本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中通過(guò)高通量測(cè)序?qū)ξ⑸锶郝涠康姆椒?，尤其是菌群含量眾多的?fù)雜微生物群落，通過(guò)高通量測(cè)序手段快速處理數(shù)據(jù)得到窖泥微生物群落中乳酸桿菌(lactobacillus)的相對(duì)含量，并把該相對(duì)含量數(shù)值作為判斷窖泥質(zhì)量好壞的依據(jù)的方法。

背景技術(shù)：

中國(guó)傳統(tǒng)的白酒釀造歷史淵源留長(zhǎng)，操作工藝復(fù)雜，最終產(chǎn)出的白酒質(zhì)量受到發(fā)酵工藝、釀酒微生物群落的共同影響。在釀酒原材料和發(fā)酵工藝操作條件一樣的情況下，作為釀酒核心動(dòng)力的釀酒微生物群落顯得尤為重要。與釀酒相關(guān)的微生物來(lái)源，包括大曲、窖泥、酒醅和釀酒過(guò)程中來(lái)自于水、空氣中的微生物。在釀酒工藝中，整個(gè)廠區(qū)的大曲統(tǒng)一生產(chǎn)，統(tǒng)一隨著釀酒原材料糧食統(tǒng)一混勻進(jìn)行生產(chǎn)，然后統(tǒng)一分運(yùn)到不同窖池進(jìn)行發(fā)酵，因而客觀來(lái)說(shuō)，大曲的質(zhì)量不會(huì)對(duì)不同窖池之間的發(fā)酵質(zhì)量差異產(chǎn)生很大影響。其次，在同一廠區(qū)的小范圍內(nèi)，水質(zhì)和環(huán)境變化不大，即使有所差異也不是人為可以調(diào)控的。而酒醅微生物群落實(shí)際上是由大曲和經(jīng)過(guò)蒸餾前處理后的原材料混合后得到，在發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物群落與窖泥微生物群落之間存在互動(dòng)，經(jīng)過(guò)2-3個(gè)月的發(fā)酵形成最終發(fā)酵成熟的酒醅，最終對(duì)成熟酒醅經(jīng)過(guò)蒸餾才產(chǎn)生了不同質(zhì)量的酒。因此，酒醅微生物群落在發(fā)酵過(guò)程中不斷變化，而且受到窖泥微生物群落的影響。

申請(qǐng)人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，排除發(fā)酵過(guò)程中人為操作的失誤，濃香型白酒[gb/t10781.1-2006]優(yōu)質(zhì)窖池與普通窖池的發(fā)酵完成后的酒醅微生物群落差異很小，而優(yōu)質(zhì)窖池和普通窖池的窖泥微生物群落卻相差很大，尤其是其中的乳酸桿菌(lactobacillus)的含量差異尤其大，因而窖泥中的單獨(dú)乳酸桿菌這個(gè)屬的含量就可以作為鑒定窖泥質(zhì)量的依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于判斷濃香型白酒窖泥質(zhì)量的方法，本發(fā)明通過(guò)高通量測(cè)序測(cè)定窖泥中微生物群落組成并根據(jù)測(cè)序結(jié)果計(jì)算菌群中的乳酸桿菌的含量相對(duì)于原核菌群總數(shù)的比例，進(jìn)而判斷濃香型白酒窖泥質(zhì)量。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種通過(guò)窖泥微生物群落中乳酸桿菌的含量判斷窖泥質(zhì)量的方法，該方法包括以下幾步：

⑴濃香型白酒窖泥樣本宏基因組的提??；

⑵窖泥樣本宏基因組16srdna高通量測(cè)序；通過(guò)一系列程序?qū)颖局械?6srdna序列進(jìn)行高通量測(cè)序：利用通用引物pcr擴(kuò)增16srdna序列；pcr產(chǎn)物上高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序；

⑶測(cè)序序列的優(yōu)化，去除兼并堿基多的序列，偏短序列以及嵌合體序列；

⑷序列信息的注釋：對(duì)優(yōu)化所得的序列使用97％的相似度進(jìn)行劃分otu，選取各otu中含量最多的序列為該otu的代表序列，然后對(duì)各otu使用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列信息的注釋；

序列信息的注釋是指首先對(duì)所有16srdna序列進(jìn)行聚類，根據(jù)各序列之間的相似度劃分otu，隨機(jī)抽取一個(gè)序列默認(rèn)為第一個(gè)otu，下一個(gè)序列如果與該序列相似度≥97％，即表示該序列同屬于第一個(gè)otu，如果相似度＜97％則作為下一個(gè)otu的序列，依次類推；選取出現(xiàn)次數(shù)最多的那條序列作為該otu的代表序列；然后使用優(yōu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各otu代表序列進(jìn)行注釋，根據(jù)注釋的信息，就可以知道該16srdna序列的來(lái)源菌的門，綱，目，科，屬，甚至到種的信息；

⑸在屬的層級(jí)上統(tǒng)計(jì)出各otu中注釋到乳酸桿菌lactobacillus的序列總數(shù)占樣本總菌群測(cè)序數(shù)量的比例；

根據(jù)步驟⑸的注釋信息，就知道樣本中有哪些otu的注釋信息為乳酸桿菌，又知道每個(gè)otu含有多少條序列，就可以統(tǒng)計(jì)出總共多少條序列注釋到乳酸桿菌，然后用注釋到乳酸桿菌的總數(shù)除以該樣本測(cè)序所得優(yōu)化后的16srdna序列總數(shù)，即得到乳酸桿菌的比例；

⑹根據(jù)⑸中所得到的乳酸桿菌的比例大小判斷樣本來(lái)源的窖泥質(zhì)量為優(yōu)質(zhì)窖泥還是普通窖泥；其中，乳酸桿菌的含量百分比＜10％即為優(yōu)質(zhì)窖泥；如果含量百分比＞20％，即為普通窖泥。

而且，所述16srdna序列為某個(gè)可變區(qū)區(qū)，或者全長(zhǎng)。

而且，所述高通量測(cè)序序列優(yōu)化處理，去掉序列長(zhǎng)度明顯低于目標(biāo)序列長(zhǎng)度的序列，去掉兼并堿基數(shù)量太多的序列，去掉嵌合體序列。

而且，優(yōu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)包括rdp，silva，greengenes。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：

1、窖泥樣本中微生物種類繁多復(fù)雜，研究功能微生物群落的功能需要首先了解其基本的微生物組成，以及重點(diǎn)的探究其中幾種核心功能微生物的含量。本發(fā)明正是對(duì)窖泥微生物群落分析中的質(zhì)量判斷問(wèn)題提出一套解決方案，得以實(shí)現(xiàn)對(duì)窖泥質(zhì)量的判斷。

2、本發(fā)明的實(shí)施需要進(jìn)行16srdna可變區(qū)高通量測(cè)序，現(xiàn)在測(cè)序成本已經(jīng)很低，而且將來(lái)會(huì)越來(lái)越低，本發(fā)明的實(shí)用性隨著測(cè)序的容易程度提高會(huì)越來(lái)越廣泛。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中窖泥取樣的“九點(diǎn)取樣法”。

圖2為實(shí)施例中計(jì)算的各樣本中乳酸桿菌的含量百分比。

具體實(shí)施方式

以下為在某濃香型白酒生產(chǎn)廠區(qū)內(nèi)采取12個(gè)窖泥樣本，并通過(guò)高通量測(cè)序的方法判斷其中乳酸桿菌(lactobacillus)含量百分比，并根據(jù)該百分比判定窖泥樣本質(zhì)量的優(yōu)劣。本專利以此為例對(duì)本發(fā)明做詳述，但不限于實(shí)施例。

一種用于判斷濃香型白酒發(fā)酵窖泥質(zhì)量的方法，包括以下步驟：

⑴窖泥樣本中的全基因組提取及其16srdna高通量測(cè)序；

首先使用合適的土壤基因組提取試劑盒提取待測(cè)窖泥樣本中的宏基因組(天然微生物群落中往往含有成百上千種不同的微生物，它們的基因組混合在一起的基因組樣本稱之為宏基因組)。以宏基因組為模板，使用16srdna通用引物(本專利要求測(cè)序任何一個(gè)16srdna的可變區(qū)的通用引物都可以，擴(kuò)增目標(biāo)序列越長(zhǎng)越好)進(jìn)行擴(kuò)增(退火58℃，35個(gè)循環(huán)以內(nèi))，然后將pcr產(chǎn)物加接頭(接頭與選擇的高通量測(cè)序的方式有關(guān))，進(jìn)行高通量測(cè)序。

將通過(guò)高通量測(cè)序得到并進(jìn)行比對(duì)優(yōu)化，刪掉太短的序列(小于目標(biāo)測(cè)定序列長(zhǎng)度的80％)(可能來(lái)自于斷裂的pcr產(chǎn)物片段)，刪掉兼并堿基太多的序列，查詢其中的嵌合體序列(比如使用decipher網(wǎng)站http://decipher.cee.wisc.edu/findchimeras.html查詢)，刪掉嵌合體序列。

⑵高通量測(cè)序序列的分析及注釋；

將⑴中優(yōu)化得到的所有的核糖體rrna基因序列進(jìn)行聚類，根據(jù)各序列之間的97％的相似度劃分otu，隨機(jī)抽取一個(gè)序列默認(rèn)為第一個(gè)otu，下一個(gè)序列如果與該序列相似度≥97％，即表示該序列同屬于第一個(gè)otu，如果相似度＜97％則作為下一個(gè)otu的序列，依次類推；每個(gè)otu中選擇出現(xiàn)次數(shù)最多的那條序列作為該otu的代表序列。使用數(shù)據(jù)庫(kù)(rdp，silva，greengenes等.各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站如下：rdp[rdp.cme.msu.edu],greengenes[greengenes.secondgenome.com],silva[http://www.arb-silva.de])對(duì)每個(gè)otu進(jìn)行注釋，對(duì)序列注釋到門，綱，目，科，屬，甚至到種。不過(guò)受16srdna序列的保守性影響，很可能絕大多數(shù)序列只能注釋到屬及以下分類等級(jí)。上述幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)因?yàn)闅v史的原因，所收集的核糖體rrna基因序列在數(shù)量上和質(zhì)量上都有所不同，一般在遇到注釋困難或有歧義的序列時(shí)需要同時(shí)使用幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)以便得到最佳結(jié)果。

⑶16srdna高通量測(cè)序中乳酸桿菌(lactobacillus)的代表性序列(使用第四個(gè)可變區(qū)的通用引物520f和802r擴(kuò)增得到)：

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⑷窖泥樣本中乳酸桿菌(lactobacillus)的含量百分比計(jì)算；

根據(jù)⑵注釋信息，就可以知道樣本中有哪些otu的注釋信息為乳酸桿菌，又根據(jù)每個(gè)otu中的序列數(shù)，統(tǒng)計(jì)出樣本中注釋到乳酸桿菌的序列總數(shù)，然后用注釋到乳酸桿菌的總數(shù)除以該樣本測(cè)序所得優(yōu)化后的16srdna序列總數(shù)，即得到乳酸桿菌的比例。

⑸窖泥質(zhì)量的判斷；

根據(jù)⑶中得到的比例判斷窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣。如果樣本中乳酸桿菌的含量百分比＜10％即為優(yōu)質(zhì)窖泥；如果含量百分比＞20％，即為普通窖泥；如果含量百分比居于兩者中間則表示窖泥為中間狀態(tài)。

實(shí)施例1

窖泥樣本中的全基因組提取及其16srdna高通量測(cè)序：

⑴取樣。在某釀酒公司廠區(qū)范圍內(nèi)選取12個(gè)窖池按照?qǐng)D1的九點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣。每個(gè)位點(diǎn)取大小為2cm×2cm×2cm的窖泥，然后將9塊窖泥混合均勻后的窖泥塊作為該窖泥的一個(gè)樣本。

⑵基因組提取。根據(jù)試劑盒要求，稱取窖泥樣本樣品200毫克，采用solarbio土壤基因組試劑盒或上海生工ezup柱式土壤基因組抽提試劑盒方法提取基因組，最后洗脫體積為100μl?；蚪M模板樣品(10-50ng/ul)-80℃冷藏備用。剩余窖泥樣本可以塑料袋密封在-80℃冰箱保存1-2年。

⑶高通量測(cè)序。以⑵中所提取的基因組為模板進(jìn)行16srdna擴(kuò)增，其擴(kuò)增引物為16srdna通用引物(16srdna可變區(qū)的通用引物都可以，比如：16srdna全長(zhǎng)序列的引物為27f5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’；第四可變區(qū)v4區(qū)的引物為：520f5’-gcacctaaytgggydtaaagng-3’和802r5’-tacnvgggtatctaatcc-3’)，然后對(duì)16srdna的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后上高通量測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。(此步一般委托擁有大型高通量測(cè)序平臺(tái)的生物技術(shù)公司完成)

實(shí)施例2

高通量測(cè)序序列的分析及注釋

⑴高通量測(cè)序序列的優(yōu)化。經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序得到的序列不能直接進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，需要去接頭，刪掉長(zhǎng)度太長(zhǎng)(大于目標(biāo)測(cè)定序列長(zhǎng)度的110％)(可能是非目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物)或者太短(小于目標(biāo)測(cè)定序列長(zhǎng)度的80％)(可能來(lái)自于斷裂的pcr產(chǎn)物片段)的序列，刪掉兼并堿基數(shù)量超過(guò)2％的序列(測(cè)序質(zhì)量不高的序列)，刪掉嵌合體序列(以斷裂的pcr產(chǎn)物為引物擴(kuò)增形成的嵌合體序列，可以使用查詢工具確定哪些序列是嵌合體，比如可以使用mothur軟件中的uchime，或者通過(guò)decipher網(wǎng)站http://decipher.cee.wisc.edu/findchimeras.html查詢)。

⑵優(yōu)化后的序列進(jìn)行注釋。將⑴中優(yōu)化得到的所有的核糖體rrna基因序列進(jìn)行97％相似度(uclust)聚類劃分otu，其原則為隨機(jī)抽取一個(gè)序列默認(rèn)為第一個(gè)otu，下一個(gè)序列如果與該序列相似度≥97％，即表示該序列同屬于第一個(gè)otu，如果相似度＜97％則作為下一個(gè)otu的序列，依次類推；每個(gè)otu中選擇出現(xiàn)次數(shù)最多的那條序列作為該otu的代表序列。使用數(shù)據(jù)庫(kù)(rdp，silva，greengenes等)對(duì)每個(gè)otu進(jìn)行注釋，對(duì)序列注釋到門，綱，目，科，屬，甚至到種。

實(shí)施例3

窖泥樣本中乳酸桿菌(lactobacillus)的含量百分比計(jì)算

根據(jù)高通量測(cè)序中得到的注釋信息，統(tǒng)計(jì)出樣本所有注釋為乳酸桿菌(lactobacillus)的otu，把所有這些otu的序列累加，統(tǒng)計(jì)出樣本中注釋到乳酸桿菌的序列總數(shù)，然后用注釋到乳酸桿菌的總數(shù)除以該樣本測(cè)序所得優(yōu)化后的16srdna序列總數(shù)，即得到乳酸桿菌的比例。如圖2所示為各樣本中乳酸桿菌的含量百分比。從圖來(lái)看，乳酸桿菌含量大的超過(guò)60％，低的接近2％，差異非常大。

實(shí)施例4

窖泥樣本中乳酸桿菌(lactobacillus)的含量百分比計(jì)算

通過(guò)實(shí)際大量窖池的質(zhì)量數(shù)據(jù)建立本專利判定優(yōu)劣窖泥的標(biāo)準(zhǔn)：乳酸桿菌的含量百分比＜10％即為優(yōu)質(zhì)窖泥；如果含量百分比＞20％，即為普通窖泥；如果含量百分比居于兩者中間則表示窖泥為中間狀態(tài)。結(jié)合圖2的示例窖池信息可以判斷：na2～nb2五個(gè)窖泥樣本為優(yōu)質(zhì)窖泥；除去nc3之外的五個(gè)nc窖泥樣本為普通窖泥；窖泥樣本na1和nc3的質(zhì)量介于好與差之間。

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<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）

安徽瑞思威爾科技有限公司

<120>一種判斷濃香型白酒窖泥質(zhì)量的方法

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<213>16srdna高通量測(cè)序中乳酸桿菌（lactobacillus）的代表性序列

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