一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候選分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因(nLvALF6)的抗WSSV候選分子標(biāo)記及其應(yīng)用。凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因(nLvALF6)與抗WSSV顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記為SEQIDnLvALF6?g中258bp位置的SNP位點(diǎn)(nLvALF6g?258?A>T)。本發(fā)明為對(duì)蝦抗病分子選育提供了有效的標(biāo)記，為抗病分子標(biāo)記在遺傳育種中的應(yīng)用提供了重要指導(dǎo)，在對(duì)蝦抗WSSV品種選育的研究中具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗 WSSV候選分子標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及屬于水產(chǎn)動(dòng)物分子遺傳學(xué)和水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來(lái) 源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候選分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)是來(lái)自甲殼動(dòng)物的一種 小型的抗菌肽，最早從鱟（Limulus polyphemus)血細(xì)胞中鑒定出來(lái)的，具有明顯的抗粗糙 型革蘭氏陰性菌和抗內(nèi)毒素效應(yīng)。功能研究的結(jié)果表明甲殼動(dòng)物ALF具有廣譜、強(qiáng)效的抗菌 效應(yīng)（Beale K M，Towle D W，Jayasundara N，Smith CM，Shields JD，Small HJ，Greenwood SJ.Anti-lipopolysaccharide factors in the American lobster Homarus americanus:Molecular characterization and transcriptional response to Vibrio fluvialis challenge . Comparative Biochemistry and Physiology D_Genomics& Proteomics，2008,3(4):263-269)，且其在抗病毒免疫中的功能不斷得到證實(shí)。中國(guó)明對(duì)蝦 的7種ALF均在WSSV潛伏感染期轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙愿腥酒诤蟪霈F(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)(Li S H，Zhang X J,Sun Z et al,2013.Transcriptome Analysis on Chinese Shrimp Fenneropenaeus chinensis during WSSV Acute Infection.Plos One,8(3):e58627)。諸多研究都說明對(duì) 蝦ALF與WSSV侵染過程具有密切關(guān)系。
[0003] 凡納濱對(duì)蝦是世界三大經(jīng)濟(jì)對(duì)蝦品種之一，也是中國(guó)養(yǎng)殖規(guī)模最大的品種。近年 來(lái)，頻發(fā)的各種對(duì)蝦疾病尤其是白斑綜合癥嚴(yán)重阻礙了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，每年因病害造成 的損失大約有十億美元(相建海.海水養(yǎng)殖生物病害發(fā)生與控制.北京:海洋出版社，2001)， 因此培育抗白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的凡納濱對(duì)奸新品種已 迫在眉睫。由于抗性性狀在傳統(tǒng)選育過程中較難選擇，因此開發(fā)抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，借助 標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇能顯著提高選育的效率并降低育種盲目性。
[0004] 目前，對(duì)于凡納濱對(duì)蝦抗WSSV分子標(biāo)記的研究還較少，要實(shí)現(xiàn)分子輔助抗病品系 的培育缺乏可用的標(biāo)記，因此本研究分析了凡納濱對(duì)蝦一種ALF基因（nLvALF6)中的SNP標(biāo) 記，并利用關(guān)聯(lián)分析的方法篩選出該基因中與抗WSSV顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔 助抗病群體選育提供有效的標(biāo)記和技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗 WSSV候選分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0006] 一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因 ULVALF6)的抗WSSV候選分子標(biāo)記，凡 納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)與抗WSSV顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記為SEQIDnLvALF6g中 258bp位置的 SNP位點(diǎn)（nLvALF6g-258-A>T)。
[0007] 所述SNP位標(biāo)記點(diǎn)nLVALF6g-258-A>T抗性優(yōu)勢(shì)基因型為A/T雜合。
[0008] 一種用于檢測(cè)來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候選分子 標(biāo)記的引物對(duì)，nLvA6F: ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGT
[0009] nLvA6R:TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。
[0010] -種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候選分子標(biāo)記的應(yīng) 用，所述凡納濱對(duì)奸抗性相關(guān)的多組合分子標(biāo)記在遺傳多樣性分析篩選、分子標(biāo)記輔助育 種中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 本發(fā)明以凡納濱對(duì)蝦的ALF基因（nLvALF6)中篩選出與抗WSSV性狀顯著相關(guān)的SNP 標(biāo)記，并應(yīng)用該標(biāo)記指導(dǎo)抗WSSV對(duì)奸良種的選育，具體包括：
[0013] 1.本發(fā)明篩選獲得的抗WSSV相關(guān)分子標(biāo)記能夠在分子水平上實(shí)現(xiàn)抗病個(gè)體的篩 選，在個(gè)體較小的時(shí)候即可進(jìn)行選擇，從而提高選育的效率。
[0014] 2.通過標(biāo)記輔助選擇，可以避免環(huán)境因素導(dǎo)致選育的選育誤差，提高選育準(zhǔn)確率。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下的實(shí)施例內(nèi)容。
[0016] 本發(fā)明首先篩選nLvALF6基因中的SNP位點(diǎn)，通過分析這些位點(diǎn)在凡納濱對(duì)蝦WSSV 抗性群體和敏感群體中分布的差異，篩選獲得nLvALF6基因中抗WSSV相關(guān)SNP位點(diǎn)，并使用 該位點(diǎn)在育種材料中進(jìn)行分型，輔助抗性選育。
[0017] 上述WSSV抗性群體和敏感群體的獲得方式是通過投喂WSSV感染致死的病蝦進(jìn)行 攻毒，確保攻毒成功后，收集最先死亡的蝦組成敏感群體，收集最后死亡的蝦組成抗性群 體。
[0018] 上述nLvALF6基因中SNP位點(diǎn)的獲得是通過如下方式：1、通過轉(zhuǎn)錄組和基因組信息 獲得nLvALF6基因組全長(zhǎng)序列；2、在抗性和敏感群體材料中隨機(jī)各選擇8個(gè)個(gè)體進(jìn)行DNA提 取并對(duì)該序列進(jìn)行分別測(cè)序;3、根據(jù)測(cè)序結(jié)果篩選出nLvALF6基因的SNP位點(diǎn)。
[0019] 上述所述的篩選nLvALF6基因中與抗WSSV性狀相關(guān)的SNP方式如下：對(duì)篩選到ALF 基因中的SNP位點(diǎn)在抗性材料和敏感材料中進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)兩組材料中每個(gè)SNP位點(diǎn)的 基因頻率和基因型頻率，通過卡方檢驗(yàn)，篩選出兩組材料中呈現(xiàn)顯著差異的位點(diǎn)441^68-2584>1'(?〈0.05)，這個(gè)差異位點(diǎn)可以通過如下引物對(duì)擴(kuò)增?0?產(chǎn)物后通過一代測(cè)序?qū)崿F(xiàn)基 因分型：nLvA6F: ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGT
[0020] nLvA6R:TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。
[0021] 上述所述的分子標(biāo)記的抗性相關(guān)基因型為:A/T雜合基因型。
[0022] 實(shí)施例1:
[0023] 對(duì)蝦抗WSSV相關(guān)的SNP標(biāo)記的獲得
[0024] 1. WSSV易感和抗性材料的獲得
[0025] WSSV易感和抗性材料來(lái)源于"科海一號(hào)"多家系的混合群體。選取500尾健康凡納 濱對(duì)蝦置于12個(gè)50L的水族箱中，實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)取10尾對(duì)蝦檢測(cè)無(wú) WSSV感染，實(shí)驗(yàn)水溫為(23 ± 1) °C。經(jīng)饑餓處理后，投喂WSSV感染致死的病蝦(WSSV病毒含量為104-106copy/ng DNA)。 攻毒后每天檢查3次(每次間隔6h)并收集死蝦，隨機(jī)取樣提取基因組DNA，最早死亡的48尾 對(duì)奸作為WSSV易感組（susceptive group，sus)。至攻毒后第14天，凡納濱對(duì)奸存活情況穩(wěn) 定，取存活的48尾對(duì)奸作為胃33￥抗性組(代8丨8丨311丨81'〇即，代8)。
[0026] 2.基因組DNA提取
[0027] 凡納濱對(duì)蝦DNA的提取按照TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒說明進(jìn)行。分別提 取上述抗性組和易感組的個(gè)體DNA，將提取獲得的DNA使用NanoDrop 1000檢測(cè)DNA濃度和純 度，將經(jīng)檢測(cè)DNA濃度>50ngAU和純度0D26Q/28()為1.7-1.9的個(gè)體DNA再經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)DNA片段完整性的個(gè)體，即為合格的DNA樣品，在-20°C保存待用。。
[0028] 3.nLvALF6基因組序列的獲得
[0029] 利用轉(zhuǎn)錄組注釋信息獲得nLvALF6的cDNA序列，之后將該cDNA序列與本課題組獲 得的凡納濱對(duì)蝦基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)，獲得nLvALF6基因的基因組DNA序列。
[0030] 4.nLvALF6基因 SNP檢測(cè)和分型
[0031] 針對(duì)nLvALF6的基因組序列，以16尾對(duì)蝦DNA作為模板，對(duì)nLvALF6基因的外顯子區(qū) 域進(jìn)行SNP篩查。PCR反應(yīng)體系如下：
[0034] PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；94°C變性20s，54°C退火20s，72°C延伸 3〇8,38個(gè)循環(huán);之后72°(：延伸1〇1^11 (^財(cái)廣增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后送至華大基 因公司進(jìn)行雙向測(cè)序。通過多序列比對(duì)和讀測(cè)序峰圖獲得該片段SNP分布。
[0035] 采用直接測(cè)序的方法對(duì)保守區(qū)的11個(gè)位點(diǎn)在抗性組和易感組的總計(jì)96尾個(gè)體中 進(jìn)行SNP分型，PCR引物、反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序均同上所述。依據(jù)測(cè)序圖記錄每個(gè)個(gè)體的基因 型。
[0036] 5.nLvALF6基因抗WSSV相關(guān)SNP位點(diǎn)的獲得
[0037] 通過SPSS 16.0中的非參數(shù)檢驗(yàn)方法(卡方檢驗(yàn)，x2)對(duì)易感組和抗性組中各SNP基 因頻率、基因型頻率及單倍型分布進(jìn)行差異檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在nLvALF6基因序列SEQID nLvALF6g 中位點(diǎn)nLvALF6g-258-A>T與抗WSSV性狀顯著相關(guān)(Ρ〈0·05)。在nLvALF6g-258-A>T位點(diǎn)基因 型A/T雜合為抗性優(yōu)勢(shì)基因型。
[0038] SIQ ID nLvALF6g
[0040] (a)序列特征
[0041 ] *長(zhǎng)度：373堿基對(duì)
[0042] *類型:核酸
[0043] *鏈型：雙鏈
[0044] *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0045] (b)分子類型：DNA
[0046] (c)假設(shè):否
[0047] ⑷反義:否
[0048] (e)最初來(lái)源:凡納濱對(duì)蝦。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候選分子標(biāo)記，其特 征在于：凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)與抗WSSV顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記為 SEQIDnLvALF6-g中 258bp位置的SNP位點(diǎn)（nLvALF6g-258-A>T)。2. 按權(quán)利要求1所述的來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候選 分子標(biāo)記，其特征在于:所述SNP位標(biāo)記點(diǎn)nLvALF6g-258-A>T抗性優(yōu)勢(shì)基因型為A/T雜合。3. -種用于檢測(cè)權(quán)利要求1所述的來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的 抗WSSV候選分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于:nLvA6F: ACTTCCTTTAGCCTTAACTTCCCGT nLvA6R:TCAGATGTAACAGTATGAACCCA。4. 一種權(quán)利要求1所述的來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子基因（nLvALF6)的抗WSSV候 選分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于:所述凡納濱對(duì)蝦抗性相關(guān)的多組合分子標(biāo)記在遺傳多樣 性分析篩選、分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969870SQ201610402109
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】于洋, 李富花, 劉敬文, 相建海, 張曉軍
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所