本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程領域，具體涉及一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測方案。

背景技術：

線粒體dna(mtdna)突變是致聾的重要誘因，與環(huán)境因素一起影響耳聾發(fā)生。線粒體trna^ser(ucn)7444g＞a繼發(fā)突變位于mtdna環(huán)的輕鏈上trna^ser(ucn)前體3’端核酸外切酶的作用位點(圖一)附近，該突變通過更改重鏈上coi基因終止密碼子序列，使coi基因編碼的多肽在羧基末端增加3個氨基酸殘基，從而可能對trna的加工修飾產生影響。與mtdna7444g＞a突變位點相鄰的7445a＞g突變可引起trna前體的加工缺陷，致使trna的穩(wěn)定性和nd6mrna的產量顯著下降。在基因檢測中，血液是人類dna的良好來源，但采集血液對會損傷人的皮膚，并產生疼痛感，因此有研究者提出人類唾液中的口腔細胞可以作為另一個dna的良好來源。目前，已有相關研究開發(fā)出了口腔細胞的提取方法及口腔細胞dna的眾多應用。

目前對于突變檢測最常用方法為第一代測序測序技術，但此技術對儀器要求高，操作繁瑣且成本昂貴，結果誤差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；pcr-限制性片段長度多態(tài)性(pcr-rflp)是目前應用較廣泛、相對成熟的檢測方法，但操作繁瑣，操作過程中影響結果的不確定因素太多；近年來，變性高效液相色譜(dhplc)和基因芯片的應用為點突變檢測提供了思路，檢測技術靈敏度和特異度均較高，自動化程度高，適合高通量檢測，但涉及儀器昂貴，需專人操作，不適合廣泛推廣。因此，迫切需要一種快速、準確、操作簡易的突變篩查方法應用與臨床突變篩查。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有方法耗時長、操作難、成本高等缺點，本發(fā)明提供了一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測方案，利用口腔細胞的無創(chuàng)檢測為基礎提出一種針對mtdnag7444a突變和a7445g突變進行聯(lián)合檢測的新方法。

本發(fā)明采用的技術解決方案是：一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測方案，所述的檢測方案包括以下步驟：

(1)提取樣本全基因組dna；

(2)特異性pcr擴增：根據(jù)人類線粒體基因劍橋參考序列特異性設計一對引物，通過正鏈引物5’-gtagaagaaccctccataaac-3’和負鏈引物5’-taggaagcagataaggaaaat-3’來擴增7356位點和7696位點之間的核酸序列，最終得pcr產物；

(3)限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應：將獲得的pcr產物分別通過限制性核酸內切酶xbai、bfai和ddei進行特異性識別切割，根據(jù)pcr產物分別經(jīng)過限制性核酸內切酶xbai識別tctaga回文結構，限制性核酸內切酶bfai識別ctag回文結構，限制性核酸內切酶ddei識別ctnag回文結構進行內切，然后電泳以識別其突變位點，最終根據(jù)電泳獲得的條帶結果判斷樣本線粒體dnag7444a突變和線粒體dnaa7445g突變的結果。

所述的全基因組dna從細胞、血液以及組織樣本中提取。

所述的提取樣本全基因組dna通過以下方法獲得：使用鑷子提取口腔組織樣本，并轉移到無菌離心管，用600μl細胞裂解緩沖液和3μl蛋白酶k混合55℃12小時，孵育后，混入600μl預冷的乙酸鉀，混合物在4℃保持10分鐘，然后將混合物在12000rpm下離心10分鐘4℃，將上清液轉移至新的2ml無菌離心管用600μl預冷異丙醇醇，混合后，將混合物離心12000rpm，4℃，10分鐘，傾出上清液，將沉淀物重懸浮于600μl無水乙醇中，并在室內溫度12000rpm下離心3分鐘，傾出上清液后將dna在室溫下干燥，20μlddh20加入到2ml無菌離心管中以溶解dna獲得樣本全基因組dna。

所述的步驟(2)特異性pcr擴增步驟如下：在1uldna提取液，2uldntp，0.2ul正鏈引物，0.2ul負鏈引物，2ulprcbuffer，0.1ultaqdna聚合酶，1.5ul氯化鎂溶液和18ul雙蒸水的反應體系下，在94℃變性解鏈5min后，進行35次擴增循環(huán)，得到的pcr產物片段進行測序，測序結果與修正劍橋標準序列對照組對比。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測方案，其利用口頰細胞作為dna的來源，通過三種限制性核酸內切酶xbai、bfai和ddei進行特異性識別切割，然后又進行電泳以識別其突變位點，根據(jù)電泳獲得的條帶結果判斷樣本線粒體dnag7444a突變和線粒體dnaa7445g突變的結果，該方法經(jīng)濟節(jié)約，操作簡單且快速有效，為耳聾的預防、分子診斷和基因治療提供必要的技術支持，同時也為其他耳聾突變位點的針對性診斷提供了新方法新思路，具有重要科學意義和社會價值。

附圖說明

圖1為母系遺傳相關的trna^ser(ucn)g7444aanda7445g突變示意圖。

圖2為pcr反應條件。

圖3為pcr產物的確認。

圖4為限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應實驗結果圖。

具體實施方式

實驗對象

本論文將研究對象分為4組，每組選擇三例樣本進行檢測。

表一、樣本表格

(y：yesn：no)

所有患者外周血樣以及口頰細胞的采集均簽署了溫州醫(yī)科大學倫理委員會審批的知情協(xié)議書。用無菌棉簽在其口腔粘膜擦拭，然后將棉簽風干30-60分鐘并置于密封的干燥劑塑料袋中。同時，受試者自愿提供2ml外周血儲存在抗凝血劑中管。到達實驗室時，所有樣品，包括口腔細胞樣品和血液樣品儲存在4℃，以防止dna的降解。

提取樣本全基因組dna

手工法

使用滅菌的鑷子將風干的口腔拭子表面上的棉花撕裂，并轉移到2ml無菌離心管，用600μl細胞裂解緩沖液和3μl蛋白酶k混合55℃12小時。孵育后，混入600μl預冷的乙酸鉀，混合物在4℃保持10分鐘。然后將混合物在12000rpm下離心10分鐘4℃。將上清液轉移至新的2ml無菌離心管用600μl預冷異丙醇醇。混合后，將混合物離心12000rpm，4℃，10分鐘。傾出上清液，將沉淀物重懸浮于600μl無水乙醇中，并在室內溫度12000rpm下離心3分鐘。傾出上清液后將dna在室溫下干燥，20μlddh2o加入到2ml無菌離心管中以溶解dna。

試劑盒法

使用qiaampdnaminikits(50)根據(jù)口腔拭子的規(guī)格提取口腔細胞dna。根據(jù)血液和體液的說明書，使用hipuretissuednaminikits提取血液dna。通過分光光度法在260nm和280nm測定總dna濃度和純度，通過將dna濃度乘以dna樣品的最終體積計算dna產量。

特異性pcr擴增

通過pcr擴增獲得12srrna的dna片段，并進行dna測序分析。我們使用正鏈引物5’-gtagaagaaccctccataaac-3’和負鏈引物5’-taggaagcagataaggaaaat-3’來擴增7356位點和7696位點之間的核酸序列，反應體系為：1uldna提取液，2uldntp，0.2ul正鏈引物，0.2ul負鏈引物，2ulprcbuffer，0.1ultaqdna聚合酶，1.5ul氯化鎂溶液和18ul雙蒸水。首先94℃5min變性解鏈后，進行35次擴增循環(huán)(94℃30s，51℃45s，72℃60s)，最后為72℃6min的延伸過程，如圖二所示。pcr產物片段送測，測序結果與修正劍橋標準序列(genbankaccessionno.nc_001807)/對照組對比。產物純化后電泳檢測得到，如圖三所示。

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應

pcr產物總長341bp，可以被限制性核酸內切酶xbai、bfai和ddei特異性識別切割。我們分別按次序使用這三種酶對pcr產物進行酶切電泳以識別其突變位點。使用10％聚丙烯酰胺凝膠在100v下電泳分離1h來分析酶消化產物，使用凝膠配比方案為2.4ml5×tbe，88ul10％過硫酸銨，4ml30％聚丙烯酰胺，8ultemed。電泳完成后的凝膠塊用gelred(1∶10000in1xtbe)熒光核酸凝膠染色試劑染色10min，然后在成像系統(tǒng)上觀察拍攝。

實驗結果

本發(fā)明對象分為4組，每組選擇三例樣本，現(xiàn)選取每組的第一例樣本進行說明，限制性內切酶有其特定的識別序列，識別序列中的任何一個堿基的改變都將導致酶切位點的消失。第一種限制酶作用時極可能切除了第二種限制酶的作用位點，使得酶切反應無法繼續(xù)進行，因此需要嚴格分步進行酶切操作。

第一步，選擇xbai進行檢測。d組(對照組)獲得一條341bp的條帶，而其他突變組則獲得85bp和256bp的條帶。(圖4)我們以此可識別無突變的dna樣本。

第二步，選擇bfai進行檢測。c組(攜帶mtdnaa7445g突變的樣本)獲得86bp和255bp的條帶，而a組與b組則只獲得一條341bp的條帶。(圖4)通過第二步我們可識別mtdna7445a＞g突變。

第三步，選擇ddei進行檢測。b組(攜帶mtdnag7444a突變的樣本)可獲得一條341pb的特異條帶，而a組(同時攜帶mtdnag7444a突變及mtdnaa7445g突變)則獲得86bp和255bp的條帶。(圖4)

諸如上述，則根據(jù)相應的條帶結果即可準確判斷該樣本的突變情況。此外，提取所得血液dna和口腔上皮細胞dna的檢測結果均沒有顯著差異。最后，我們以此方案對各個樣本重新進行檢測，結果均符合實際。