本發(fā)明屬于疾病診斷領(lǐng)域，涉及診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)，具體涉及血漿外泌體源性mirnas在制備早期診斷原發(fā)性肝癌的試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性肝癌(primayhepaticcancer，phc)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中居第三位，在世界上的發(fā)病率居第五位。原發(fā)性肝癌是高侵襲性的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，導(dǎo)致大多數(shù)患者就診較晚。中、晚期主要病征為右上腹疼痛、上腹脹滿、發(fā)熱、乏力、消瘦，晚期常有腹水、黃疸。在確診時(shí)往往已屬晚期，只有10％-30％患者能接受根治性切除手術(shù)，導(dǎo)致整體預(yù)后很差，一般平均存活時(shí)間只有3個(gè)月左右。這些患者大部分都是家庭經(jīng)濟(jì)支柱，因此，對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)有很大影響，有效的預(yù)防、及早的診斷和有效的治療十分重要。近年來(lái)，原發(fā)性肝癌治療效果有所提高，一個(gè)很重要的原因就是以甲胎蛋白(afp)為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)提高了早期診斷率，進(jìn)而提高了患者的早期處理比例。但用afp進(jìn)行篩查有局限性，有20％-30％的原發(fā)性肝癌患者afp呈陰性或低濃度水平。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的囊泡小體，其組成成分包括蛋白質(zhì)、mrna、mirna等多種物質(zhì)，能夠參與細(xì)胞間的物質(zhì)交換，在細(xì)胞的生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。外泌體在外周血、尿液、唾液等體液中具有很高的豐度，而不同組織來(lái)源的外泌體在組成和功能方面存在差異，這就為通過(guò)分析外泌體成分的變化來(lái)判斷疾病的變化提供了基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體是調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的重要方式之一，對(duì)腫瘤來(lái)源的外泌體成分的分析可以輔助腫瘤的早期診斷。最近，多項(xiàng)研究結(jié)果提示外周血中異常的mirna表達(dá)譜與某些特征性的腫瘤疾病密切相關(guān)，而外周血中相當(dāng)一部分mirna是以外泌體形式存在的，因此已有研究人員將外周血中外泌體源性mirna開(kāi)發(fā)為一種新型的疾病診斷標(biāo)志物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)原發(fā)性肝癌早期診斷的不足，以及現(xiàn)有的甲胎蛋白法對(duì)部分原發(fā)性肝癌患者靈敏度和特異性低的缺陷，提供一組用于早期診斷原發(fā)性肝癌的血漿外泌體源性mirnas標(biāo)記物，以用于制備早期診斷原發(fā)性肝癌的試劑盒。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：血漿外泌體源性mirnas聯(lián)合用于制備早期診斷原發(fā)性肝癌的試劑盒的用途，所述血漿外泌體源性mirnas由hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p和hsa-mir-613組成。一種用于早期診斷原發(fā)性肝癌的試劑盒，含有上述血漿外泌體源性mirnas的引物，所述引物包括將mirnas逆轉(zhuǎn)錄為cdna的逆轉(zhuǎn)錄引物和用于以cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增的上游引物、下游引物。優(yōu)選地，hsa-mir-466逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如seqidno.5所示，上游引物的序列如seqidno.9所示，下游引物的序列如seqidno.13所示。優(yōu)選地，hsa-mir-296-5p逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如seqidno.6所示，上游引物的序列如seqidno.10所示，下游引物的序列如seqidno.13所示。優(yōu)選地，hsa-mir-613逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如seqidno.7所示，上游引物的序列如seqidno.11所示，下游引物的序列如seqidno.13所示。優(yōu)選地，上述試劑盒還含有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和pcr擴(kuò)增反應(yīng)用到的酶和試劑。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的血漿外泌體源性mirnashsa-mir-466、hsa-mir-296-5p和hsa-mir-613聯(lián)合用于診斷原發(fā)性肝癌和非原發(fā)性肝癌(包括良性肝病和健康對(duì)照)的診斷性能優(yōu)異，準(zhǔn)確度和靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以用于開(kāi)發(fā)成早期診斷原發(fā)性肝癌的診斷試劑盒。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明三個(gè)目標(biāo)mirnas聯(lián)合用于診斷原發(fā)性肝癌和非原發(fā)性肝癌(包括良性肝病和健康對(duì)照)的roc曲線圖。具體實(shí)施方式下面就結(jié)合實(shí)施例具體介紹本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實(shí)驗(yàn)過(guò)程的描述無(wú)法做到非常詳細(xì)，凡是實(shí)驗(yàn)中未詳細(xì)描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。一、實(shí)驗(yàn)樣本1、測(cè)試集樣本122例各型肝病患者均為2014年3月至2015年3月間江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院門診或住院患者，其中原發(fā)性肝癌組(phc組)78例，良性肝病組44例(肝硬化14例，急性肝炎12例，慢性肝炎12例，脂肪肝6例)，原發(fā)性肝癌患者均經(jīng)病理學(xué)或影像學(xué)檢查證實(shí)。健康對(duì)照組36例，男20例，女16例，年齡20-84歲，平均年齡55.2±9.6歲，均為同期該院體檢正常并排除其他慢性疾病的健康者。phc組和非phc組(包括良性肝病和健康對(duì)照)性別年齡無(wú)顯著差異。2、驗(yàn)證集樣本134例各型肝病患者均為2014年3月至2015年3月間南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診或住院患者，其中原發(fā)性肝癌組(phc組)82例，良性肝病組52例(肝硬化14例，急性肝炎16例，慢性肝炎14例，脂肪肝8例)，原發(fā)性肝癌患者均經(jīng)病理學(xué)或影像學(xué)檢查證實(shí)。健康對(duì)照組42例，男20例，女22例，年齡21-82歲，平均年齡54.6±10.2歲，均為同期該院體檢正常并排除其他慢性疾病的健康者。phc組和非phc組(包括良性肝病和健康對(duì)照)性別年齡無(wú)顯著差異。所有樣本收集過(guò)程中，肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)和腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2011年制定的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。二、實(shí)驗(yàn)方法1、血漿樣本收集及血漿外泌體分離用edta抗凝管分別采集患者和健康對(duì)照的靜脈血5ml，靜置10min后，常溫下以3000r/min離心10min，可見(jiàn)分為兩層，用移液槍吸取上層透明淡黃色液體即血漿，分裝成1ml于1.5mlep管后，置于-80℃保存。使用invitrogen外泌體提取試劑盒提取血漿外泌體，按說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟如下：(1)樣品準(zhǔn)備：取出于-80℃存儲(chǔ)的血漿樣品置37℃水浴至完全液態(tài)，并置于冰上；室溫下2000×g離心20min去除細(xì)胞和碎片；用移液槍吸取上清液至新的離心管，室溫下10000×g離心20min以除去碎片；吸取上清液至新的離心管，并將其放置在冰上直至開(kāi)始分離。(2)外泌體分離：吸取適當(dāng)體積血漿至新離心管中，加入0.5×血漿體積的1×pbs，渦旋混勻樣本；加入0.2×(血漿體積+1×pbs體積)的外泌體沉淀試劑至樣品中，渦旋混勻血漿/試劑混合物；在室溫下孵育10min后，室溫下10000×g離心5min，用移液槍吸出上清液并丟棄，外泌體是試管底部的顆粒，將所得沉淀置于-80℃存儲(chǔ)。2、外泌體總rna提取(trizol法)及濃度測(cè)定往外泌體沉淀中加入1mltrizol，混勻后于4℃放置10min；按比例(1mltrizol:200μl氯仿)加入氯仿200μl，劇烈振蕩，4℃放置15min，4℃12000×g離心15min后吸取上層水相至新ep管；按比例(1mltrizol:500μl異丙醇)加入異丙醇500μl，混勻，4℃放置10min，4℃12000×g離心10min，棄上清，rna沉于管底；按比例(1mltrizol:1ml75％乙醇)加入75％乙醇1ml，溫和振蕩，4℃12000g離心5min，盡量棄上清(重復(fù)75％乙醇洗滌一次)，于室溫下晾干；加10μldepc水溶解rna，吸取2μlrna溶液用于測(cè)定濃度，其余置于-80℃保存。將2μlrna溶液在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定rna濃度，調(diào)節(jié)od260/od280于1.9-2.1間。3、qrt-pcr法測(cè)定目標(biāo)mirna相對(duì)濃度按照thermoscientific公司的revertaidfirststrandcdnasynthesiskit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cdna合成，20μl逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系如下：depc處理水13.8μl，總rna1μl，mirnastem-loopprimer0.25μl，revertaidfirststrandcdnasynthesiskit反應(yīng)體系包括buffer4μl，dntps0.5μl，rnase-inhibitor0.2μl，m-mlv0.25μl。置于pcr擴(kuò)增儀中預(yù)變性25℃5min，退火42℃60min，延伸70℃5min。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃短暫保存，或-70℃長(zhǎng)期保存。上述rna逆轉(zhuǎn)錄后即獲得mirna的cdna模板。按照美國(guó)rocheappliedscience公司的faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，10μl反應(yīng)體系如下：cdna0.2μl，上游引物和下游引物各0.3μl，faststartuniversalsybrgreenmaster5μl，depc處理水4.2μl，反應(yīng)條件：95℃變性15min，60℃退火延伸30s，50個(gè)循環(huán)。目標(biāo)mirnas和內(nèi)參mirna的逆轉(zhuǎn)錄引物和qrt-pcr引物序列如表1所示。表1目標(biāo)mirnas和內(nèi)參mirna的逆轉(zhuǎn)錄引物和qrt-pcr引物序列4、數(shù)據(jù)分析mirna表達(dá)量的處理方法為δct法。ct為反應(yīng)達(dá)到閾值時(shí)所需循環(huán)數(shù)，各mirna相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)量用方程2-δct表示，其中δct＝ct目標(biāo)mirna-ct內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用spss20.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)表示方法為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，組間比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以目標(biāo)mirnas的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量為自變量，組別為應(yīng)變量，建立肝癌診斷的logistic回歸模型，回歸模型的擬合度采用似然比檢驗(yàn)，回歸參數(shù)估計(jì)值采用wald檢驗(yàn)。根據(jù)roc曲線及曲線下面積(auc)評(píng)估目標(biāo)mirnas聯(lián)合診斷的敏感性和特異性。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、目標(biāo)mirnas在測(cè)試集樣本中的表達(dá)水平與健康對(duì)照組比，良性肝病組中血漿外泌體源性mirnashsa-mir-466、hsa-mir-296-5p和hsa-mir-613的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量2-δct均有上調(diào)，但上調(diào)不顯著；與健康對(duì)照組和良性肝病組比，原發(fā)性肝癌組中三個(gè)目標(biāo)mirnas的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量2-δct均顯著上調(diào)。于是，進(jìn)一步將測(cè)試集樣本分為原發(fā)性肝癌組(phc組)和非原發(fā)性肝癌組(非phc組，包括健康對(duì)照和良性肝病)。phc組相對(duì)于非phc組各mirnas的相對(duì)表達(dá)量的變化倍數(shù)如表2。表2phc組相對(duì)于非phc組各mirnas的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量的變化倍數(shù)目標(biāo)mirnas倍數(shù)p值hsa-mir-4663.840.0005hsa-mir-296-5p2.920.0017hsa-mir-6134.26＜0.00012、測(cè)試集目標(biāo)mirnas的roc曲線分析以測(cè)試集phc組和非phc組所有樣本中hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量作為自變量(設(shè)x1＝hsa-mir-466相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量，x2＝hsa-mir-296-5p相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量，x3＝hsa-mir-613相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量)，以組別作為應(yīng)變量(phc組設(shè)為1，非phc組設(shè)為2)，對(duì)hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613在phc組和非phc組樣本中的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量進(jìn)行二元邏輯回歸，得到二元邏輯回歸方程；再將各樣本中hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量代入該二元邏輯回歸方程，即可得到各個(gè)樣本的回歸值，以可能的回歸值作為診斷點(diǎn)，計(jì)算靈敏度和特異性，據(jù)此繪制roc曲線。邏輯回歸方程為：logit＝-4.482+0.282x1+0.134x2+1.236x3。模型擬合參數(shù)如表3。表3目標(biāo)mirnas聯(lián)合診斷phc的logistic模型擬合參數(shù)自變量系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤wald檢驗(yàn)p值or值hsa-mir-4660.2820.0037.2140.000.00hsa-mir-296-5p0.1340.00842.1870.011.02hsa-mir-6131.2360.13738.5260.001.68截距-4.4821.18632.2790.000.00roc曲線如圖1所示，roc曲線下面積為0.966，最佳cutoff值為0.638(診斷閾值)，最佳cutoff值處?kù)`敏度為96.24％，特異性為95.82％。roc曲線下面積auc作為診斷試驗(yàn)真實(shí)性評(píng)價(jià)的固有準(zhǔn)確度指標(biāo)已被普遍認(rèn)可，完全無(wú)價(jià)值的診斷試驗(yàn)auc為0.5，理想的診斷試驗(yàn)auc為1；一般認(rèn)為，auc在0.5-0.7之間時(shí)診斷價(jià)值較低，在0.7-0.9之間時(shí)具有一定的診斷價(jià)值，在0.9以上時(shí)診斷價(jià)值較高。因此，hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613聯(lián)合診斷phc和非phc具有較高診斷價(jià)值，且auc顯著優(yōu)于hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613單個(gè)用于診斷區(qū)分phc和非phc(auc分別為0.687、0.545、0.604)。3、驗(yàn)證集獨(dú)立驗(yàn)證目標(biāo)mirnas聯(lián)合診斷phc的準(zhǔn)確性在驗(yàn)證集中，基于二元邏輯回歸方程(logit＝-4.482+0.282x1+0.134x2+1.236x3)將驗(yàn)證集所有樣本中3個(gè)目標(biāo)micrornas的相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量作二元邏輯回歸變換，計(jì)算出所有樣本中3個(gè)目標(biāo)micrornas相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量的邏輯回歸值。低于最佳cutoff值0.638(診斷閾值)的預(yù)測(cè)為非phc，高于最佳cutoff值0.638的預(yù)測(cè)為phc，最后計(jì)算出以該3個(gè)目標(biāo)micrornas表達(dá)水平診斷phc的準(zhǔn)確率、靈敏度和特異性。hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613在驗(yàn)證集中聯(lián)合診斷phc的效能如表4。表4目標(biāo)mirnas在驗(yàn)證集中診斷phc的效能靈敏度特異性診斷準(zhǔn)確率98.7％(77/78)98.8％(79/80)98.7％(156/158)由上表可以看出，在驗(yàn)證集中，hsa-mir-466、hsa-mir-296-5p、hsa-mir-613聯(lián)合用于診斷phc的準(zhǔn)確度極高，達(dá)98.7％，158個(gè)樣本僅有2個(gè)樣本診斷錯(cuò)誤。上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的血漿外泌體源性mirnashsa-mir-466、hsa-mir-296-5p和hsa-mir-613聯(lián)合用于診斷原發(fā)性肝癌和非原發(fā)性肝癌(包括良性肝病和健康對(duì)照)的診斷性能優(yōu)異，準(zhǔn)確度和靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以用于開(kāi)發(fā)成早期診斷原發(fā)性肝癌的診斷試劑盒。上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明實(shí)質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，不應(yīng)將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于上述具體的實(shí)施例。sequencelisting<110>南京蓋斯夫醫(yī)藥科技有限公司<120>血漿外泌體源性mirnas在制備早期診斷原發(fā)性肝癌的試劑盒中的應(yīng)用<130>1<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>智人<400>1auacacauacacgcaacacacau23<210>2<211>21<212>dna<213>智人<400>2agggcccccccucaauccugu21<210>3<211>20<212>dna<213>智人<400>3aggaauguuccuucuuugcc20<210>4<211>22<212>dna<213>智人<400>4uagcagcacguaaauauuggcg22<210>5<211>56<212>dna<213>人工序列<400>5gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacatgtgtgt56<210>6<211>56<212>dna<213>人工序列<400>6gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacacaggatt56<210>7<211>56<212>dna<213>人工序列<400>7gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacggcaaaga56<210>8<211>56<212>dna<213>人工序列<400>8gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgaccgccaata56<210>9<211>31<212>dna<213>人工序列<400>9acactccagctgggatacacatacacgcaac31<210>10<211>31<212>dna<213>人工序列<400>10acactccagctgggagggccccccctcaatc31<210>11<211>31<212>dna<213>人工序列<400>11acactccagctgggaggaatgttccttcttt31<210>12<211>31<212>dna<213>人工序列<400>12acactccagctgggtagcagcacgtaaatat31<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列<400>13cgccgcagtgcgtgtcgtggagt23當(dāng)前第1頁(yè)12