技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記及其特異性引物和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
：

微衛(wèi)星(microsatellite)，又稱簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,ssrs)或短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats,strs)，為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、遺傳穩(wěn)定和可檢測(cè)雜合子等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,aflp)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomamplifiedpolymorphicdna,rapd)等技術(shù)的不足，是目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物種群遺傳結(jié)構(gòu)研究和遺傳育種領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)。隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags,ests)成為開發(fā)ssr標(biāo)記的重要資源。est-ssr作為一種新型分子標(biāo)記，除具有傳統(tǒng)ssr標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)外，因其反映的是轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)。因此，與傳統(tǒng)的ssr標(biāo)記相比，est-ssr標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助選擇育種領(lǐng)域具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

凡納濱對(duì)蝦(litopenaeusvannamei)俗稱南美白對(duì)蝦，是全世界產(chǎn)量最大的養(yǎng)殖對(duì)蝦。在我國，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)域遍布于全國沿海的海水養(yǎng)殖區(qū)和內(nèi)陸的淡水養(yǎng)殖區(qū)，是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)。迄今為止，凡納濱對(duì)蝦est-ssr標(biāo)記的開發(fā)較少，與功能基因相關(guān)聯(lián)的est-ssr標(biāo)記的開發(fā)則更少，僅在凡納濱對(duì)蝦滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)功能基因中篩選到5個(gè)est-ssr標(biāo)記。本發(fā)明基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的凡納濱對(duì)蝦est序列，利用滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)功能基因之外的其他功能基因的est序列進(jìn)行est-ssr標(biāo)記的開發(fā)，從而為凡納濱對(duì)蝦遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建和進(jìn)化分析奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為凡納濱對(duì)蝦分子標(biāo)記輔助育種提供有價(jià)值的分子標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記及其特異性引物和檢測(cè)方法。為凡納濱對(duì)蝦遺傳關(guān)系分析及分子標(biāo)記輔助育種提供有價(jià)值的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記，所述的est-ssr標(biāo)記編號(hào)分別為lv-f008、lv-f010、lv-f014、lv-f016、lv-f028、lv-f032、lv-f047和lv-f056；

所述的lv-f008的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述的lv-f010的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述的lv-f014的核苷酸序列如seqidno.3所示；

所述的lv-f016的核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述的lv-f028的核苷酸序列如seqidno.5所示；

所述的lv-f032的核苷酸序列如seqidno.6所示；

所述的lv-f047的核苷酸序列如seqidno.7所示；

所述的lv-f056的核苷酸序列如seqidno.8所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述的凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記的特異性引物，所述的est-ssr標(biāo)記的特異性引物如下所示：

針對(duì)位點(diǎn)lv-f008：

lv-f008-f：5’-tcagcccttatagatttaaaagaaaa-3’(如seqidno.9所示)；

lv-f008-r：5’-ttaatataaaatcccggccaaac-3’(如seqidno.10所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f010：

lv-f010-f：5’-tttaaatatggcttcctccttgg-3’(如seqidno.11所示)；

lv-f010-r：5’-acagctacggctcgttacctaga-3’(如seqidno.12所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f014：

lv-f014-f：5’-gggagagaatctagcttgtgatg-3’(如seqidno.13所示)；

lv-f014-r：5’-cttgttgcttgattccacttttt-3’(如seqidno.14所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f016：

lv-f016-f：5’-tatgaaaaggttagagcgagtgg-3’(如seqidno.15所示)；

lv-f016-r：5’-ccaaacacgtttatccacacata-3’(如seqidno.16所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f028：

lv-f028-f：5’-accaaggacttcttcggtgag-3’(如seqidno.17所示)；

lv-f028-r：5’-atacccgaatggaaaaagaagaa-3’(如seqidno.18所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f032：

lv-f032-f：5’-atggaggtcaggtttttcttctt-3’(如seqidno.19所示)；

lv-f032-r：5’-aatccctctggccttataggaat-3’(如seqidno.20所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f047：

lv-f047-f：5’-aattgtagggaattggataggga-3’(如seqidno.21所示)；

lv-f047-r：5’-cagaattaggagtgataatacccca-3’(如seqidno.22所示)；

針對(duì)位點(diǎn)lv-f056：

lv-f056-f：5’-gtgtgtattccatgttgcgtatg-3’(如seqidno.23所示)；

lv-f056-r：5’-cgatgaaaaaccattgatttagg-3’(如seqidno.24所示)。

所述的特異性引物的正向引物的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)。

所述的熒光基團(tuán)優(yōu)選為fam、hex或tamra。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)、提取凡納濱對(duì)蝦基因組dna；

(2)、以步驟(1)提取的基因組dna為模板，分別利用上述的針對(duì)位點(diǎn)lv-f008的引物對(duì)lv-f008-f/r、針對(duì)位點(diǎn)lv-f010的引物對(duì)lv-f010-f/r、針對(duì)位點(diǎn)lv-f014的引物對(duì)lv-f014-f/r、針對(duì)位點(diǎn)lv-f016的引物對(duì)lv-f016-f/r、針對(duì)位點(diǎn)lv-f028的引物對(duì)lv-f028-f/r、針對(duì)位點(diǎn)lv-f032的引物對(duì)lv-f032-f/r、針對(duì)位點(diǎn)lv-f047的引物對(duì)lv-f047-f/r和針對(duì)位點(diǎn)lv-f056的引物對(duì)lv-f056-f/r進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(3)、利用測(cè)序儀對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型。

所述的步驟(2)中的pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)體系優(yōu)選為：25μl，包括：不含mg²⁺的10×pcrbuffer2.5μl，25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl，5u/μl高保真pcr酶0.2μl，10μm正向引物0.5μl，10μm反向引物0.5μl，25ng/μldna模板0.5μl，ddh2o18.3μl。

所述的步驟(2)中的pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，按上述的est-ssr標(biāo)記的特異性引物的退火溫度退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸6分鐘；所述的est-ssr標(biāo)記的特異性引物的退火溫度分別為：位點(diǎn)lv-f008：55℃，位點(diǎn)lv-f010：55℃，位點(diǎn)lv-f014：55℃，位點(diǎn)lv-f016：55℃，位點(diǎn)lv-f028：61℃，位點(diǎn)lv-f032：56℃，位點(diǎn)lv-f047：55℃，位點(diǎn)lv-f056：55℃。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明利用通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的凡納濱對(duì)蝦est序列，開發(fā)凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記，并提供多態(tài)性引物，建立凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記開發(fā)的技術(shù)體系，為凡納濱對(duì)蝦遺傳關(guān)系分析及優(yōu)良品種的選育提供有價(jià)值的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的技術(shù)方案：從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的凡納濱對(duì)蝦est序列中通過blast比對(duì)篩選滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)功能基因之外的其他功能基因的est序列，并通過misa軟件進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)查找，獲得了56個(gè)含有微衛(wèi)星的凡納濱對(duì)蝦功能基因的est序列。采用primerpremier5軟件，針對(duì)篩選出的56個(gè)est序列的72個(gè)ssr位點(diǎn)設(shè)計(jì)了72對(duì)引物，并利用這72對(duì)引物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，其中有30對(duì)引物穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶。利用3730xl測(cè)序儀對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型，并使用genemapper3.2軟件判讀等位基因片段的具體數(shù)值，最終確定了8個(gè)具有高度多態(tài)性的凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記。

本發(fā)明獲得的8個(gè)est-ssr標(biāo)記的等位基因數(shù)分別為4、3、5、6、5、7、3和10個(gè)，觀測(cè)雜合度、期望雜合度和pic值均大于0.5，說明這8個(gè)est-ssr標(biāo)記均具有高度多態(tài)性，可用于凡納濱對(duì)蝦種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析、分子指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種。

附圖說明：

圖1是lv-f008位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖2是lv-f010位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖3是lv-f014位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖4是lv-f016位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖5是lv-f028位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖6是lv-f032位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖7是lv-f047位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

圖8是lv-f056位點(diǎn)引物擴(kuò)增24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna的ssr分型圖，其中s1-24代表24個(gè)凡納濱對(duì)蝦樣品。

具體實(shí)施方式：

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法或者按照試劑盒說明書進(jìn)行。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由華大基因有限公司完成，其他測(cè)序和引物合成工作由上海生物工程有限公司完成。

1、凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列比對(duì)

1.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分別取凡納濱對(duì)蝦肌肉、肝胰腺、鰓和腸組織，用rnaisoplus(takara,japan)提取總rna，并用dnasei(takara)處理。采用nanodrop^tm2000分光光度計(jì)(thermoscientificwaltham,ma,usa)測(cè)定rna濃度，并用agilent2100bioanalyzer(agilenttechnologies,ca,usa)評(píng)價(jià)rna的質(zhì)量。將從4種不同組織樣品中提取的rna等量混合后，經(jīng)mrna富集、mrna片段化、cdna合成、末端修復(fù)、加“a”尾和測(cè)序接頭連接等工序建立cdna文庫。采用iiiuminahiseq2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cdna文庫進(jìn)行測(cè)序，采用seqclean和lucy軟件去掉接頭序列及低質(zhì)量序列，獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)，并用trinity法進(jìn)行序列組裝。

1.2est序列比對(duì)

通過ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)對(duì)est序列進(jìn)行比對(duì)，確定每個(gè)est序列隸屬的基因名稱。

2、凡納濱對(duì)蝦功能基因est的篩選及微衛(wèi)星位點(diǎn)查找

針對(duì)篩選出的滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)功能基因之外的其他功能基因的est序列，采用misa軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)查找，獲得56個(gè)含有微衛(wèi)星的凡納濱對(duì)蝦功能基因est序列。

3、凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)

采用primerpremier5軟件，針對(duì)篩選出的56個(gè)凡納濱對(duì)蝦功能基因est序列的72個(gè)ssr位點(diǎn)進(jìn)行ssr引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的要求為：引物長度18-24bp，gc含量為40-60％，tm值為50-62℃，上下游引物的tm值之差不大于5，并盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及錯(cuò)配等；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100-550bp。共設(shè)計(jì)和合成72對(duì)est-ssr引物，引物序列見表1：

表1凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記引物特性表

(位點(diǎn)、對(duì)應(yīng)基因、重復(fù)基序、引物序列、退火溫度)

注：f表示正向引物，r表示反向引物

4、凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記引物的篩選及結(jié)果分析

4.1凡納濱對(duì)蝦基因組dna的提取

選取來自于廣東深圳、珠海、湛江、徐聞和茂名等地24個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的凡納濱對(duì)蝦24尾，分別取肌肉組織，采用海洋動(dòng)物組織基因組dna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取凡納濱對(duì)蝦基因組dna，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行?；蚪Mdna定量采用nanodrop^tm2000分光光度計(jì)完成，質(zhì)量采用瓊脂糖電泳來檢測(cè)。

4.2引物的初步篩選

從上述提取的凡納濱對(duì)蝦基因組dna中隨機(jī)抽取一份做模板，分別采用表1中的72對(duì)引物對(duì)該dna進(jìn)行pcr梯度擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μl，包括：10×pcrbuffer(withoutmg²⁺)2.5μl、25mmmgcl22.0μl，10mmdntp0.5μl、5u/μl高保真pcr酶(hsdnapolymerase)0.2μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl、25ng/μldna模板0.5μl、無菌水18.3μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，退火(溫度從48℃到64℃)30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸6分鐘。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖電泳檢測(cè)，顯示有30對(duì)引物在特定退火溫度下能穩(wěn)定擴(kuò)增出單一條帶。分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示該30對(duì)引物均可擴(kuò)增出目的條帶，位點(diǎn)分別為：lv-f001-lv-f003、lvf006-lv-f018、lv-f020、lv-f025-lv-f028、lv-f030、lv-f032、lv-f034、lv-f041、lv-f045-lv-f047、lv-f056和lv-f065。

4.3多態(tài)性引物的篩選及結(jié)果分析

對(duì)步驟4.2初步篩選出的30對(duì)引物的正向引物的5’端分別用fam、hex或tamra進(jìn)行熒光標(biāo)記，以步驟4.1提取的24個(gè)凡納濱對(duì)蝦基因組dna為模板，分別用步驟4.2初步篩選出的30對(duì)引物(正反向引物序列見表1，正向引物的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán))進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系同步驟4.2所述，反應(yīng)程序除退火溫度外均與步驟4.2中所述一致，各引物對(duì)對(duì)應(yīng)的退火溫度詳見表1。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物先用2％瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，后采用3730xl測(cè)序儀進(jìn)行分型，并使用genemapper3.2軟件判讀等位基因片段的具體數(shù)值，確定了8個(gè)具有多態(tài)性的凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記(見圖1～8)，位點(diǎn)分別為：lv-f008(其核苷酸序列如seqidno.1所示)、lv-f010(其核苷酸序列如seqidno.2所示)、lv-f014(其核苷酸序列如seqidno.3所示)、lv-f016(其核苷酸序列如seqidno.4所示)、lv-f028(其核苷酸序列如seqidno.5所示)、lv-f032(其核苷酸序列如seqidno.6所示)、lv-f047(其核苷酸序列如seqidno.7所示)和lv-f056(其核苷酸序列如seqidno.8所示)。

采用popgene32軟件計(jì)算期望雜合度和觀察雜合度，使用piccalc0.6軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)。結(jié)果表明：上述8個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)分別為4、3、5、6、5、7、3和10個(gè)；觀測(cè)雜合度分別為0.6800、0.7500、0.6853、0.8067、0.7332、0.8191、0.7500和0.8661；期望雜合度分別為0.5417、0.6782、0.6250、0.7917、0.7500、0.7917、0.6800和0.6667；pic值分別為0.5997、0.5899、0.6071、0.7572、0.6727、0.7731、0.5917和0.8300(表2)，均大于0.5，說明這8個(gè)est-ssr標(biāo)記均具有高度多態(tài)性，可用于凡納濱對(duì)蝦種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析、分子指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種。

表2凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記特性表

序列表

<110>中國科學(xué)院南海海洋研究所

<120>凡納濱對(duì)蝦功能基因est-ssr標(biāo)記及其特異性引物和檢測(cè)方法

<160>24

<210>1

<211>158

<212>dna

<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）

<400>1

tcagcccttatagatttaaaagaaaatatttataagttggactcaaataaagaatttaaa60

aaaatcaactctggtgtgtgtgtgtgcaacattgtgtgatttaactttcttttgatactg120

ttaaaattttcatctgtttggccgggattttatattaa158

<210>2

<211>154

<212>dna

<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）

<400>2

tttaaatatggcttcctccttggcagcgtcacataaccgctaaagtcaccctcgctcgtc60

tgcgtctgcgcctctgctgcggctgtgtactcggcggcggcggcggcggcgtgagaggct120

gcggaggagcgtctaggtaacgagccgtagctgt154

<210>3

<211>149

<212>dna

<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）

<400>3

gggagagaatctagcttgtgatgcatgtcccgatcgagcgctcgttccgggcgtgacgag60

agagaagtggagtgacgccatggagtagaacgagtgacggcggagagagagagagagaga120

gttaaaaaaaagtggaatcaagcaacaag149

<210>4

<211>120

<212>dna

<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）

<400>4

tatgaaaaggttagagcgagtgggagaaataagcatgtttgagtaagagaacatctttgt60

gtgtgtgtgtgcgtgtgtacatgcacatgtatgtgtctatgtgtggataaacgtgtttgg120

<210>5

<211>123

<212>dna

<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）

<400>5

accaaggacttcttcggtgaggctgcgcggtcgccccaaccctcgctttcttcgtcattt60

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<213>凡納濱對(duì)蝦（litopenaeusvannamei）

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