng/g、 0.8ng/g、 1.0ng/g，每個(gè)濃度做六組平行。
樣品中加入氯霉素溶液后按照實(shí)施例2進(jìn)行前處理。
接種戶fe/og"WfeYL單菌落于150mL液體培養(yǎng)基中，放入搖床培養(yǎng)，搖床參數(shù)設(shè)置26°C， 150r/m。 在Pte'og"^W YL菌液的發(fā)光強(qiáng)度處于3.0X 105左右時(shí)，向每支裝有5mL加標(biāo)回收的氯霉素溶液的試管中 加入5mL菌液，每種處理方法再做一組標(biāo)準(zhǔn)溶液空白對(duì)照，即將5mL菌液加入裝有5mL雙蒸水的試管中， 放入搖床培養(yǎng)30min后，于微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x中在474nm下測(cè)量發(fā)光值，時(shí)間為30s。
表1所示，在樣品檢測(cè)中，當(dāng)添加濃度為0.2 ng/g， 0.4 ng/g時(shí)回收率為67.59%和75.62%，隨著添加 濃度的逐漸增加，0.6 ng/g， 0.8 ng/g， 1.0 ng/g的回收率達(dá)到90%以上，精密度在4.95%-10.99°/。之間，可 以滿足氯霉素殘留檢測(cè)要求。
表l不同氯霉素添加濃度在魚肉中的回收率(n=6)
添加濃度(ng/g)測(cè)定抑制率(％)測(cè)定值(ng/g)回收率(％)RSD (%)
0.117.890.0440.347.39
0.220,680.135767.594.95
0.425.660.30275.628.75
0.633.470.56594,119.91
0,843.870.914114.267.98
1.046.280.99599.4910.99
權(quán)利要求
1 利用海洋發(fā)光細(xì)菌Photobacterium leiognathi YL菌株進(jìn)行氯霉素定量檢測(cè)的方法，其特征是起始發(fā)光強(qiáng)度處于3.0×105左右時(shí)，作為氯霉素檢測(cè)的菌液。菌液和受試物作用時(shí)間為30min微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x中在474nm下測(cè)量發(fā)光值。
全文摘要
本發(fā)明的目的是利用鰒發(fā)光桿菌YL進(jìn)行氯霉素的定量檢測(cè)。本發(fā)明分離純化出一株來(lái)源于海洋環(huán)境的鰒發(fā)光桿菌YL，該菌種為革蘭氏陰性桿菌。該菌株于2006年12月27日委托中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)保藏，保藏號(hào)為M 206139。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，存取號(hào)為EF017227。本發(fā)明利用該菌株生長(zhǎng)快、發(fā)光性能穩(wěn)定、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低、對(duì)氯霉素敏感的特點(diǎn)以及氯霉素濃度與該菌株發(fā)光強(qiáng)度抑制率呈正比的特點(diǎn)，通過(guò)選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)、最佳生長(zhǎng)狀態(tài)、起始發(fā)光強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等指標(biāo)，建立定量檢測(cè)氯霉素的方法體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)氯霉素的定量檢測(cè)。利用本發(fā)明檢測(cè)氯霉素具有成本低、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠滿足氯霉素的快速定量檢測(cè)的需要。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101685066SQ20081014009
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者朱蘭蘭, 洪 林, 王亞群, 王靜雪 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)