本發(fā)明屬分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種線粒體耳聾a1555g突變的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，及其在線粒體耳聾a1555g突變檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耳聾是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，其中超過50％的耳聾患者由遺傳因素導(dǎo)致。在遺傳性耳聾中，30％為綜合征耳聾，70％為非綜合征耳聾。耳聾的遺傳方式可表現(xiàn)常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、x連鎖遺傳和母系遺傳，線粒體dna(mtdna)突變是母系遺傳性耳聾發(fā)生的重要原因之一，在遺傳性耳聾中的發(fā)病率約為1％～2％。

位于mtdna12srrna上的a1555g突變是氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等的作用靶點(diǎn)，與藥物性耳聾的發(fā)生密切相關(guān)。該突變的主要致聾機(jī)制是人類mtdna的第1555位核苷酸相當(dāng)于細(xì)菌16srrna的第1491位核苷酸，當(dāng)發(fā)生a1555g突變時(shí)，mtdna12srrna的a區(qū)能形成一個(gè)新的堿基配對(duì)，導(dǎo)致12srrna的二級(jí)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌16srrna對(duì)應(yīng)部位的相似度更高，從而促進(jìn)氨基糖苷類抗生素與之結(jié)合，結(jié)合后的氨基糖苷類抗生素會(huì)抑制參與氧化磷酸化過程的呼吸鏈蛋白的合成，使攜帶該突變的個(gè)體發(fā)生聽力損傷?？傊?，攜帶a1555g突變的個(gè)體對(duì)氨基糖苷類藥物具有超敏性，可引起臨床上常見的“一針致聾”現(xiàn)象，是藥物性耳聾發(fā)生的重要原因之一。

目前，mtdna突變的常見檢測(cè)方法主要有直接測(cè)序法、微陣列芯片法、pcr-rflp法、熒光定量pcr法等。直接測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)，且需要專業(yè)的測(cè)序儀和結(jié)果判讀人員，不適合臨床推廣應(yīng)用。微陣列芯片法具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，但存在檢測(cè)成本高、操作繁瑣、易交叉污染等缺點(diǎn)，不適用于大樣本篩查的需求。pcr-rflp法由于在pcr擴(kuò)增結(jié)束后需開蓋進(jìn)行后續(xù)的酶切和電泳，同樣存在操作繁瑣、容易污染等問題。熒光定量pcr技術(shù)近年來在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，其基本原理是利用taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通pcr基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)熒光雙標(biāo)記探針，兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(r)和淬滅基團(tuán)(q)；探針保持完整時(shí)r基團(tuán)的熒光信號(hào)被q基團(tuán)抑制，一旦探針被切斷，q基團(tuán)的抑制作用消失，r基團(tuán)的熒光信號(hào)就可被檢測(cè)到。該技術(shù)通過對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)pcr過程中產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，除具有定量準(zhǔn)確、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)外，最大的優(yōu)勢(shì)是采用完全閉管檢測(cè)，省去了對(duì)pcr產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。而且，隨著材料和儀器的進(jìn)一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標(biāo)記不同的熒光染料(fam、hex、rox等)及多通道熒光定量pcr儀，可以實(shí)現(xiàn)基因分型、基因突變檢測(cè)、snp分析等研究。

針對(duì)熒光定量pcr傳統(tǒng)taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，美國(guó)abi公司于2000年推出一種新的taqman探針——mgb探針，其3’端采用非熒光性的淬滅基團(tuán)，在吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾。此外，mgb探針的3’端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可極大提高探針與模板雜交的穩(wěn)定性，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的tm值。而短探針的主要優(yōu)點(diǎn)在于熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，信噪比更高；同時(shí)，短探針也簡(jiǎn)化了設(shè)計(jì)和降低了成本。有實(shí)驗(yàn)表明mgb探針對(duì)于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測(cè)單堿基突變。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種線粒體耳聾常見突變a1555g的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液、第一陽(yáng)性對(duì)照品、第二陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴(kuò)增引物序列為：5’-catttaactaaaacccctacgcattt-3’

下游擴(kuò)增引物序列為：5’-gcactttccagtacacttaccatgtt-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-aggaggcaagtcg-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-tagaggagacaagtcg-mgb-3’

第一陽(yáng)性對(duì)照品為線粒體第1555位點(diǎn)為a堿基的dna樣品，第二陽(yáng)性對(duì)照品為線粒體第1555位點(diǎn)為g堿基的dna樣品，陰性對(duì)照品為無(wú)菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明試劑盒包括說明書和盒體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的試劑盒在相關(guān)性耳聾線粒體a1555g突變檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明試劑盒使用方法：

每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

⑴人外周血細(xì)胞mtdna的提?。簢?yán)格按照美國(guó)biovision公司商品化的線粒體dna提取試劑盒操作，從臨床外周血標(biāo)本中提取mtdna。

⑵pcr擴(kuò)增檢測(cè)：在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進(jìn)行，每個(gè)pcr反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包括20μlpcr反應(yīng)液和5μl模板(提取的mtdna、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照)。探針檢測(cè)模式為：fam、hex通道分別用于檢測(cè)1555位點(diǎn)的g堿基和a堿基。pcr反應(yīng)條件：94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。

⑶熒光定量結(jié)果報(bào)告：①檢測(cè)樣品g堿基探針ct值≤35且擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，同一反應(yīng)體系中a堿基探針ct值大于g堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測(cè)樣品1555位點(diǎn)為g堿基；②檢測(cè)樣品a堿基探針ct值≤35且擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，同一反應(yīng)體系中g(shù)堿基探針ct值大于a堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測(cè)樣品1555位點(diǎn)為a堿基；③當(dāng)兩探針ct值均大于35或兩探針ct值的差值小于5時(shí)，需對(duì)樣品重新進(jìn)行mtdna提取和pcr檢測(cè)。

本發(fā)明針對(duì)mtdna第1555位點(diǎn)的a>g單堿基突變?cè)O(shè)計(jì)兩條mgb探針，開發(fā)該位點(diǎn)突變的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，旨在準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)mtdnaa1555g突變，從而應(yīng)用于該突變相關(guān)性耳聾的臨床診斷、預(yù)防和治療。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)和雙色熒光探針，開發(fā)研制了用于線粒體耳聾常見突變a1555g的檢測(cè)試劑盒。該試劑盒能通過一步法檢測(cè)mtdna第1555位點(diǎn)是否發(fā)生a>g突變，可滿足臨床準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地診斷該突變相關(guān)性耳聾的需要，同時(shí)為a1555g突變導(dǎo)致的線粒體耳聾的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為第一陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果1555位點(diǎn)為a堿基的擴(kuò)增曲線。

圖3為第二陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果1555位點(diǎn)為g堿基的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

參見圖1，本發(fā)明提供的線粒體耳聾a1555g突變的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液(1)、第一陽(yáng)性對(duì)照品(2)、第二陽(yáng)性對(duì)照品(3)、陰性對(duì)照品(4)、說明書(5)和盒體(6)組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴(kuò)增引物序列為：5’-catttaactaaaacccctacgcattt-3’

下游擴(kuò)增引物序列為：5’-gcactttccagtacacttaccatgtt-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-aggaggcaagtcg-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-tagaggagacaagtcg-mgb-3’

第一陽(yáng)性對(duì)照品為線粒體第1555位點(diǎn)為a堿基的dna樣品，第二陽(yáng)性對(duì)照品為線粒體第1555位點(diǎn)為g堿基的dna樣品，陰性對(duì)照品為無(wú)菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

實(shí)施例2線粒體耳聾a1555g突變熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用

(一)檢測(cè)樣品：

在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院確診為感音神經(jīng)性耳聾患兒30例，所有病例均采用美國(guó)biovision公司的線粒體dna提取試劑盒，從其外周血標(biāo)本中提取線粒體dna作為檢測(cè)樣品。

(二)熒光定量pcr檢測(cè)

在定量pcr反應(yīng)液管中分別加入檢測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照品或陰性對(duì)照品5μl，在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr擴(kuò)增，fam、hex通道分別用于檢測(cè)1555位點(diǎn)的g堿基和a堿基。pcr反應(yīng)條件為94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個(gè)循環(huán)。

(三)檢測(cè)結(jié)果

第一陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果1555位點(diǎn)為a堿基(圖2)，第二陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果1555位點(diǎn)為g堿基(圖3)。臨床檢測(cè)樣品中1555位點(diǎn)為a堿基的有28例，占93.3％；1555位點(diǎn)為g堿基的有2例，占6.7％。所有檢測(cè)樣品的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)1555位點(diǎn)的堿基均與熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果相符，表明該試劑盒檢測(cè)a1555g突變具有很好的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限度的范圍。

<110>浙江大學(xué)

<120>線粒體耳聾a1555g突變的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增人線粒體12srrna的上游引物序列

<400>1

catttaactaaaacccctacgcattt26

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增人線粒體12srrna的下游引物序列

<400>2

gcactttccagtacacttaccatgtt26

<210>3

<211>13

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人線粒體第1555位點(diǎn)為g堿基的熒光探針序列

<400>3

aggaggcaagtcg13

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人線粒體第1555位點(diǎn)為a堿基的熒光探針序列

<400>4

tagaggagacaagtcg16