專利名稱：一種脂多糖的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及對細(xì)菌脂多糖的純化方法。
背景技術(shù)：
副傷寒是一種常見的急性腸道傳染性疾病，是許多國家，特別是發(fā)展中國家的主要公共衛(wèi)生問題之一。目前《中國藥典》2010版收錄的傷寒副傷寒聯(lián)合疫苗(TAB)屬于全菌體疫苗，副反應(yīng)嚴(yán)重，相關(guān)的發(fā)熱和全身反應(yīng)發(fā)生率為99Γ34% ;有效免疫力維持時間較短，保護(hù)率僅為51%飛7%，，在臨床使用多年后現(xiàn)已停止生產(chǎn)使用。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計2000年，全球傷寒患病人數(shù)約2170萬，其中死亡人數(shù)為21. 7萬，副傷寒發(fā)病人數(shù)約540 萬，近年由于傷寒Vi多糖疫苗的普遍接種，副傷寒的發(fā)病率有上升趨勢。在中國，2006年，除吉林和青海省無副傷寒病例報道外，其余各省市都有較多病例報道，且病例總數(shù)已經(jīng)超過傷寒病例。2010年廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳10月30日證實，廣西河池市羅城仫佬族自治縣部分中小學(xué)近日暴發(fā)甲型副傷寒疫情。目前，全世界范圍內(nèi)尚沒有安全性高、有效性好的副傷寒疫苗獲批，因此副傷寒疫苗的研制迫在眉睫。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁組成成分，由脂質(zhì)A、核心多糖和O-特異多糖(O-SP)三部分組成。傷寒沙門氏菌的脂多糖不僅是一個毒力因子，它也是一種保護(hù)性抗原。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將脂多糖脫毒后的O-SP特異多糖具有免疫保護(hù)性，可以通過將O-SP與載體蛋白結(jié)合后制備成結(jié)合疫苗。關(guān)于O-SP與載體蛋白結(jié)合疫苗的研發(fā)已經(jīng)取得突破性進(jìn)展，該項目實施產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸在于如何大批量的獲得0-SP。解決LPS中核酸含量一直是個難題，目前采用的純化方法主要是酶解和超速離心等方法，如 Edward 等(Edward K. Synthesis, characterization and immunologicalproperties in mice of conjugates composed of detoxified LPS of salmonellaparatyphi A bound to Tetanus toxoid, with Emphasis on the role of 0-Acetyl[J].Infection and immunity 1996，64 (7) : 2709-2715.)在 LPS 提取過程中使用了 DNA 酶、RNA酶和蛋白酶K消化，超速離心(6400(Γ100000 X g ) 5h的方法，但該方法的缺點(diǎn)在于成本高、處理量小，不利于產(chǎn)業(yè)化，且會由于酶的使用帶來外源因子污染；另據(jù)我國文獻(xiàn)報道，秦敏等人(秦敏.甲型副傷寒沙門氏菌LPS提取和O-SP純化.微生物學(xué)免疫性進(jìn)展2005，33 (I) 27-31 )用乙醇分級沉淀等方法，也只能將LPS的核酸含量控制在5%左右。柱層析技術(shù)的優(yōu)勢在于純化條件溫和、易操作、易放大，作為一種新型的技術(shù)正逐漸替代傳統(tǒng)的沉淀、離心等方法，成為生物分子純化的主流。采用凝膠過濾的方法對脂多糖的水解脫毒產(chǎn)物OSP進(jìn)行純化的文獻(xiàn)有報道，但使用該方法的前提是將LPS的殘余核酸、蛋白含量控制在5%以內(nèi)才有效果。(趙志強(qiáng).甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備及其免疫原性研究.中華微生物學(xué)和免疫性雜質(zhì)2006，26 (11)，1048-1052)。而利用超濾、疏水層析和離子交換層析技術(shù)的有機(jī)結(jié)合純化脂多糖，使其中蛋白、核酸的含量降低到1%以內(nèi)尚無文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術(shù)存在脂多糖核酸、蛋白含量較高，制品中添加外源因子，投入成本高、不利于產(chǎn)業(yè)化的問題，其目的是提供了一種能有效去除脂多糖中核酸、蛋白的方法，且該方法方便、重復(fù)性好、便于產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明所提供的一種脂多糖的純化方法，包括以下步驟
(1)脂多糖的純化
①第一次超濾將脂多糖用O.01 O. 5mol/L氯化鈣溶液溶解，離心收集上清，上清液采用10 300KD超濾膜，用O. 01 O. 5mol/L氯化鈣溶液超濾得超濾濃縮液1，超濾時所用的氯化鈣溶液的體積為上清液體積的10 30倍；
②疏水層析超濾濃縮液I中加入硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為I 3mol/L，于4 120C >3000 8000rpm條件下離心15 60min,收集上清液；上樣于疏水層析柱，用混合液I 或混合液2淋洗疏水層析柱，收集疏水層析穿透峰，得疏水層析液，混合液I由Tris-HCl和硫酸銨混合而成，pH為5. (Γ8. O,混合液I中Tris-HCl的終濃度為O. 005 O. 5mol/L，硫酸銨的終濃度為O. 5^2. O mol/L ;混合液2由磷酸鹽緩沖液和硫酸銨混合而成，pH為5. (Γ8. 0，混合液2中磷酸鹽的終濃度為O. 005 O. 5mol/L，硫酸銨的終濃度為O. 5^2. O mol/L ；
③第二次超濾將疏水層析液采用10 50KD超濾膜，用注射用水超濾得超濾濃縮液2，所述的注射用水的用量為疏水層析液體積的3 7倍；
④離子交換層析
在超濾濃縮液2中加入Tris-HCl緩沖液至Tris-HCl的終濃度為O. 005 O. 5mol/L得混合液3，混合液3的pH為5. (Γ8. O ;將混合液3上樣于陰離子交換柱，用終濃度為O. 005 O. 5mol/L及pH為5. (Γ8. O的Tris-HCl緩沖液淋洗陰離子交換層析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脫液洗脫，收集洗脫峰即為目標(biāo)物溶液，所述的洗脫液由Tris-HCl和鹽混合而成，洗脫液的PH為5. (Γ8. O、洗脫液中Tris-HCl的終濃度為O. 005 O. 5mol/L、鹽的終濃度為O. ΟΟΓ mol/L ;或在超濾濃縮液2中加入磷酸鹽緩沖液至磷酸鹽的終濃度為0. 005
0.5mol/L得混合液4，混合液4的pH為5. (Γ8. O,將混合液4上樣于陰離子交換柱，用終濃度為0. 005 0. 5mol/L及pH為5. (Γ8. O的磷酸鹽緩沖液淋洗陰離子交換層析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脫液洗脫，收集洗脫峰即為目標(biāo)物溶液，所述的洗脫液由磷酸鹽和鹽混合而成，洗脫液的pH為5. (Γ8. O、洗脫液中磷酸鹽的終濃度為0. 005 0. 5mol/L、鹽的終濃度為 0. 00Γ mol/L ；
(2)目標(biāo)物溶液的濃縮干燥將目標(biāo)物溶液采用10 50KD超濾膜，用注射用水超濾縮液，真空干燥即得純化的脂多糖，注射用水的用量為目標(biāo)物溶液體積的3 7倍。步驟(I)②中所述的疏水層析柱所用的疏水填料為Phenyl Sepharose HP>PhenyISepahrose 6 Fast Flow high sub、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow low sub 或 SOURCE
15PHE0步驟(I)④中所述的陰離子交換層析柱所用的填料為DEAE Sepharose FF、Q-SepharoseFF、Q Sepharose HP、SOURCE 30Q、或 Capto Q。步驟(I)④所述的洗脫液中的鹽為氯化鈉、磷酸鈉或乙酸鈉。步驟(I)①第一次超濾所述的將脂多糖用0. 01 0. 5mol/L氯化鈣溶液溶解，所述的脂多糖為甲型副傷寒脂多糖或乙型副傷寒脂多糖。
本發(fā)明還提供了一種脂多糖，所述的脂多糖是用本發(fā)明所述的脂多糖的純化方法制備得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
I、本發(fā)明方法采用超濾技術(shù)、疏水層析技術(shù)和離子交換層析技術(shù)的有機(jī)結(jié)合和合理的純化條件對脂多糖進(jìn)行純化，解決了脂多糖純化后核酸含量高的難題，使脂多糖中的蛋白含量和核酸含量分別小于1%，大幅度提高了脂多糖的純度，與現(xiàn)有技術(shù)相比(如乙醇分級沉淀等方法，也只能將LPS的核酸含量控制在5%左右)，其純化程度提高了 80%以上，產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果，且克服了現(xiàn)有技術(shù)對脂多糖純化設(shè)備投入成本高，酶試劑成本高及帶來相應(yīng)污染、處理量少，不利于產(chǎn)業(yè)化的缺陷和不足。2、本發(fā)明方法為副傷寒疫苗的制備奠定了良好的基礎(chǔ)。甲、乙型副傷寒沙門氏菌無莢膜多糖結(jié)構(gòu)，在大量研究的基礎(chǔ)上美國NIH提出腸道革蘭氏陰性桿菌脂多糖水解后的OSP與相關(guān)蛋白結(jié)合后具有保護(hù)性免疫(Robbins JB. Hypothesis for vaccine development: protective immunity to enteric diseasescaused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgGantibodies to the 0-specific polysaccharide of their lipopoIysaccharides, ClinInfect Dis, 1992，15 (2) : 346-361 )，因此我們的工作為副傷寒疫苗的制備奠定了良好的基礎(chǔ)。3、本發(fā)明方法可同時有效的去除LPS中的蛋白和核酸，批處理量大、工藝步驟簡單易操作，投入相對較低，有利于產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)。常用的熱酚水法提取獲得脂多糖較易去除LPS中蛋白含量，但核酸難以去除，而本發(fā)明能同時有效的去除LPS中的蛋白和核酸。與傳統(tǒng)工藝中常常使用超速離心法或脫氧核糖核酸酶(DNA酶)、核糖核酸酶(RNA酶)等方法去除核酸等雜質(zhì)相比，其中超速離心機(jī)等設(shè)備投入較高、處理量少，不利于產(chǎn)業(yè)化；DNA酶、RNA酶成本高，且由于酶的使用會帶來外源因子污染等問題，步驟復(fù)雜、不利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。相比本分發(fā)明條件溫和、殘余核酸蛋白去除效果明顯、批處理量大、投入相對較低，有利于產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)。


圖I是脂多糖電泳圖，圖中M :分子量標(biāo)準(zhǔn)，①為甲型副傷寒脂多糖，②為乙型副傷寒脂多糖。圖2是甲型副傷寒脂多糖鑒別試驗結(jié)果，圖中1為甲型副傷寒脂多糖的上樣孔；2為甲型副傷寒特異性抗血清上樣孔；陰為陰性對照上樣孔。圖3是乙型副傷寒脂多糖鑒別試驗結(jié)果，圖中1、2、3、4、5均為乙型副傷寒脂多糖的上樣孔；6為乙型副傷寒特異性抗血清的上樣孔；陰為陰性對照上樣孔。
具體實施例方式以下實施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明。材料來源
甲型副傷寒脂多糖和乙型副傷寒脂多糖為云南沃森生物技術(shù)有限公司發(fā)酵研究室提供。也可從云南沃森生物技術(shù)有限公司購買。甲型副傷寒脂多糖和乙型副傷寒脂多糖以及其他脂多糖可以從中國生物制品檢定所或Sigma公司購買。超濾膜及夾具0· 5平米、O. I平米(Pali公司)
純化儀AKTA explorer (GE Healthcare 公司)
離心機(jī)CR 21G (日立公司)
層析填料Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow (high sub)、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow (low sub)、SOURCE 15 PHE (GE 公司)；
DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、Q Sepharose HP、SOURCE 30Q>Capto Q (GE
公司)
其余化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
實施例I一實施例4是甲型副傷寒脂多糖的純化，實施例5—實施例7是乙型副傷寒脂多糖的純化。實施例I :甲型副傷寒脂多糖的純化
(1)脂多糖的純化
①第一次超濾· 將甲型副傷寒脂多糖用O.Olmol/L氯化鈣溶解，離心收集上清液，上清液采用IOKD超濾膜，用O. Olmol/L氯化鈣溶液超濾，得超濾濃縮液1，超濾時所用的氯化鈣溶液體積為上清液體積的20倍體積；
②疏水層析
超濾濃縮液I中加入硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為lmol/L，于4°C、3000rpm條件下離心60min,收集上清液；上樣于Phenyl Sepharose HP疏水層析柱,用混合液I淋洗疏水層析柱，收集疏水層析穿透峰，得疏水層析液，混合液I由Tris-HCl和硫酸銨混合而成，混合液I的pH為5. O,混合液I中Tris-HCl的終濃度為O. 005mol/L，硫酸銨的終濃度為O. 5 mol/L ；
③第二次超濾
將疏水層析液采用IOKD超濾膜，用注射用水超濾得超濾濃縮液2，所述的注射用水的用量為疏水層析液體積的3倍；
④離子交換層析
在超濾濃縮液2中加入Tris-HCl緩沖液至Tris-HCl的終濃度為O. 05mol/L得混合液3，混合液3的pH為8. O ;將混合液3上樣于DEAE Sepahrose FF陰離子交換柱，用終濃度為O. 05mol/L, pH為8. O的Tris-HCl緩沖液淋洗陰離子交換層析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脫液洗脫，收集洗脫峰即為目標(biāo)物溶液，所述的洗脫液由Tris-HCl和氯化鈉混合而成，洗脫液的PH為8. 0，洗脫液中Tris-HCl的終濃度為O. 05mol/L及氯化鈉的終濃度為O.001 mol/L ；
(2)目標(biāo)脂多糖峰溶液的濃縮干燥
將疏水層析液采用IOKD超濾膜，用注射用水超濾濃縮，真空干燥即得純化的脂多糖，注射用水的用量為目標(biāo)物溶液體積的3倍。(3)純化的脂多糖產(chǎn)品的檢測
分別將純化前的脂多糖與經(jīng)本發(fā)明法純化獲得的脂多糖進(jìn)行檢測其中蛋白含量的檢測依據(jù)《中國藥典》2010版三部(附錄VI B第二法)進(jìn)行；核酸含量的檢測依據(jù)依據(jù)《中國藥典》2010版三部(附錄II A)進(jìn)行；鑒別試驗依據(jù)《中國藥典》2010版三部(附錄VDI C)進(jìn)行，其結(jié)果見表I。
權(quán)利要求
1.一種脂多糖的純化方法，包括以下步驟 (1)脂多糖的純化 ①第一次超濾將脂多糖用O.Ol O. 5mol/L氯化鈣溶液溶解，離心收集上清，上清液采用10 300KD超濾膜，用O. 01 O. 5mol/L氯化鈣溶液超濾得超濾濃縮液1，超濾時所用的氯化鈣溶液的體積為上清液體積的10 30倍； ②疏水層析超濾濃縮液I中加入硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為I 3mol/L，于4 120C >3000 8000rpm條件下離心15 60min,收集上清液；上樣于疏水層析柱,用混合液I或混合液2淋洗疏水層析柱，收集疏水層析穿透峰，得疏水層析液，混合液I由Tris-HCl和硫酸銨混合而成，pH為5. O 8. 0，混合液I中Tris-HCl的終濃度為O. 005 O. 5mol/L，硫酸銨的終濃度為O. 5 2. O mol/L ;混合液2由磷酸鹽緩沖液和硫酸銨混合而成，pH為5.(Γ8. O,混合液2中磷酸鹽的終濃度為O. 005 O. 5mol/L，硫酸銨的終濃度為O. 5 2. Omol/L ； ③第二次超濾將疏水層析液采用10 50KD超濾膜，用注射用水超濾得超濾濃縮液2，所述的注射用水的用量為疏水層析液體積的3 7倍； ④離子交換層析 在超濾濃縮液2中加入Tris-HCl緩沖液至Tris-HCl的終濃度為O. 005 O. 5mol/L得混合液3，混合液3的pH為5. (Γ8. O ;將混合液3上樣于陰離子交換柱，用終濃度為O. 005 O.5mol/L、pH為5. (Γ8. O的Tris-HCl緩沖液淋洗陰離子交換層析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脫液洗脫，收集洗脫峰即為目標(biāo)物溶液，所述的洗脫液由Tris-HCl和鹽混合而成，洗脫液的pH為5. O 8. 0，洗脫液中Tris-HCl的終濃度為O. 005 O. 5mol/L、鹽的終濃度為O. ΟΟΓ mol/L ;或在超濾濃縮液2中加入磷酸鹽緩沖液至磷酸鹽的終濃度為0. 005 0.5mol/L得混合液4，混合液4的pH為5. (Γ8. 0，將混合液4上樣于陰離子交換柱，用終濃度為0. 005 0. 5mol/L,pH為5. (Γ8. O的磷酸鹽緩沖液淋洗陰離子交換層析柱至紫外吸光值不再下降，再用洗脫液洗脫，收集洗脫峰即為目標(biāo)物溶液，所述的洗脫液由磷酸鹽和鹽混合而成，洗脫液的PH為5. (Γ8. 0，洗脫液中磷酸鹽的終濃度為0. 005 0. 5mol/L、鹽的終濃度為 0. 00Γ mol/L ； (2)目標(biāo)物溶液的濃縮干燥將目標(biāo)物溶液采用10 50KD超濾膜，用注射用水超濾縮液，真空干燥即得純化的脂多糖，注射用水的用量為目標(biāo)物溶液體積的3 7倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂多糖的純化方法，其特征是步驟(I)②中所述的疏水層析柱所用的疏水填料為 Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow high sub、Phenyl Sepahrose 6 Fast Flow low sub 或 SOURCE 15 PHE。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂多糖的純化方法，其特征是步驟(I)④中所述的陰離子交換層析柱所用的填料為 DEAE Sepharose FF、Q-SepharoseFF、Q Sepharose HP、SOURCE30Q、或 Capto Q0
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的脂多糖的純化方法，其特征是步驟(I)④所述的洗脫液中的鹽為氯化鈉、磷酸鈉或乙酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的脂多糖的純化方法，其特征是步驟(I)①第一次超濾所述的將脂多糖用0. 01 0. 5mol/L氯化鈣溶液溶解，所述的脂多糖為甲型副傷寒脂多糖或乙型副傷寒脂多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂多糖的純化方法，其特征是步驟(I)①第一次超濾所述的將脂多糖用O. Ol O. 5mol/L氯化鈣溶液溶解，所述的脂多糖為甲型副傷寒脂多糖或乙型副傷寒脂多糖。
7.用權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的脂多糖的純化方法制備得到的脂多糖。
8.用權(quán)利要求4所述的脂多糖的純化方法制備得到的脂多糖。
9.用權(quán)利要求5所述的脂多糖的純化方法制備獲得的脂多糖。
10.用權(quán)利要求6所述的一種脂多糖的純化方法制備獲得的脂多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脂多糖的純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其步驟為經(jīng)超濾濃縮、疏水層析、離子交換層析純化后獲得純度較高的脂多糖。本發(fā)明提供了一種純化效果好、有利于產(chǎn)業(yè)化的脂多糖純化新方法，純化后的脂多糖核酸和蛋白含量均低于1%，適合于制備疫苗。
文檔編號C08B37/00GK102898537SQ20121042722
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者黃鎮(zhèn), 王銘, 陸偉, 黃志偉 申請人:云南沃森生物技術(shù)股份有限公司