本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，特別涉及一種血液游離dna保護(hù)劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

游離核酸最早由mandel和metais于1947年發(fā)現(xiàn)，但由于缺乏高靈敏性和高特異性的實驗方法，導(dǎo)致有關(guān)血液中游離dna與疾病相關(guān)性的研究在較長時期內(nèi)進(jìn)展緩慢。直到有效分離游離dna技術(shù)、pcr檢測技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，使這一領(lǐng)域的研究在最近二十多年得到了較迅速發(fā)展。自發(fā)現(xiàn)血液中游離dna可含腫瘤細(xì)胞dna相同基因突變后，應(yīng)用分子生物學(xué)手段對循環(huán)游離核酸的研究的興趣日益增加。但是這些游離的dna在常溫液體形勢下很容易就降解消失，因此一種有效可行的延長血液游離dna保存期限的保護(hù)劑是非常需要的。

目前，市面上存在著各種各樣的采血管，這些采血管中應(yīng)用的許多化學(xué)試劑和物理方法都只是起到防止血液凝固的作用，而沒有起到保護(hù)游離核酸的作用。在臨床過程中，由于條件或時間的限制，無法在得到血液后第一時間分離血漿，血液中的細(xì)胞破裂和長時間的無保護(hù)暴露狀態(tài)會導(dǎo)致血液中游離的dna降解，造成無法進(jìn)行后續(xù)實驗或?qū)嶒灲Y(jié)果的假陰性，從而無法為臨床提供有價值的信息。

有鑒于此，本文發(fā)明一種可有效防止血液細(xì)胞破裂，保護(hù)血液游離dna的血液保護(hù)劑，以減少對后續(xù)檢驗檢測的干擾。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決常規(guī)采血管中的不能有效地保護(hù)游離dna，延長標(biāo)本的保存期限的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種血液游離dna保護(hù)劑，該保護(hù)劑不僅能防止血液凝固，而且能夠保護(hù)其中游離的dna。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種血液游離dna保護(hù)劑，所述保護(hù)劑由edta-3k、idu、glycine、bestain、aebsf溶解在水中形成的溶液，其中edta-3k、idu、glycine、bestain、aebsf在所述溶液中的濃度分別為30g~100g/l、200~600g/l、10~60g/l、0.05~0.3g/l、0.05~0.4g/l，采集的血液與血液游離dna保護(hù)劑之間以比值在（80~100）:（1~4）之間的比例混合均勻，室溫保存。

本發(fā)明所述的制備血液游離dna保護(hù)劑的方法，具體步驟如下：

1）將每一種組分稱取適宜的量到容器中；

2）加入適當(dāng)?shù)碾p蒸水溶解所有組分，然后全量轉(zhuǎn)移到容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗滌液全量轉(zhuǎn)移到容量瓶中，最后使用雙蒸水定容。

本發(fā)明的有益效果在于：

采集的血液，用本發(fā)明的血液游離dna保護(hù)劑保存，可以達(dá)到第一時間保護(hù)血液中的游離dna，可以有效防止血液細(xì)胞破裂，更好地保證標(biāo)本dna的完整性，減少臨床使用中對后續(xù)檢驗檢測的干擾，同時能延長血液標(biāo)本的有效保存期限，能夠使血液中游離的dna在常溫保存14天之久。

附圖說明

圖1為全血置于本文所述的游離核酸保護(hù)劑中保存0天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖2為全血置于本文所述的游離核酸保護(hù)劑中保存3天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖3為全血置于本文所述的游離核酸保護(hù)劑中保存7天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖4為全血置于本文所述的游離核酸保護(hù)劑中保存14天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖5為全血置于edta-na2采血管中保存0天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖6為全血置于edta-na2采血管中保存3天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖7為全血置于edta-na2采血管中保存7天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

圖8為全血置于edta-na2采血管中保存14天后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果。

具體實施方式：

以下實施案例僅用于解釋本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明所述的血液游離dna保護(hù)劑的制備方法如下：

1）將每一種組分稱取適宜的量到容器中；

本發(fā)明所述的血液游離dna保護(hù)劑是由edta-3k、idu、glycine、bestain、aebsf溶解在水中形成的溶液，其中edta-3k、idu、glycine、bestain、aebsf在所述溶液中的濃度分別為50g/l、550g/l、30g/l、1mg/l、0.172g/l、0.24g/l。

2）假設(shè)制備1l的血液游離dna保護(hù)劑，先加入500ml的雙蒸水溶解所有組分，然后全量轉(zhuǎn)移到1l容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗滌液全量轉(zhuǎn)移到容量瓶中，最后使用雙蒸水定容至1l。

使用方法:

血液游離dna保護(hù)劑在血液游離dna保存的應(yīng)用中，采集的血液與血液游離dna保護(hù)劑以100:2的比例緩慢充分混合均勻，室溫保存。

實施例1：使用本發(fā)明的血液游離dna保護(hù)劑與常規(guī)的edta-na2采血管的對比試驗。

隨機(jī)抽取8例全血樣本，分別按5ml/人份分成8人份，其中4人份為1組，分成2組。其中1組置于常規(guī)edta-na2采血管中，另1組置于本發(fā)明所述的血液游離dna保護(hù)劑中，分別常溫放置0天、3天、7天、14天后進(jìn)行核酸提?。╭iagen公司的qiaampdnabloodminikit(50)-貨號51104試劑盒），以提取的核酸為樣本進(jìn)行人β-actb基因的實時熒光pcr檢測。

檢測結(jié)果：

置于常規(guī)edta-na2采血管和本發(fā)明所述的血液游離dna保護(hù)劑中的全血樣本，在常溫放置不同時間后，分別進(jìn)行核酸提取，提取的核酸進(jìn)行人β-actb基因的實時熒光pcr檢測，其檢測結(jié)果的ct值如表1。

表1

由表1可知，血液游離dna保護(hù)劑能夠在14天內(nèi)有效地保護(hù)血液中游離的dna，只有極其輕微的降解；而常規(guī)edta-na2采血管只能維持3天的穩(wěn)定性且降解情況比較嚴(yán)重。

圖1~圖8為表1對應(yīng)的人β-actb基因的實時熒光pcr檢測結(jié)果圖，其中圖1~圖4為全血置于本文所述的游離核酸保護(hù)劑中保存不同時間后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果圖，由圖可知，在0~14天的檢測時間內(nèi)，所有檢測樣本都被正確檢出，且穩(wěn)定性良好，血液中的游離核酸得到了有效的保護(hù)；圖5~圖8為全血置于常規(guī)edta-na2采血管中保存不同時間后進(jìn)行核酸提取，提取得到的核酸進(jìn)行β-actb基因?qū)崟r熒光pcr的檢測結(jié)果圖，檢測結(jié)果顯示，常規(guī)edta-na2采血管中的游離核酸只能保持3天的穩(wěn)定性，降解情況十分嚴(yán)重。

上述實施例只是對本發(fā)明方案的舉例說明或解釋，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明方案的限制，顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。倘若這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則皆應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。