專利名稱：分離方法和分離劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從液體中分離二氧磷基多羥基化合物(PPS)，如有毒的熱原質(zhì)(Pyrogen)的方法，其中所述液體直接通過(guò)注射液、滲析液和灌輸液以及用于現(xiàn)場(chǎng)的稀釋水和洗滌水導(dǎo)入生物體內(nèi)。本發(fā)明的方法可用于同樣用途的有機(jī)液，也可吸附基因技術(shù)領(lǐng)域的DNA和RNA，也可用來(lái)吸附細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中的PPS。
PPS定義為一種由磷酸部分和多羥基化合物部分組成的化合物，如LPS(脂多糖)，類脂A，核酸和甘油磷酸酯化合物。多數(shù)的多羥基化合物具有生理活性。即使數(shù)量很少，它們也可用本發(fā)明的方法除去。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種從液體中分離PPS的試劑。
吸附劑可用于分離包含在液體中的物質(zhì)。在工業(yè)上所需的分離技術(shù)的難易程度取決于各種因素，如系統(tǒng)中含有的物質(zhì)種類，分離能力和生產(chǎn)量。去除熱原質(zhì)是分離技術(shù)的一個(gè)實(shí)例，它要求的難度特別高。類似的分離技術(shù)還包括去除核酸和其它的PPS。
去除熱原質(zhì)的液體實(shí)例包括那些直接進(jìn)入生物體而不用通過(guò)消化系統(tǒng)的液體。如注射、營(yíng)養(yǎng)物灌輸和滲析用的液體藥物，以及這些藥物的稀釋液;用來(lái)處理上述液體的設(shè)備以及盛裝上述液體容器的洗滌水。
熱原質(zhì)為一種即使其量很少也可使恒溫生物的體溫發(fā)生不正常升高的物質(zhì)。當(dāng)熱原質(zhì)作為一種靜脈注射污染物進(jìn)入水液中時(shí)，將引起與藥物作用無(wú)關(guān)的嚴(yán)重高燒。據(jù)信，當(dāng)上述作用嚴(yán)重時(shí)，隨著發(fā)燒程度將伴隨著惡寒戰(zhàn)栗，甚至?xí)菘怂劳?。?xì)菌物質(zhì)，類性物質(zhì)，植物多糖，血型物等是已知的熱原質(zhì)。在它們當(dāng)中，細(xì)菌物質(zhì)大多引起發(fā)燒，被稱為細(xì)菌毒素，它廣義地分為外毒素和內(nèi)毒素。在上述的毒素中，內(nèi)毒素如所謂的O抗原體主要由革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖(LSP)構(gòu)成，具有強(qiáng)烈的發(fā)熱特性，即使通過(guò)熱處理也不能失活。萬(wàn)一內(nèi)毒素偶然進(jìn)入一種液體中，要除去它就非常困難。熱原質(zhì)通常等同于內(nèi)毒素或LPS。
化學(xué)分解.膜分離，凝膠過(guò)濾，吸附等是已知的除去熱原質(zhì)的方法。由于待處理物質(zhì)對(duì)分解器的阻礙，化學(xué)分解的方法受到限制。這些問(wèn)題是由分解器和分解產(chǎn)品等的污染而引起的。
膜分離和膠體過(guò)濾均被看作是利用熱原質(zhì)和待處理物質(zhì)之間尺寸大小的差異的分離方法。另外，熱原質(zhì)的大小，種類，LPS之間的聯(lián)系以及類脂A的存在都要加以考慮。特別是。即使當(dāng)物質(zhì)被限制為在各種熱原質(zhì)中最重要的物質(zhì)LPS時(shí)，根據(jù)作為L(zhǎng)PS來(lái)源的細(xì)菌種類的不同，發(fā)熱作用中所涉及的脂肪鏈部分(即類脂A)以及與其鍵合的多糖的種類也各不相同。具有分子量約5000的LPS聯(lián)合形成大膠束的結(jié)構(gòu)，分子量可高達(dá)幾百萬(wàn)，而具有分子量約2000的類脂A是熱原質(zhì)。
用膜分離的方法來(lái)脫除熱原質(zhì)采用超濾膜(UF膜)和反滲透膜(RO膜)。已經(jīng)提出了一種包括一組膜的設(shè)備。該設(shè)備采用膜分離的方法以除去熱原質(zhì)，而使其含量降低。在日本專利公開No.207517/1982和美國(guó)專利4261834(de Winter)揭示了上述包括那些設(shè)備的實(shí)例。當(dāng)待處理的液體僅是由水和低分子量藥物組成的水溶液時(shí)，可以選用對(duì)待處理物質(zhì)可滲透且對(duì)熱原質(zhì)不能透過(guò)的分離膜和選用一種含熱原質(zhì)的池子。然而，當(dāng)待處理物質(zhì)的分子量大時(shí)，則不容易選取這樣的膜，它可使待處理物以好的回收率滲透同時(shí)阻止熱原(尤其是分子量較低的熱原)滲透，從而達(dá)到所希望的低的熱原含量。
例如，當(dāng)以10Eu/ng作標(biāo)準(zhǔn)，5Eu(內(nèi)毒素單位)/kg發(fā)熱值，10ml/kg的劑量對(duì)兔子給藥時(shí)，預(yù)定濃度是0.5Eu/ml或50pg/ml或更低。
成功地選擇一種能從含有高分子量物質(zhì)(如蛋白質(zhì))的液體中去除熱原質(zhì)的膜是比較困難的，這種膜幾乎不可能在去除熱原質(zhì)使之達(dá)到令人滿意的低含量的同時(shí)又能保持高的藥物回收率。通常，分子量相近的物質(zhì)的分離過(guò)程不可能通過(guò)膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)，這種分離過(guò)程也變得不適于除去如熱原質(zhì)等具有寬的分子量分布的物質(zhì)。
人們知道，活性碳和離子交換樹脂具有吸附和除去熱原質(zhì)的能力。一種多孔分離膜的材料如聚烯烴通過(guò)疏水結(jié)合力也具有吸附熱原質(zhì)的能力。然而，上述材料不能從含藥物的液體中選擇性地吸附熱原質(zhì)而使之含量降至非常低，從而不能作為能令人滿意的吸附劑以用于獲得熱原質(zhì)已充分除去的藥物溶液。
業(yè)已知道一些其它的具有吸附熱原質(zhì)能力的材料。例如，日本專利公開No.112888/1984揭示了依靠含有氨基纖維除去革蘭氏陰性細(xì)菌和其細(xì)胞壁成分的方法?？梢灾?，在上述公開的說(shuō)明書中描述的實(shí)例可達(dá)到的最低熱原質(zhì)含量是0.014mg/ml，即14000ng(毫微克)，在處理含0.1mg/ml的脂多糖的水溶液時(shí)的去除率為86%。
在美國(guó)專利4，639，513(Houe等)中可用來(lái)除去大分子蛋白質(zhì)的離子色譜法被用來(lái)作為提純IgG(一種血漿成分)的方法。而親合色譜法被用來(lái)除去酶。該專利進(jìn)一步描述熱原質(zhì)的去除并暗示LPS可用正電荷離子交換基質(zhì)(Matrix)除去。雖然該專利沒(méi)有對(duì)說(shuō)明書中有關(guān)除去熱原質(zhì)的正電荷離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)給出說(shuō)明，但是上述說(shuō)明書中在離子交換色譜法中暗示它可為一種接枝共聚物，如纖維素-GMA DEAEMA(二乙氨乙基異丁烯酸酯)。進(jìn)而公開了一種通過(guò)用1，2-乙二胺胺化的纖維素-GMA基質(zhì)(參見(jiàn)上專利圖9)得到的材料作為用于色譜的固定床，該床具有在說(shuō)明書中類似的結(jié)構(gòu)，不是有關(guān)LPS的去除，而是有關(guān)親合色譜。
美國(guó)專利4，663，163(Houe等)描述了一種物質(zhì)，該物質(zhì)由一種合成聚合物與多糖類經(jīng)共價(jià)鍵鍵合得到，而上述聚合物是通過(guò)一種具有環(huán)氧基和乙烯基的單體與不飽和酸的氨烷基酯進(jìn)行自由基共聚得到的。使用這些物質(zhì)在色譜法中作載體，這與美國(guó)專利4639513中所述的纖維素-GMA-DEAEMA接枝共聚物基本一樣。
在美國(guó)專利4，491，660(Gendrich等)中記載了不溶性聚合物，烷基，苯系環(huán)式化合物通過(guò)與異脲，酰胺鍵相連接的基質(zhì)顯示與內(nèi)毒素相結(jié)合的能力?？烧J(rèn)為此種基質(zhì)對(duì)于熱原質(zhì)的疏水結(jié)合性相當(dāng)好，在此結(jié)構(gòu)中含有由氨基，脒基等含氮官能團(tuán)取代的苯系環(huán)式化合物。
近年來(lái)，能特定地吸附一種熱原質(zhì)且可用于除去與混合在藥物液體中的熱原質(zhì)的親合吸附劑已具有工業(yè)可用性。這種類型吸附劑的代表例包括在日本專利公開號(hào)183712/1982中公開的具有鍵合含氮的環(huán)狀化合物的多糖凝膠。該凝膠在技術(shù)上評(píng)價(jià)很高，因?yàn)樗鼈兙哂羞x擇吸附和從含有大分子量藥物如蛋白質(zhì)的水溶液中除去各種大范圍分子量的熱原質(zhì)的能力。在上述專利公開說(shuō)明書中給出的熱原質(zhì)含量可達(dá)到0.1ng(毫微克)/ml(0.5Eu/ml)或更低。
熱原質(zhì)吸附劑進(jìn)一步要求能處理高離子強(qiáng)度的溶液。在離子交換色譜法中，隨著洗脫劑離子強(qiáng)度的增加而提高洗脫能力。在吸附中離子鍵參與吸附，從上述的事實(shí)中可以明顯看出，隨著溶液離子強(qiáng)度升高，通常吸附力趨向于降低。因此，上述與含氮環(huán)狀化合物結(jié)合的熱原質(zhì)吸附劑去除熱原質(zhì)的能力隨著藥液離子強(qiáng)度提高而降低(參見(jiàn)Biotech.Appl.Biochem.10，147)。相應(yīng)地，從高離子強(qiáng)度溶液中充分地除去各種熱原質(zhì)將對(duì)高濃度藥物溶液的處理帶來(lái)新可能。
眾所周知，抗菌素、多粘菌素均使熱原質(zhì)減活。然而，這些物質(zhì)將會(huì)發(fā)生一系列副作用(腎中毒)，從而限制了它們?cè)谏矬w中的應(yīng)用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，日本專利公開No.16389/1989提出了一種熱原質(zhì)吸附劑，其中多粘菌素被固定在不溶性載體上。
本發(fā)明的目的是提供一種非常安全的吸附分離劑，它具有從高離子強(qiáng)度的溶液中去除二氧磷基多羥基化合物如熱原質(zhì)的能力和承受高流速下壓力的能力。
〔解決問(wèn)題的方法〕按照下列方法可實(shí)現(xiàn)上述目的。即，本發(fā)明提出一種分離方法，該方法包括用多孔吸附劑與含二氧磷基多羥基化合物的溶液進(jìn)行接觸，其中，所說(shuō)的吸附劑具有鏈長(zhǎng)2-50脂肪族胺型的官能鏈，并與基材相鍵合。上述吸附劑孔徑范圍從1nm～20μm。最好使用官能團(tuán)只是鍵合在飽和碳原子上的伯或仲氨基吸附劑。
本發(fā)明提供一種分離劑，該分離劑用來(lái)以多孔吸附分離劑的形式吸附二氧磷基多羥基化合物。上述分離劑包括基材和與其鍵合的官能鏈。其孔徑從1nm～20μm，其中所說(shuō)的官能鏈為脂肪族伯或仲胺官能鏈。
本發(fā)明采用的典型的二氧磷基多羥基化合物的實(shí)例是含熱原質(zhì)的藥物水溶液，其離子強(qiáng)度0.03～0.5，具體說(shuō)，離子強(qiáng)度類似于生理鹽水。然而，本發(fā)明可適用的離子強(qiáng)度范圍可更寬，如從0～5。進(jìn)而，本發(fā)明可適用于低的離子強(qiáng)度范圍(如沒(méi)有離子的藥物溶液)，其中普通的含有含氮環(huán)狀化合物的吸附劑也是非常適用的。
本發(fā)明吸附劑由鏈長(zhǎng)2-50的脂肪族胺型官能鏈與多孔基材結(jié)合而成。脂肪族胺型官能鏈可與雜環(huán)官能鏈、芳香族胺型官能鏈、鈦型官能鏈等不同。而多孔基材并不是孔徑意義上的多孔質(zhì)，并可與通常的纖維或有孔顆粒區(qū)別開來(lái)。這種官能鏈，與高聚物不同。而是具有限定的鏈長(zhǎng)其中含有的堿性含氮官能團(tuán)僅與脂肪族碳原子結(jié)合。官能鏈實(shí)質(zhì)上為鏈?zhǔn)交衔?，含氮環(huán)化合物或芳香族胺等，但本質(zhì)上由官能氮起作用的部分具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物除外。
多孔基材的優(yōu)選例是多羥基聚合物?；钚圆糠秩缌u基基團(tuán)將官能鏈鍵合到基材上是有用的。例如，具有羥基取代的丙烯中間鏈的官能鏈直接鍵合到基材的氧原子上，并且通過(guò)表氯醇與基材的羥基基團(tuán)反應(yīng)進(jìn)而再與亞烷基二胺反應(yīng)得到二氨基亞烷基部分。官能鏈的脂肪族氮原子可進(jìn)而結(jié)合到氨基酸的殘基上。
本發(fā)明的典型特征在于二氧磷基多羥基化合物可從離子強(qiáng)度類似于生理鹽水(如μ＝0.07～0.3)溶液中選擇性地吸附。以下使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性地”意思是指在含有酸基團(tuán)如蛋白質(zhì)的藥物中可基本除去熱原質(zhì)，而藥物可以很高的回收率回收。本發(fā)明的分離劑可在很寬的pH值范圍內(nèi)顯示其選擇吸附作用，例如，在離子強(qiáng)度0.1時(shí)，適用的pH范圍從3～11。
在本發(fā)明中要除去二氧磷基多羥基化合物的典型實(shí)例是熱原質(zhì)，這將在下文詳細(xì)敘述。
本發(fā)明的分離劑常被用作吸附/保留(retention)分離劑，它與所引用的參考文獻(xiàn)中的現(xiàn)有技術(shù)所涉及的色譜技術(shù)是不同的。
多孔吸附劑的典型實(shí)例是堅(jiān)硬的凝膠顆粒，它具有孔徑從10nm～5μm，優(yōu)選50nm～1μm，這種硬凝膠的柱子具有較高耐壓能力(如1kg/cm2.G或更高)，它允許待處理液在高流量下滲透。另外，多孔吸附劑也是微過(guò)濾膜(MF)或超濾膜(UF)的形式。
〔物理形狀和基材〕多孔吸附劑為具有一定孔數(shù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由于具有高耐壓性，當(dāng)流體流過(guò)時(shí)不會(huì)破裂，它的適例包括硬凝膠和微濾膜。
本發(fā)明分離劑包括一種物質(zhì)，在該物質(zhì)中含只與脂肪族碳原子鍵合的堿性氮官能團(tuán)的并由3-50個(gè)原子構(gòu)成的官能鏈鍵合到多孔基材上形成基體骨架。因而，吸附劑的物理形狀常常與在實(shí)際中的基材的形狀相一致。
多孔基材是具有一定孔數(shù)，接受溶液中的熱原質(zhì)后，并盡可能加以吸附的材料。它的具體實(shí)例包括裝填在柱中的凝膠顆粒和具有足夠厚度以與所通過(guò)的液體完全接觸的膜，凝膠顆粒粒徑一般是50～200μm。
另一適例包括非均質(zhì)的超濾膜，它包括一薄而致密的且微孔的表面層部分和厚且具有大孔徑的粗糙的中心部分。上述膜的結(jié)構(gòu)在分離膜的現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。膜的厚度通常是10～1000μm，特殊地是50～300μm，如果需要，也可使用更厚的膜，和一組膜，一個(gè)放在另一個(gè)上面而組成。
親水性凝膠的孔徑可用如下方法測(cè)定。即將充填了凝膠的柱子中流過(guò)已知的斯托克斯半徑，分子量的蛋白質(zhì)，多糖類的樣品溶液，作出表示分子量和保持容量關(guān)系的校正曲線，從兩端求出分區(qū)分子量?？讖绞褂脤?duì)應(yīng)于分子量的斯托克斯半徑。可以采用市售的測(cè)定凝膠過(guò)濾分子量用的標(biāo)準(zhǔn)樣品。樣品與吸附劑的官能團(tuán)反應(yīng)時(shí)，可代用基材測(cè)定值。此外，對(duì)于疏水性基材，也可代用氦法，水銀法等在干燥狀態(tài)下測(cè)定的孔徑。
多孔質(zhì)膜狀吸附體的孔徑在膜分離技術(shù)中被叫做超濾或微濾中其范圍從如1μm～20μm，優(yōu)選10nm～5μm，最常用膜孔徑為50nm～1μm。當(dāng)從含大分子量如蛋白質(zhì)或多糖類藥物溶液中除去熱原質(zhì)時(shí)，當(dāng)然需根據(jù)分子直徑合理選擇膜的孔徑以便藥物的滲透不被阻礙。膜的孔徑一般要按照顆粒粒徑來(lái)確定，該顆粒直徑是從未被吸附到膜上的顆粒直徑和阻滯率之間關(guān)系曲線確定阻滯率達(dá)90%時(shí)的顆粒直徑。有孔顆粒狀凝膠的孔徑也與膜狀分離劑一樣，從1nm～20μm，較好的是10nm～5μm，特別是約50nm～1μm。
多孔硬凝膠基材的實(shí)例包括疏水性合成聚合物顆粒如纖維素，葡聚糖，聚丙烯酰胺和聚乙烯醇以及多孔硅凝膠。瓊脂糖及其衍生物如瓊脂糖(凝膠)通常為軟凝膠，因此，不適宜用于高流量液體通路處理。因?yàn)檫@些物質(zhì)的孔隙在液流壓力下會(huì)破裂。當(dāng)本發(fā)明的實(shí)例中描述的A-1型硬凝膠被裝填在柱內(nèi)，(直徑1Cm，高50Cm)測(cè)量出在液體通道上的損失時(shí)，例如，壓力損失是線性的，直到流量(ml/Cm2.hr，在下文中相同，以柱的空塔速度為基準(zhǔn))超過(guò)1500。在流量為200時(shí)，壓力損失應(yīng)不超過(guò)0.12Kg/Cm2，并近似于表面壓力損失的1/3。另一方面，當(dāng)含瓊脂糖的軟凝膠作為基材被裝在柱內(nèi)且使液體通過(guò)在非常低流量下，也會(huì)觀察到壓力損失很快增加。在流量為200時(shí)，壓力損失為0.8Kg/Cm2.G.為了有效地進(jìn)行吸附/保留，在一定流量如200時(shí)的壓力損失應(yīng)為0.5Kg/Cm2.G或更低，優(yōu)選0.25Kg/Cm2.G或更低。
多孔微濾膜基材實(shí)例包括由各種材料制成的膜，如纖維素膜，聚乙烯醇膜，聚砜膜。
膜的形狀不特別限制，平板膜，中空纖維膜，管式膜都可使用。上述各種膜均可用相應(yīng)膜組件形式。如，膜組件的實(shí)例包括螺旋形的，Preat，板框式，管和中空纖維組件。
通常，基材是不溶解的，如不溶解于待處理的液體，溶劑常常是水，在特殊情況下，也可能使用非水溶劑如乙醇，丙酮，乙腈，DMSO和氯仿或它們的水溶液。不管基材是不溶解的或溶解于吸附劑的形成過(guò)程中，只要它不溶解于最終的吸附劑中即可，該吸附劑具有鍵合的脂肪族含氮官能鏈。許多水不溶多糖類基材同樣也不溶于有機(jī)溶劑中。
一般，基材是高分子量物質(zhì)，在許多情況下，直鏈有機(jī)聚合物由于分子間力是聚集狀態(tài)?；牡慕Y(jié)構(gòu)使脂肪族含氮官能鏈可直接的或間接的被固定定位。例如，它有一活性位置(如活性氫)，該活性位置可與如羥基或氨基等官能團(tuán)或其它物質(zhì)反應(yīng)。
基材的特殊實(shí)例包括多糖類(包括它們的衍生物如氨烷基化多糖類，羧烷基化多糖類，如纖維素和其衍生物;瓊脂糖和其衍生物，可交聯(lián)的葡聚糖和其衍生物和脫乙酰殼多糖，這些均在日本專利公開號(hào)183712/1982中論述)，合成有機(jī)聚合物(如聚丙烯腈，聚砜，聚酰胺，聚乙烯醇，聚苯乙烯和聚丙烯酸樹脂，羥烷基化、氨烷基化和鹵代烷基化的聚苯乙烯樹脂，和聚丙烯酰胺樹脂均在上述同一公開說(shuō)明書中提到)，以及無(wú)機(jī)聚合物(如硅凝膠，玻璃如氨基丙醇鹽(amino Propylated)多孔玻璃以及各種陶瓷)。進(jìn)而，同樣可選擇日本專利公開號(hào)183712/1982中描述的水不溶性載體為基材。用于同配合物形成鍵合的官能團(tuán)如羥基或氨基，可通過(guò)多種方法如羥甲基化或還原作用將其引入到上述的基材中。
上述基材構(gòu)成一種粒子或膜，因而具有三維結(jié)構(gòu)，可直接地或通過(guò)間隔基(Spacer)鍵合到含氮環(huán)狀化合物上。基材，配位體和間隔基的分子結(jié)構(gòu)加上較高級(jí)的結(jié)構(gòu)，如分子的締合和孔的形成，對(duì)吸附劑與液體的接觸具有重要作用。
實(shí)際上，選擇適合的基材對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施是非常重要的。
(鍵合官能團(tuán)到基材上)例如，將官能鏈直接或間接地定位到包含組成膜的基材的載體上的鍵合方法包括共價(jià)鍵合，離子鍵合，疏水鍵合，配位鍵合等。在它們當(dāng)中，希望通過(guò)共價(jià)鍵定位，因?yàn)樗鼘?duì)清除含氮環(huán)化合物敏感性很差。共價(jià)鍵的實(shí)例包括酰胺，酯，醚，氨基，亞氨基，硫醚，二硫醚，和砜鍵。
一個(gè)官能團(tuán)或間隔基可鍵合到基材上。通過(guò)下列方法，基材用下述材料活化鹵化氰(如溴化氰)，環(huán)氧化合物(如表氯醇或雙環(huán)氧乙烷)，鹵代有機(jī)酸鹵化物(如氯乙酰氯或tresyl氯)，二醛(如戊二醛)，苯醌等。然后鍵合具有氨基，羥基，硫羥基或羧基基團(tuán)的含氮環(huán)狀化合物或間隔基。
用于鍵合或定位且使用間隔基載體的間接方法包括環(huán)氧化作用(表氯醇，雙環(huán)氧乙烷)，脫水縮合作用(WSC，EEDO)，還原胺化作用(NaCN+甲硼烷，二甲胺+甲硼烷)和硫羥活化作用(PySSPy)。在這些方法中，載體間隔基衍生物具有一個(gè)基團(tuán)如環(huán)氧基，羥基，氨基，肼基，甲酰，硫羥，該衍生物通過(guò)使用縮合劑，活化劑(在每種方法說(shuō)明之后附帶給出實(shí)例)轉(zhuǎn)化成為活性中間體，然后與具有如氨基，羥基，醛或硫羥基團(tuán)的配位體鍵合。
通過(guò)環(huán)氧化作用制備的吸附劑比現(xiàn)行技術(shù)中最普通的溴化氰方法好得多，在上述現(xiàn)行技術(shù)中，依靠較穩(wěn)定的配位體的定位非特殊的吸附作用是很低的。這使在本發(fā)明中環(huán)氧化作用更為優(yōu)越。
除了共價(jià)鍵合的其它定位方法的實(shí)例包括依靠離子鍵合，具有強(qiáng)堿取代基脂肪族含氮官能鏈被定位到具有鍵合到表面的強(qiáng)酸性基團(tuán)的載體上(用于陰離子色譜的市售填料)。并且與具有由十八烷基，辛基，苯基等制得的疏水物的表面的基材以及與具有疏水鍵鍵合的(動(dòng)態(tài)除漬)長(zhǎng)鏈烷基基團(tuán)或苯基基團(tuán)的配位體鍵合。
基材，間隔基和脂肪族含氮官能鏈相互鍵合的定位過(guò)程，在上述同一公開的說(shuō)明書已詳細(xì)描述。在本發(fā)明中，配位體的定位可通過(guò)應(yīng)用這些已公開的技術(shù)進(jìn)行。
上述配位體定位技術(shù)可用到例3描述的膜形的材料的操作和在例1中迄今沒(méi)有膜形的材料的操作中。
(官能鏈)在多孔吸附劑中，鍵合到基材上的官能鏈具有僅與脂肪族的碳原子相結(jié)合的堿性含氮官能團(tuán)并由3-50個(gè)原子構(gòu)成的鏈。官能鏈的鏈取代原子(鏈長(zhǎng))的數(shù)指的是在最長(zhǎng)原子鏈中取代連續(xù)鏈的原子數(shù)。例如，在官能鏈CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NH2中，如鏈取代原子是11，即中間鏈的3個(gè)原子(取代丙烯)和二氨己烯的8個(gè)原子。
堿性氮官能團(tuán)只與脂肪族碳原子相鍵合，脂肪族碳原子的代表例為亞甲基的碳原子，支鏈烷基的仲碳原子，叔碳原子也可以，原則上應(yīng)為飽和碳原子。作為堿性氮官能團(tuán)有伯胺，仲胺，叔胺，季銨，亞胺(＝NH)等。脒基，胍基，只限于鍵合在脂肪族碳原子上的，可以整體地認(rèn)為是非環(huán)式氮官能團(tuán)，可是像異脲那樣結(jié)合在氧原子上的應(yīng)排除在外。在氮官能團(tuán)中，最好是伯氨基(-NH2)，仲氨基(-NH-)。因?yàn)檫@些基團(tuán)具有相應(yīng)的堿性和能承受位阻現(xiàn)象引起的小故障。含有非常弱堿性氮原子的吸附劑，如胺或腈，一般在吸附性能上是較差的。
現(xiàn)有吸附劑中常見(jiàn)的肽結(jié)構(gòu)，不包含在本發(fā)明的堿性官能團(tuán)中，把只是與脂肪族的碳原子結(jié)合的堿性氮官能團(tuán)中的氮原子稱為脂肪族氮原子。
氮原子可是端部組成原子或中間原子。另外，它可為側(cè)式(Pendant-type)氮原子，這種側(cè)式氮原子可直接地或是經(jīng)由另外的脂肪族原子鍵合到中間原子上。
最好，官能鏈包括伯或仲氨基脂肪族氮原子和一個(gè)具有3個(gè)或更多碳原子相鄰的鏈。在上述的官能鏈中己烯基(和羥基取代的丙烯基)鄰接到二個(gè)氮原子上。
如上所述，實(shí)質(zhì)上是鏈長(zhǎng)較短的鏈?zhǔn)交衔?，而?duì)于含氮雜環(huán)化合物，芳香族胺等，在本質(zhì)上由官能氮起作用的部分具有環(huán)式結(jié)構(gòu)的官能鏈除外?？墒?，與氮官能團(tuán)非相鄰部分可允許存在環(huán)式結(jié)構(gòu)(如芐基胺型結(jié)構(gòu))。
官能鏈的代表例包括直接鍵合到基材上的中間鏈和含氮原子部分。含脂肪族氮原子部分的代表例包括從亞烷基二胺或開鏈堿性氨基酸的衍生物，盡管單個(gè)氨基酸也可使用。中間鏈與脂肪族含氮原子部分的摩爾比不一定等于1∶1。
含中間鏈的吸附劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)可大致分類如下基材-中間鏈，-含氮部分;
基材-中間鏈，-含氮部分，-中間鏈-基材;
基材-中間鏈-含氮部分A-含氮部分B和
例如，當(dāng)六亞甲基二胺同環(huán)氧甲基化基材反應(yīng)時(shí)，第一類吸附劑(1∶1反應(yīng)產(chǎn)品)伯氨基和仲氨基的摩爾比為1∶2，而第二類(1∶2反應(yīng)產(chǎn)品)僅僅有仲氨基。在實(shí)際中有時(shí)會(huì)觀察到這二種反應(yīng)會(huì)同時(shí)進(jìn)行，因而獲得的這些反應(yīng)產(chǎn)品是以混合物形式存在的。這些反應(yīng)產(chǎn)品混合物成分可由分析氨基基團(tuán)來(lái)測(cè)定。在某種情況下，這些吸附劑在性能上相互之間沒(méi)有多大區(qū)別。然而有時(shí)會(huì)觀測(cè)到混合物中含有更多量的第二類產(chǎn)品，在性能上相對(duì)于另一種要好得多。
中間鏈長(zhǎng)通常范圍是2～10，如果需要，可通過(guò)引入如間隔基而延長(zhǎng)。當(dāng)使用表氯醇時(shí)，所形成的鏈長(zhǎng)為3的中間體為主要產(chǎn)品。然而，也會(huì)觀察到帶有多個(gè)表氯醇分子的加合物或?yàn)槟撤N目的作為付產(chǎn)物。
現(xiàn)在借助實(shí)例來(lái)說(shuō)明官能鏈對(duì)基材的鍵合方法，用多羥基聚合物作為基材?；目蛇x自那些在其內(nèi)部含大量羥基基團(tuán)的物質(zhì)(如多糖類，聚乙烯醇聚合物，或硅凝膠)，這些物質(zhì)可通過(guò)引入大量羥基基團(tuán)進(jìn)入其它聚合物得到。脂肪族含氮原子部分可直接鍵合到基材上。例如，氨烷基纖維素可由纖維素和氨烷基氯化物反應(yīng)而獲得。然而在許多情況下，含氮原子部分可用接合劑鍵合到基材上。接合劑可為表氯醇，戊二醛或溴化氰，也可用如上所述的分別具有3，5或1個(gè)碳原子鏈的中間體。
為了形成含氮原子部分，可采用含有多個(gè)氨基的化合物如堿性鏈氨基酸或含有單個(gè)氨基的化合物如氨烷基氯化物。最簡(jiǎn)單的是用氨來(lái)實(shí)現(xiàn)該目的。
這些反應(yīng)的結(jié)果使含有氨基和與它鄰接的碳鏈官能鏈被鍵合到基材上。碳鏈可位于氮原子和基材之間或在相反的一側(cè)。如上所述，可使官能鏈與基材交聯(lián)的方式設(shè)置。
現(xiàn)在給出官能鏈的實(shí)例下列脂肪族鏈A～D具體表示如下A-CH2CH(OH)CH2NHRR為氫原子和以下的(在括號(hào)中是與R一致的化合物RNH2或ROH名稱)。
C(-NH)NH2〔胍〕，(CH2)nCH2(n＝1～12，如6)，〔亞烷基二胺〕，COCH(NH2)(CH2)4NH2〔賴氨酸〕COCH(NH2)(CH2)3NH2(鳥氨酸)，COCH(NH2)(CH2)3NHC(-NH)NH2(精氨酸)，〔含2個(gè)或多個(gè)伯和仲氨基的天然多胺，如亞精胺，精胺〕B-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)5NHRR為(CH2)nNH2(n＝1～12)，(CH2)nNHC(-NH)NH2(n＝1～12)C-CH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2CONHRR為(CH2)nNH2(n＝1～12)，(CH2)nNHC(-NH)NH2(n＝1～12)D-CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NHRR為C(-NH)NH2，COCH(NH2)(CH2)4NH2，(CH2)nNH2(n＝1～12)進(jìn)而可用以下形式的胺型官能鏈表示。
-CH2CH2NHR-(CH2CH2NH)nR
R為氫，烷基，烷氨基或脒基，
A為氫或甲基。
(典型分離劑)典型的分離劑包括作為基材的纖維素和上述-CH2CH(OH)CH2NHR-型脂肪鏈，R是氫的分離劑可用基材縮合表氯醇，用氨開環(huán)而獲得。B-1型式實(shí)例所示的分離劑是以纖維素作為基材的一類。它是凝膠顆粒的形式，粒徑50～200μm，孔徑約100～500nm。
所給的各類型的分離劑(除了那些R是H之外)可通過(guò)B-1型分離劑或在制備其過(guò)程中獲得的中間產(chǎn)品與上述括號(hào)中給出的各種化合物反應(yīng)得到。A-1型分離劑是具有脂肪鏈CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NH2的纖維素衍生物，上述脂肪鏈用六亞甲基二胺與纖維素/表氯醇的縮合物的開環(huán)反應(yīng)獲得的。A-1型分離劑可以同賴氨酸，鄰-甲基異脲或精氨酸反應(yīng)，分別得到A-2，A-3或A-4型。進(jìn)而，B-1型分離劑可與賴氨酸，鄰-甲基異脲或精氨酸反應(yīng)，分別得到B-2，B-3或B-4型。
此外，用瓊脂糖代替纖維素用作基材的分離劑也可以使用，但因這些分離劑是軟凝膠，不適宜在高流量時(shí)使用。
用合成樹脂作基材的分離劑的實(shí)例如下聚苯乙烯苯乙烯/DVB共聚物的苯環(huán)在對(duì)位氯甲基化并與三乙基胺反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步與六亞甲基二胺反應(yīng)得到分離劑，該分離劑中的官能鏈CH2NH(CH2)6NH2鍵合到聚苯乙烯樹脂的基材上。親水乙烯基聚合物在上述A-1型分離劑制備過(guò)程中，使用Epoxy ToyoPearl 650M(Toyo Soda Mfg Co.Ltd.產(chǎn)品)作為基礎(chǔ)凝膠代替纖維素/表氯醇縮合物。當(dāng)獲得的產(chǎn)品(顆粒粒徑44～88μm)裝填入柱中(內(nèi)徑16mm，高150mm)，可在壓力為0.2Kg/Cm2.G，流量為0.51/hr(SV＝17)下處理液體。
PVA例3給出了以膜的形式的分離劑PVA。分離劑可以是粒狀。
聚砜官能鏈可很容易鍵合到如聚砜MF膜上，該膜具有氨基基團(tuán)，市售作為載體用來(lái)固定酶。在被戊二醛活化后，膜同含脂肪族氮原子化合物反應(yīng)。通過(guò)用六亞甲基二胺在鄰氮原子處形成有5-和6-碳原子的官能鏈。
(處理方法)現(xiàn)在將本發(fā)明待應(yīng)用的液體分為4種類型，分別描述它們的處理方法和分離性能。
第1種含酸性聚合物的試樣該類型代表例是一種酸性蛋白質(zhì)溶液(如HSA)。雖然熱原質(zhì)和藥物都帶負(fù)電荷，但是熱原質(zhì)對(duì)分離劑的結(jié)合力較強(qiáng)，因此熱原質(zhì)可被選擇性吸附。為了實(shí)現(xiàn)選擇性吸附，最好控制離子強(qiáng)度稍高一些(μ＝0.02～0.2)。當(dāng)去除熱原質(zhì)的效果不好時(shí)，應(yīng)調(diào)整離子強(qiáng)度到0.02～0.07，如果需要，處理要靠近藥物的等電點(diǎn)進(jìn)行。當(dāng)藥物的回收率很低時(shí)，所采用的吸附劑的量應(yīng)減小至適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，并且要在藥物的等電點(diǎn)以下進(jìn)行處理。
第2種含堿性聚合物的試樣這是最困難的一種，因?yàn)樗幬锘螂s質(zhì)是帶正電荷的，因而對(duì)熱原質(zhì)有親合力。最好在離子強(qiáng)度0.1或以下進(jìn)行熱原質(zhì)吸附。然而，當(dāng)堿性物質(zhì)對(duì)熱原質(zhì)的親合力高時(shí)，則要提高離子強(qiáng)度。當(dāng)除去率不好時(shí)，處理應(yīng)在pH8到試樣的等電點(diǎn)的范圍內(nèi)進(jìn)行。然而在此情況下應(yīng)當(dāng)小心，因?yàn)樵诳拷入婞c(diǎn)處試樣的溶解度會(huì)減弱。
第3種ν-球蛋白制劑等最好，在靠近PH7和離子強(qiáng)度0.1或以上處理中性高分子量蛋白質(zhì)。當(dāng)PH降低至接近5時(shí)，熱原質(zhì)由球蛋白吸附，去除率會(huì)下降。
第4種滲析液，糖類，氨基酸輸液等pH值最好從3～10，離子強(qiáng)度將不會(huì)影響除去熱原質(zhì)的效率。然而，當(dāng)堿性和低分子量的有機(jī)物污染時(shí)，最好調(diào)整離子強(qiáng)度到0.02或以上。
(分離功能)本發(fā)明的多孔吸附劑能選擇吸附和分離二氧磷基多羥基化合物，如生理活性物質(zhì)溶液中的熱原質(zhì)。生理物質(zhì)包括氨基酸，如組氨酸，丙氨酸和脯氨酸等;核酸堿如腺嘌呤和胞嘧啶等，抗菌素如青酶素G，激素如胰島素;維生素如黃素;腺嘌呤和三核苷酸;血清蛋白質(zhì)如清蛋白和ν-球蛋白;酶如尿激酶，天門冬酰胺酶和溶菌酶;抗體如免疫球蛋白;和疫苗如流感疫苗。本發(fā)明應(yīng)用于注射液如葡聚糖，果糖，葡萄糖;輸血的檸檬酸鈉溶液;靜脈滴注法和過(guò)濾型的人工腎的補(bǔ)充液。所應(yīng)用的液體其離子強(qiáng)度和濃度可不同，可直接給藥于生物體的液體，其離子強(qiáng)度一般約為0.15，類似生理鹽水。
待處理的熱原質(zhì)粘污的液體的濃度變化很寬。最好，所述的濃度是幾十個(gè)μg/ml或以下。具體說(shuō)，本發(fā)明的分離劑可吸附或去除痕量(如100ng/ml或以下)的熱原質(zhì)。當(dāng)在藥物中的熱原質(zhì)濃度非常高時(shí)，在用本發(fā)明的分離劑之前需使用UF膜等進(jìn)行予處理。
當(dāng)基材是凝膠時(shí)，用本發(fā)明的分離劑處理可以間歇法進(jìn)行或柱式進(jìn)行。
按照本發(fā)明，分離方法取決于熱原質(zhì)的濃度，熱原質(zhì)含量相當(dāng)?shù)偷囊后w，如500EU/ml，可用一般厚度膜有效處理。用厚膜或Liminates膜可以處理高含量熱原質(zhì)。在該方法中孔徑使高濃度進(jìn)料流有效分離，而吸附使低濃度的出料流分離。這表明一種處理，二種方式。不需要予處理。
在本發(fā)明中，熱原質(zhì)一般通過(guò)吸附和保留從高離子強(qiáng)度的溶液中分離。這種吸附/保留方法與吸附和洗脫同時(shí)進(jìn)行的色譜分離法不同，在藥物親合力特別高時(shí)對(duì)于一種吸附劑，可能觀察到回收率很低。在這種情況下，用高離子強(qiáng)度溶液處理已吸附熱原質(zhì)和藥物一起的吸附劑，從而使藥劑可以選擇性地被洗脫和回收。
(耐堿性和再生性能)吸附了熱原質(zhì)的分離劑，常在堿性條件下處理再生。本發(fā)明的分離劑在0.2N NaOH(20%乙醇溶液)中，即使放置一個(gè)月，性能也不變化，對(duì)于堿性是穩(wěn)定的。如在實(shí)施例16的測(cè)定方法中，反復(fù)進(jìn)行10次再生后才看到性能變化?？梢钥闯?，本發(fā)明的分離劑與具有肽為主體的官能鏈的現(xiàn)有產(chǎn)品相比，具有優(yōu)良的耐堿性和再生性能。
〔發(fā)明效果〕本發(fā)明提供的分離方法，用具有特殊結(jié)構(gòu)的分離劑將二氧磷基多羥基化合物有效地從高離子強(qiáng)度的溶液中除去。此方法去除率，最終濃度，藥物回收率非常好而且很安全。在該方法中使用的一些分離劑作為物質(zhì)本身都是已知的或者作為合成過(guò)程的中間物曾提出過(guò)。而且一些分離劑是已知的用于不同目的的分離劑。如，作為分析色譜法的載體。然而一些典型分離劑至今還不知道可作為分離劑。本發(fā)明進(jìn)而提供了一種新的分離劑。
本發(fā)明分離劑的使用使得可能從相對(duì)高離子強(qiáng)度溶液中去除熱原質(zhì)。進(jìn)而，從含藥物如蛋白質(zhì)中去除熱原質(zhì)，用一次間歇處理，效率可高達(dá)99%。也就是說(shuō)，用上述分離劑處理可降低熱原質(zhì)在溶液中的含量，從100ng/ml和1ng/ml降至1ng/ml，10pg/ml。在不含藥物如蛋白質(zhì)的溶液的情況下，通過(guò)單個(gè)間歇處理熱原質(zhì)含量從100ng/ml可降至1pg/ml或更低(檢測(cè)限度以下)，相應(yīng)去除率可達(dá)99.999%或更高。
另外，本發(fā)明的分離劑較之普通的熱原質(zhì)吸附劑可在很寬的pH范圍內(nèi)使用。適用的pH范圍取決于離子強(qiáng)度，如在離子強(qiáng)度0.1時(shí)，所使用的pH從3～11。
本發(fā)明分離劑的作用原理至今還不十分清楚。然而，本發(fā)明假定的分離劑作用原理如下也就是說(shuō)，包括基材和官能脂肪族鏈的分離劑通過(guò)它的孔與通過(guò)的流體進(jìn)行緊密接觸，因而選擇性地吸附保留了熱原質(zhì)。基材是由大分子組成的，從而分離劑作為整體是不溶解的。進(jìn)而，基材是多孔的，因而脂肪族鏈在空間結(jié)構(gòu)上有一些自由度。也就是說(shuō)，分離劑的結(jié)構(gòu)適宜于接受大分子(如熱原質(zhì)或核酸)，并且通過(guò)適當(dāng)?shù)乜刂乒倌苕湹奈恢锰峁┪阶饔?。一些普通吸附劑如堿性離子交換樹脂含大孔基材，氨基可鍵合到其上面。雖然這些吸附劑能除去水中的熱原質(zhì)，但是，它不能選擇性地吸附含藥物溶液中的熱原質(zhì)使去除率達(dá)到99%。因?yàn)樵谒慕Y(jié)構(gòu)中沒(méi)有任意的自由度。
本發(fā)明的官能脂肪鏈?zhǔn)?～50原子組成的脂肪鏈。當(dāng)應(yīng)用于離子強(qiáng)度很高的溶液時(shí)，和普通的包含有含氮環(huán)狀化合物作為官能鏈的熱原質(zhì)吸附劑比較。本發(fā)明可提供特別優(yōu)良效果。因?yàn)楸景l(fā)明的官能鏈攜帶3個(gè)或更多的組成原子，官能鏈所具有的自由度在離子交換樹脂中是不能予計(jì)的。對(duì)于離子交換樹脂，其中氨基可直接地鍵合到基材的聚苯乙烯芳環(huán)上(組成鏈(Chain-Constituting原子數(shù)0)。另一方面，本發(fā)明組成鏈原子數(shù)比多粘菌素(一種抗生素)更小，并且可以采用相對(duì)簡(jiǎn)單的分子作為脂肪鏈。因此，即使脂肪鏈從基材中釋放出并進(jìn)入待處理的液體，幾乎不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的生理副作用。
在本發(fā)明中，含短鏈和相對(duì)簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的含氮脂肪鏈被鍵合到基材上。因而，分離劑所需達(dá)到的吸附性能可通過(guò)改變含氮脂肪鏈的結(jié)構(gòu)而獲得，這取決于熱原質(zhì)和藥物的多種組合。在一些現(xiàn)有技術(shù)中會(huì)看到大分子量的交聯(lián)接枝共聚物是一種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的混合物，因而包括可影響其性能的許多因素。因此，在這種情況下，研制可滿足各種需要的各種系列的產(chǎn)品就顯然很困難，這和本發(fā)明不同。
上述結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的分離劑可用于離子強(qiáng)度為0.16的人血清白蛋白溶液的間歇處理，該溶液是由100ng/ml E.CoLi OlllB4(用酚萃取食鹽)和市售的HSA(濃度5%)制得的樣品，借此去除達(dá)90～99%的熱原質(zhì)。
(實(shí)例)
在以下說(shuō)明中，“濕”(wet)表示以濕重為準(zhǔn)，盡管給出的分析數(shù)據(jù)是以干重為準(zhǔn)。
實(shí)例1(分離劑)A-1型用水洗滌并且抽濾2分鐘脫水后，50g(濕)的顆粒狀的多孔纖維素凝膠載體a被分散在100ml0.6N苛性蘇打中。加入16ml表氯醇，其混合物在60℃反應(yīng)30分鐘，接著過(guò)濾，用水清洗。將在100ml水中溶解4ml 65%六亞甲基二胺制得的配位體溶液加入到得到的環(huán)氧活化了的中間物(b)中。然后，讓生成的混合物在70℃反應(yīng)1小時(shí)。過(guò)濾并用水洗滌，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至10.4之后，用水洗滌反應(yīng)混合物并脫水。得到大約55g A-1型(C)濕的吸附劑。
g/濕/g干(a)17.0 1.82ml/g濕(b)15.8 環(huán)氧含量(μmol/g干)174(c)18.2 1.45ml/g濕六亞甲基二胺含量(μmol/g干)133(元素分析)該分離劑有CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NH2鏈(鏈長(zhǎng)11)作為主要官能鏈。
類似地，通過(guò)改變反應(yīng)條件可獲得六亞甲基二胺含量從50～600的分離劑。通過(guò)改變反應(yīng)條件得到的一些分離劑可帶有CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NH CH2CG(OH)CH2鏈(鏈長(zhǎng)14)和CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NH2鏈(鏈長(zhǎng)11)作為主要鏈。
A-2型用賴氨酸縮合上述A-1型分離劑得到。
官能鏈CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NHCOCH(NH2)(CH2)4NH2。
A-3型用鄰-甲基異脲縮合上述A-1型分離劑，從而得到最后的胍最終物。
官能鏈CH2CH(OH)CH2NH(CH2)6NHC(＝NH)NH2B-1型加入表氯醇和氨到作為基材的多孔纖維素凝膠中而得到。
官能鏈CH2CH(OH)CH2NH2，CH2CH(OH)CH2NHCH2CH(OH)CH2顆粒粒徑為約50～200μm和孔徑約100～500μm。
B-2型用賴氨酸縮合上述B-1型分離劑而得到。
官能鏈CH2CH(OH)CH2NH COCH(NH2)(CH2)4NH2。
B-3型用鄰-甲基異脲縮合上述B-1型分離劑得到。
官能鏈CH2CH(OH)CH2NHC(＝NH)NH2。
市售吸附劑每個(gè)都可高效地去除熱原質(zhì)。
IRAAmberlite(商標(biāo))IRA-98弱堿性陽(yáng)離子交換樹脂。包括大孔聚苯乙烯顆粒作為基材并且二甲基氨基基團(tuán)直接鍵合到作為配位體的芳環(huán)上。
TEAE和DEAE由Serva公司生產(chǎn)的纖維素離子交換材料包括微纖維纖維素(不是多孔的而是微顆粒狀的)。配位體TEAE是OCH2CH2N+(C2H5)3，它由取代纖維素OH基得到。而DEAE配位體是OCH2CH2N(C2H5)2分別表示強(qiáng)堿和普通的中性性質(zhì)。
BCW脫乙酰殼多糖(Chitosan)顆粒BCW Series 2503(由Fuji Spinning Co.Ltd.生產(chǎn))強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂經(jīng)由化學(xué)鍵將季銨接合到脫乙酰殼多糖顆粒上。
(待處理的液體)試驗(yàn)溶液1市售的HSA(人工血清蛋白，濃度5%，離子強(qiáng)度μ＝0.02)含100ng/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素E.CoLi OlllB4。
試驗(yàn)溶液2市售的HSA(濃度20%，離子強(qiáng)度μ＝0.07)含100ng/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素E.CoLi OlllB4。
試驗(yàn)溶液3通過(guò)加入食鹽到試驗(yàn)溶液1中，調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度到μ＝0.16。
試驗(yàn)溶液4加入食鹽到市售HSA(濃度5%)從而調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度到0.16，然后加入1ng/ml E.CoLiOlllB4。制得。
試驗(yàn)溶液5加入100ng/ml E.CoLiOlllB4到無(wú)熱原質(zhì)的水制得。
〔除去熱原質(zhì)(間歇法)〕試驗(yàn)方法將每種試驗(yàn)液1ml和100mg(濕)分離劑在無(wú)熱原質(zhì)的玻璃試管內(nèi)，在室溫下以50rpm(轉(zhuǎn)/分)攪拌1小時(shí)。接著，使用Limulius ES-test，WaKo(商標(biāo))和Toximometer-ET-201(均為Wako pure Chemical Industries Ltd.生產(chǎn))，用比濁法確定存在于溶液中的熱原質(zhì)濃度，由此計(jì)算熱原質(zhì)去除率。通過(guò)PC分析確定HSA回收率。
結(jié)果，表1給出了用各種分離劑處理試驗(yàn)溶液的結(jié)果。本發(fā)明的分離方法表明在較高的離子強(qiáng)度區(qū)域內(nèi)具有優(yōu)良去除熱原質(zhì)的性能。
表1A-1 B-1 A-2 B-2試驗(yàn)溶液1 去除率% 36 34 81 69回收率% 72 98 68 90試驗(yàn)溶液2 去除率% 95 90 91 81回收率% 95 101 102 102試驗(yàn)溶液3 去除率% 93 99 98 86回收率% 84 100 96 96試驗(yàn)溶液4 去除率% 97 99回收率% 92 100試驗(yàn)溶液5 去除率% 在每種情況下＞99.999%。
比較例1用市售的離子交換材料按例1描述的同樣方法處理試驗(yàn)溶液2，其結(jié)果，一些離子交換材料表明去除熱原質(zhì)的效果可達(dá)到一定程度，但是它們之中沒(méi)有一個(gè)可將90%或以上的熱原質(zhì)除去。
表2IRA TEAE DEAE BCW試驗(yàn)溶液1 去除率% 5 0 0回收率% 98 97 99試驗(yàn)溶液2 去除率% 76 30 0 47回收率% 97 97 99 94實(shí)例2用0.1g(濕)A-1型分離劑，用間歇吸附法檢測(cè)在2ml的藥物水溶液中天然熱原質(zhì)的去除性能。
表3給出所用的試樣，處理?xiàng)l件和獲得的結(jié)果。
實(shí)例3 含氮脂肪鏈PVA膜的制備三個(gè)聚乙烯醇(PVA)中空纖維膜(Kuraray SF-401;均勻膜，其孔徑約0.1μm;內(nèi)徑330μm，膜厚125μm，有效長(zhǎng)度5.5cm)用環(huán)氧樹脂固定在玻璃管內(nèi)，以制備小型組件。然后用如上制備的該組件按照步驟(1)～(5)，使中空纖維膜與液體接觸，以使膜進(jìn)行各種處理。這些處理包括組成膜的材料的化學(xué)反應(yīng)，從而制得本發(fā)明的AH-PVA膜吸附劑。在該情況下，在中空纖維膜內(nèi)和外部，以流量20～50ml/min循環(huán)液體，使膜與液體接觸。通過(guò)浸入整個(gè)膜在水浴中來(lái)調(diào)節(jié)溫度。
(1)洗滌(1M NaCl，純水)，(2)環(huán)氧化作用(60℃在90ml 1N NaOH中;進(jìn)而加入10ml表氯醇，體系在該溫度下保持2小時(shí))，(3)洗滌(純水)，(4)間隔基鍵合(40ml0.625%六亞甲基二胺水溶液，60℃，2小時(shí))(5)清洗(純水)。制得用作吸附劑的AH-RVA膜。
AH-PVA與PVA膜的元素分析值(%)如下樣品 碳 氫 氮作原料的PVA膜 55.14 7.92 0.02AH-PVA膜 54.92 8.00 0.17實(shí)施例4熱原質(zhì)的去除含濃度為3300EU/ml的熱原質(zhì)E.OlllB4(1ng或5.5Eu)的未處理水50ml循環(huán)通過(guò)例3制得的面積為1.7cm2的AH-PVA膜。以流量13ml/min加入小型組件，用壓力旋塞調(diào)節(jié)膜滲透率至0.2ml/min(70l/m2.hr)。供壓約0.2kg/cm2.G。用LimulusES-test，WaKO(商標(biāo))和Toxinometer ET-201)(均為WaKo pure Chemical Industries Ltd的產(chǎn)品)測(cè)定滲透液的熱原質(zhì)濃度。
當(dāng)滲透液量為25ml，熱原質(zhì)濃度和去除率分別為0.33Eu/ml和99.99%。
為了比較，用同樣的PVA中空纖維膜小型組件進(jìn)行同樣試驗(yàn)，如用于例3作為制備吸附劑的原料。用膜分離后得到的滲透水的熱原質(zhì)濃度和去除率分別是627EU/ml和81%。
實(shí)例5生理鹽水的處理用實(shí)例4的面積為1.7cm2的AH-PVA膜，處理0.9%的含4630Eu/ml熱原質(zhì)(μ＝0.15)的鹽水，得到0.08Eu/ml的熱原質(zhì)濃度和去除率為99.998%。用PVA膜比較得到的結(jié)果為1120Eu/ml和去除率為76%。
實(shí)例6處理分子量大約12，500的細(xì)胞色素C含1130Eu/ml熱原質(zhì)的200ml10.0%的細(xì)胞色素，PH9.0時(shí)μ＝0.02，用例4所示的同樣方法，使用例3的有效面積50cm2的AH-PVA膜進(jìn)行處理。循環(huán)流量100ml/min，通量為4.5ml/min，得到處理液中熱原質(zhì)含量為0.23Eu/ml，去除率99.98%。d細(xì)胞色素含量10.0%兔子試驗(yàn)結(jié)果為陰性，用PVA膜比較得到的去除率45%，熱原質(zhì)含量為622Eu。
實(shí)例7人工血清清蛋白的處理(HSA)用例6的AH-PVA膜組件處理pH6.5，μ＝0.07，含85Eu/ml的熱原質(zhì)的100ml 20%的HSA。得到熱原質(zhì)含量0.84Eu/ml和去除率99%。用PVA膜比較得到75Eu/ml，去除率12%。
實(shí)例8(離子強(qiáng)度的影響，pH值為7)將0.1gA-1型分離劑加入到1ml含100ng/ml的熱原質(zhì)的多種濃度的鹽水溶液中。在25℃，以25rpm攪拌1小時(shí)后，按清液中熱原質(zhì)濃度確定每種分離劑的吸附率。離子強(qiáng)度和熱原質(zhì)的吸附率的關(guān)系如下?？梢宰C實(shí)在離子強(qiáng)度的寬范圍內(nèi)，分離劑都具有高吸附率。
離子強(qiáng)度 0.1 0.2 0.35 0.7 1.2 1.7 2.0吸附率(%) 99.98 99.3 98.2 97.8 97.5 96.5 97.9上面應(yīng)用的熱原質(zhì)來(lái)源于E.CoLi OlllB4中的一種。
(比較例)當(dāng)用包括含氮環(huán)狀化合物分離劑作為配位體的吸附劑時(shí)，在低離子強(qiáng)度時(shí)吸附率降低。吸附率降低的程度依所用的熱原質(zhì)而改變。例如，在熱原質(zhì)來(lái)源于E.CoLi UTK-B時(shí)，如直到離子強(qiáng)度達(dá)到0.1時(shí)，吸附率一直保持100%，然后當(dāng)μ是0.2時(shí)降至82%，如為0.3則降至5%。另一方面，在熱原質(zhì)來(lái)源于E.CoLi O128B12時(shí)，當(dāng)μ是0.1時(shí)吸附率為40%，當(dāng)μ為0.2時(shí)，吸附率為0%。
實(shí)例9(pH的影響)按實(shí)例8描述的同樣方法試驗(yàn)pH值(μ＝0.1)不同的熱原質(zhì)水溶液(1000ng/ml)，所使用的熱原質(zhì)，其濃度和所使用的分離劑與例8描述的一樣。熱原質(zhì)的吸附率和pH值的關(guān)系如下，從而確定在整個(gè)pH值的寬范圍內(nèi)的吸附性能PH 2.9 5.4 6.8 8.1 9.2 10.7 11.7吸附率(%) 99.8 99.96 99.9 99.96 99.7 99.3 98.8(比較)當(dāng)用含氮環(huán)狀化合物的分離劑作為配位體，吸附率在較低pH值時(shí)下降。在離子強(qiáng)度為0.1時(shí)，當(dāng)pH為7或以下時(shí)，吸附率保持100%，pH為8時(shí)，吸附率下降到近似90%，pH為9時(shí)，吸附率為0。當(dāng)μ＝0.02時(shí)，在pH值8或以下時(shí)，吸附率保持100%，當(dāng)pH值為9時(shí)，吸附率下降到近似65%(使用的熱原質(zhì)來(lái)源于E.CoLi UKT-B)。
實(shí)例10(滲析)通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)熱原質(zhì)調(diào)整滲析液的熱原質(zhì)濃度到1440pg/ml，將得到的滲析液收集到消過(guò)毒的聚苯乙烯試管內(nèi)，加入0.1倍滲析液量的吸附劑。在園形混合器內(nèi)攪拌20分鐘后，過(guò)濾混合物，測(cè)定熱原質(zhì)濃度。
在用A-1型分離劑處理后，熱原質(zhì)濃度降至1.5pg/ml。在用B-1型分離劑處理后，降至185pg/ml。看來(lái)A-1型分離劑比B-1型分離劑在吸附率方面要好得多。
實(shí)例11(柱法)在例10進(jìn)行的試驗(yàn)中，顯示了優(yōu)良結(jié)果的兩種吸附劑被用來(lái)用柱法確定洗脫液中熱原質(zhì)的濃度。
柱內(nèi)徑10mm，填充高度80mm(8.3ml);
試驗(yàn)溶液加入E.CoLi O111B4調(diào)節(jié)透析液中熱原質(zhì)濃度至1ng/ml而制得。
流速(cm/hr) 76 153 306 535 764 994 1300A-1吸附劑 2 3 6 11 18 37 57非極性吸附劑 90 105 159 256 348 388 482(XAD-2)雖然XAD-2顯示了僅次于A-1吸附劑(4pg/ml)，但在高SV時(shí)，吸附性能XAD-2大大低于A-1吸附劑。
實(shí)例12(比較例)纖維素顆粒首先同表氯醇反應(yīng)，然后同聚烯丙胺(polyallylamine)氫氯化物(分子量60，000)反應(yīng)而得到多孔吸附劑AA-C。分別地，用同樣方法處理聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)(分子量40，000～50，000)得到多孔吸附劑PEI-C。進(jìn)而用市售的聚烯丙烷顆粒物作為PAA-B。采用與例8相同的間歇法對(duì)這三種型號(hào)的粒狀物進(jìn)行吸附試驗(yàn)。
這些試樣的每一個(gè)都將吸附生理鹽水中的熱原質(zhì)，但是在5%HSA溶液中，熱原質(zhì)吸附率低于50%。在試驗(yàn)溶液的離子強(qiáng)度，試驗(yàn)溶液的熱原質(zhì)濃度和處理液中熱原質(zhì)濃度三者之間關(guān)系如下μ 試驗(yàn)溶液 AA-C PEI-C PAA-B生理鹽水 0.15 192 0.015 0.012 0.115%HSA 0.02 2.5 4.12 2.34 2.405%HSA 0.09 4.06 2.02 2.50 3.14
實(shí)例13(柱法)用A-1型吸附劑，通過(guò)柱法去除HSA溶液中的熱原質(zhì)。
試驗(yàn)溶液5%HSA+2M NaCl+E.CoLi O111B4(DIFCO)，pH6.4，μ＝0.15處理方法在平衡吸附柱后，流速(SV)變化從30-2，測(cè)定處理液中的熱原質(zhì)濃度。
柱內(nèi)徑10mm，高60mm結(jié)果熱原質(zhì)濃度 去除率(Pg/ml) (%)試驗(yàn)溶液 730030 801 95.910 96 98.75 74 99.02 69 99.1實(shí)例14將0.2g(濕)吸附劑加入2ml的試驗(yàn)溶液中，該試驗(yàn)溶液是將E.CoLi O111B4(DIFCO)加入到0.9%NaCl溶液中制備而成的。攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾混合物，再經(jīng)Limulus ES-試驗(yàn)。
在試驗(yàn)溶液中的熱原質(zhì)濃度(Pg/ml) 17000 13000用A-1吸附劑處理后 5 未測(cè)定出實(shí)例15將0.2g(濕)A-1型吸附劑加入到源自多種微生物的含熱原質(zhì)的磷酸鹽緩沖溶液中(pH＝7，μ＝0.02)，在25℃，25rpm下攪拌處理1小時(shí)后，用過(guò)濾器過(guò)濾混合物后，測(cè)定熱原質(zhì)濃度。
測(cè)定方法Endospacy法(MP)進(jìn)而，用食鹽調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度至0.1得到試樣進(jìn)行試驗(yàn)。
E·u·/ml熱原質(zhì) 離子強(qiáng)度 所加的 被釋放的E.CoLi 0111B40.02 5510 0.060.1 4630 0.08E.CoLi UKT-B 0.02 3900 0.280.1 4070 0.62S.腸類 0.02 6280 0.12(enteritidis) 0.1 9440 0.59S.flexneri 0.02 9440 0.070.1 4880 0.07P.aeruginose 0.02 1230 0.040.1 380 0.05實(shí)例16用0.5g(濕)A-1型吸附劑接觸高濃度熱原質(zhì)液，殘液濃度確定其吸附能力，在重復(fù)再生和再使用后，表明吸附能力沒(méi)有變化。
(試驗(yàn)方法)1.測(cè)定吸附能力熱原質(zhì)液5ml E.CoLi O111B4(100μg/ml)水溶液。
＊溶解在磷酸鹽緩沖液中(pH＝7，μ＝0.02)
PS-CA0.5g(濕)。處理時(shí)間1小時(shí)。
2.再生方法(1)在完成吸附試驗(yàn)后，將PS-CA浸入15ml再生液中(含堿/酒精的水溶液)12小時(shí)。
(2)通過(guò)微過(guò)濾器過(guò)濾(0.22μm)。
(3)用無(wú)熱原質(zhì)的水洗滌(30ml×5)。
(4)用1.5M NaCl水溶液洗滌(30ml×5)。
(5)用無(wú)熱原質(zhì)水洗滌(30ml×5)。
(結(jié)果)熱原質(zhì)濃度(μg/ml) 吸附能力試驗(yàn)液 處理后的溶液 (μg/g濕)第1次操作后 100 21 790第2次操作后 100 8.8 910第3次操作后 100 5.9 940
權(quán)利要求
1.一種分離方法，包括用多孔吸附劑與二氧磷基多羥基化合物的溶液接觸，其中所說(shuō)的吸附劑含有鏈長(zhǎng)2～50脂肪族胺型官能團(tuán)并鍵合到基材上，上述吸附劑的孔徑從1nm～20μm。
2.按照權(quán)利要求1的分離方法，其特征在于使用具有脂肪族伯或仲胺型官能團(tuán)的吸附劑。
3.按照權(quán)利要求1的分離方法，其特征在于上述多孔吸附劑是具有孔徑從10nm到5μm的硬凝膠顆粒的形式。
4.按照權(quán)利要求1的分離方法，其特征在于多孔吸附劑是微濾膜或超濾膜形式。
5.按照權(quán)利要求1的分離方法，其特征在于上述二氧磷基多羥基化合物是熱原質(zhì)。上述溶液是離子強(qiáng)度(μ)從0.03～0.5的藥物水溶液。
6.按照權(quán)利要求1的分離方法，其特征在于上述基材是具有孔徑從50nm到1μm的多羥基聚合物。
7.一種分離方法，包括用高離子強(qiáng)度的水溶液處理吸附在吸附劑上的二氧磷基多羥基化合物和藥物，從而選擇性地洗脫上述藥物，上述吸附劑具有鏈長(zhǎng)2～50脂肪族胺型官能鏈，該官能鏈被鍵合到基材上，吸附劑孔徑從1nm到20μm。
8.一種以多孔吸附分離劑形式存在的吸附二氧磷基多羥基化合物的分離劑，該分離劑包括一種基材和一種與基材鍵合的官能鏈，孔徑從1nm到20μm，其中官能鏈為脂肪族伯或仲胺型官能鏈。
9.按照權(quán)利要求8的分離劑，其特征在于官能鏈含有1～12碳原子的二氨基亞烷基部分。
10.按照權(quán)利要求8的分離劑，其特征在于上述基材是多糖類或聚乙烯醇聚合物，羥基取代的丙烯中間物鏈?zhǔn)侵苯渔I合到基材的氧原子上的。
11.按照權(quán)利要求8的分離劑，其特征在于上述的官能鏈有一個(gè)鍵合到二氨基亞烷基部分上的氨基酸殘基。
全文摘要
一種分離方法，包括用多孔吸附劑與二氧磷基多羥基化合物溶液接觸，其特征在于上述吸附劑具有脂肪族含氮堿性官能團(tuán)，鏈長(zhǎng)2-50的官能鏈，并鍵合到基材上。上述吸附劑孔徑從1μm到20μm。還公開了上述分離方法上使用的分離劑。根據(jù)本發(fā)明，含在高離子強(qiáng)度的藥物溶液中的二氧磷基多羥基化合物，可提高去除率而易于分離，而藥物可有效地回收。
文檔編號(hào)A61M1/16GK1053046SQ90110310
公開日1991年7月17日 申請(qǐng)日期1990年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月7日
發(fā)明者永松信二, 田中芳和, 柴田徹 申請(qǐng)人:黛絲化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社, 田辺制藥株式會(huì)社