一種甜瓜果實(shí)表面拮抗菌的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種甜瓜果實(shí)表面拮抗菌的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)新鮮水果和蔬菜因采后病害造成的損失可達(dá)總產(chǎn)值的20%_40%，因此研究并建立果蔬采后病害的防治方法具有重要的實(shí)際意義。植物病原真菌是引起果蔬采后病害的主要病原，長(zhǎng)期以來(lái)化學(xué)殺菌劑是控制采后病害的主要方法，然而這些化學(xué)合成物污染環(huán)境，對(duì)食品及人類有副作用，并且易造成真菌的抗藥性，因此人們正在尋求新的更為安全的方法來(lái)取代這些化學(xué)殺菌劑。生物防治技術(shù)應(yīng)用于控制果蔬采后真菌性病害是取代化學(xué)殺菌劑非常有潛力的措施。篩選果蔬表面天然的拮抗微生物，研究其生防潛能，對(duì)發(fā)展果蔬采后病害的生物防治技術(shù)和開發(fā)生物保鮮劑有著重要的指導(dǎo)意義。
[0003]拮抗菌的篩選是生物防治中關(guān)鍵的一步，適當(dāng)?shù)暮Y選方法有助于增加獲得這類有益微生物的可能性。通常人們利用拮抗菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行篩選，如:產(chǎn)生抗生素或毒素，寄生作用，競(jìng)爭(zhēng)或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。該方法首先需要分離到大量菌株，再經(jīng)過(guò)各菌株對(duì)病原菌進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)后選到目標(biāo)菌，篩選方法耗時(shí)，隨機(jī)性高，操作繁瑣。隨著基因序列分析技術(shù)的進(jìn)步，PCR擴(kuò)增拮抗菌編碼抗性物質(zhì)基因的手段提高了拮抗菌的篩選水平，但相應(yīng)的分離成本也增加了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種甜瓜果實(shí)表面拮抗菌的篩選方法，能夠簡(jiǎn)單快捷地篩選出甜瓜表面的拮抗細(xì)菌。
[0005]為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
本發(fā)明首先對(duì)果實(shí)表面細(xì)菌的分離，然后進(jìn)行拮抗菌的篩選，最后進(jìn)行抗菌革蘭氏染色后在電子顯微鏡下觀察記錄拮抗菌對(duì)甜瓜上鏈格孢菌和鐮刀菌的拮抗作用，篩選出抑菌效果最好的拮抗菌。
[0006]本發(fā)明所述的果實(shí)表面細(xì)菌的分離為采用無(wú)菌水于無(wú)菌條件下清洗果實(shí)表面，菌落直徑達(dá)3mm以上的細(xì)菌數(shù)量并篩選純化。
[0007]本發(fā)明所述的拮抗菌的篩選方法十字交叉對(duì)峙法。
[0008]本發(fā)明所述的十字交叉對(duì)峙法為在PDA培養(yǎng)基平板上十字接種所分離細(xì)菌菌株，再將培養(yǎng)的病原真菌(灰霉菌、鏈格孢菌、鐮刀菌和粉紅單端孢菌)打孔成直徑5_的菌碟，貼片于距中心等距的十字的四角，25°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4d后測(cè)量比較病原真菌菌落直徑大小。
[0009]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明采用十字交叉對(duì)峙法篩選甜瓜表面的拮抗細(xì)菌，較傳統(tǒng)方法更加簡(jiǎn)便，成本低廉。將抑菌效果最好的拮抗菌無(wú)菌懸液處理甜瓜后，甜瓜果實(shí)表面致病菌鏈格孢菌和鐮刀菌的生長(zhǎng)受到抑制，且果實(shí)內(nèi)部果肉無(wú)明顯腐爛現(xiàn)象，因此，從甜瓜表面分離篩選的拮抗菌對(duì)甜瓜果實(shí)采后病害的防治具有一定的效果。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述:
具體實(shí)施例1:
1、果實(shí)表面細(xì)菌的分離
取各品種甜瓜果實(shí)10?15個(gè),分別用100 ml無(wú)菌水于無(wú)菌條件下清洗果實(shí)表面5min,清洗液按照平板稀釋法涂布LB平板，37°C培養(yǎng)24h后，記錄菌落直徑達(dá)3mm以上的細(xì)菌數(shù)量并篩選純化。
[0011]2、拮抗菌的篩選
采用十字交叉對(duì)峙法篩選果實(shí)表面拮抗菌。在PDA培養(yǎng)基平板上十字接種所分離細(xì)菌菌株，再將培養(yǎng)7d的4種病原真菌(灰霉菌、鏈格孢菌、鐮刀菌和粉紅單端孢菌)打孔成直徑5mm的菌碟，貼片于距中心等距的十字的四角，25°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4d后測(cè)量比較病原真菌菌落直徑大小。
[0012]3、抗菌革蘭氏染色
用接種針挑取少量菌苔，涂布在干凈玻片上的一滴無(wú)菌水中，風(fēng)干固定；用結(jié)晶紫的混合液染Imin后，水洗；碘液作用lmin，水洗，吸干；95%乙醇或丙酮乙醇溶液脫色，流滴至洗脫液無(wú)色(約30s);番紅液復(fù)染2?3min，水洗，風(fēng)干，油鏡觀察。
[0013]4、電子顯微鏡觀察
JE0L-100CX透射電子顯微鏡上觀察拮抗菌株菌體形態(tài)，拍照記錄。
[0014]5、拮抗菌對(duì)甜瓜上鏈格孢菌和鐮刀菌的拮抗作用
取lX108cell/ml最佳菌株的無(wú)菌水懸液浸泡甜瓜果實(shí),30min后取出自然浙干,滅菌大頭針刺傷，濾紙片法接種滴有20 μ I IX 106spores/ml鏈格孢菌和鐮刀菌的孢子懸浮液，密閉濕室放置，室溫培養(yǎng)5d，測(cè)量果實(shí)表面的病斑直徑，計(jì)算病情指數(shù)。篩選出抑菌效果最好的拮抗菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種甜瓜果實(shí)表面拮抗菌的篩選方法，其特征在于:本發(fā)明首先對(duì)果實(shí)表面細(xì)菌的分離，然后進(jìn)行拮抗菌的篩選，最后進(jìn)行抗菌革蘭氏染色后在電子顯微鏡下觀察記錄拮抗菌對(duì)甜瓜上鏈格孢菌和鐮刀菌的拮抗作用，篩選出抑菌效果最好的拮抗菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果實(shí)表面細(xì)菌的分離方法，其特征在于:采用無(wú)菌水于無(wú)菌條件下清洗果實(shí)表面，菌落直徑達(dá)3mm以上的細(xì)菌數(shù)量并篩選純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的十字交叉對(duì)峙法，其特征在于:在PDA培養(yǎng)基平板上十字接種所分離細(xì)菌菌株，再將培養(yǎng)的病原真菌(灰霉菌、鏈格孢菌、鐮刀菌和粉紅單端孢菌)打孔成直徑5mm的菌碟，貼片于距中心等距的十字的四角，25°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4d后測(cè)量比較病原真菌菌落直徑大小。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甜瓜果實(shí)表面拮抗菌的篩選方法，本發(fā)明首先對(duì)果實(shí)表面細(xì)菌的分離，然后采用十字交叉對(duì)峙法進(jìn)行拮抗菌的篩選，最后進(jìn)行抗菌革蘭氏染色后在電子顯微鏡下觀察記錄拮抗菌對(duì)甜瓜上鏈格孢菌和鐮刀菌的拮抗作用，篩選出抑菌效果最好的拮抗菌。本發(fā)明采用十字交叉對(duì)峙法篩選甜瓜表面的拮抗細(xì)菌，較傳統(tǒng)方法更加簡(jiǎn)便，成本低廉。將抑菌效果最好的拮抗菌無(wú)菌懸液處理甜瓜后，甜瓜果實(shí)表面致病菌鏈格孢菌和鐮刀菌的生長(zhǎng)受到抑制，且果實(shí)內(nèi)部果肉無(wú)明顯腐爛現(xiàn)象，因此，從甜瓜表面分離篩選的拮抗菌對(duì)甜瓜果實(shí)采后病害的防治具有一定的效果。
【IPC分類】C12N1-20
【公開號(hào)】CN104694407
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310639525
【發(fā)明人】劉繼軍
【申請(qǐng)人】劉繼軍
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2013年12月4日