一種分離真鹽生植物內(nèi)生細菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離獲得真鹽生植物內(nèi)生細菌的方法，該方法是由配制培養(yǎng)基、植物預(yù)處理、表面消毒、二次剪切和破碎、內(nèi)生細菌的分離和培養(yǎng)過程步驟完成，將真鹽生植物表面消毒、二次剪切選取最佳部位后機械破碎真鹽生植物組織，渦旋高速震蕩分離內(nèi)生細菌，通過特殊培養(yǎng)基低溫培養(yǎng)內(nèi)生細菌。本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，不僅可利用費用低廉的機器快速破碎真鹽生植物組織，渦旋震蕩使真鹽生植物組織中的內(nèi)生細菌釋放更加充分，而且通過特殊培養(yǎng)條件提高得率，從而在種類和數(shù)量上均獲得更好的真鹽生植物內(nèi)生細菌分離效果，以期盡可能獲得真鹽生植物體內(nèi)所有的內(nèi)生細菌，克服已有技術(shù)中的局限性。
【專利說明】一種分離真鹽生植物內(nèi)生細菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從真鹽生植物中全面分離獲得內(nèi)生細菌的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]植物內(nèi)生細菌與宿主在長期共同進化中形成和諧聯(lián)合關(guān)系。生長在高鹽、冰凍等極端環(huán)境中的植物，其體內(nèi)存在具有特殊功能的內(nèi)生細菌類群。鹽生植物作為鹽潰環(huán)境中唯一能生存的植物，其內(nèi)生細菌的研究正成為生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域的熱點。
[0003]現(xiàn)有所公布的植物內(nèi)生菌分離方法200710065724、200810107514主要分為四步，第一步先將植物清洗后剪切成l_2cm小片段,第二步把植物小片段放入消毒液浸泡進行消毒，第三步通過人工研磨或組織搗碎機破裂植物小片段，結(jié)合離心的方法將內(nèi)生菌從植物組織勻漿中分離，第四步將含有內(nèi)生細菌的液體和稀釋液涂布于常規(guī)細菌培養(yǎng)基，在280C -30°C下培養(yǎng)。
[0004]然而，這些常規(guī)步驟存在三方面缺點:其一，植物組織尤其是根和莖含有多種細微管道，在消毒過程中消毒液會浸入植物片段的兩端導(dǎo)致內(nèi)生細菌死亡，這些部分作為分離源從開始就減少了內(nèi)生細菌的數(shù)量和種類；其二，人工研磨和費用高昂的組織搗碎機均無法快速將木質(zhì)化程度高的植物組織充分破碎，并且離心只是通過離心力將植物組織碎片沉淀，不能將附著在碎片內(nèi)的細菌剝離，從而造成很多內(nèi)生細菌仍然存在植物組織中；其三，內(nèi)生細菌與宿主長期共同進化,適應(yīng)宿主植物體內(nèi)的物質(zhì)環(huán)境,極端環(huán)境中的植物具有特殊的植物內(nèi)環(huán)境，其內(nèi)生細菌也與普通植物內(nèi)生細菌不同，常規(guī)培養(yǎng)基并不適合全面分離特殊植物內(nèi)生細菌從而降低分離得到的數(shù)量和種類，加上溫度28-30°C培養(yǎng)會造成優(yōu)勢菌群快速生長繁殖形成大菌落，無法觀測到劣勢菌群和低溫生長菌群，加劇最終內(nèi)生細菌數(shù)量和種類豐度偏差。
[0005]鹽生植物有別于普通植物，多分布于沿海和干旱區(qū)鹽堿地。真鹽生植物(euhalophyte)作為鹽生植物中最抗鹽的一類，其結(jié)構(gòu)更為特殊。真鹽生植物莖部和根部高度木質(zhì)化，葉部多形成同化枝，含有大量導(dǎo)管和篩管，并且真鹽生植物通過離子區(qū)隔化將鹽分局限于液泡和老葉中，體內(nèi)含有高于普通植物的鹽分以及多種已知和未知的抗逆境性物質(zhì)。正是因為真鹽生植物結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境的特殊性，采用常規(guī)分離方法因植物小片段消毒損失部分內(nèi)生細菌,并且真鹽生植物同化枝,莖和根的木質(zhì)部破碎不完全,加之離心造成部分細菌未被從組織分離出來，以及培養(yǎng)條件尤其是常規(guī)培養(yǎng)基物質(zhì)成分不合適，導(dǎo)致真鹽生植物內(nèi)生細菌的數(shù)量和種類顯著減少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于，提供一種分離獲得真鹽生植物內(nèi)生細菌的方法，該方法是由配制培養(yǎng)基、植物預(yù)處理、表面消毒、二次剪切和破碎、內(nèi)生細菌的分離和培養(yǎng)過程步驟完成，將真鹽生植物表面消毒、二次剪切選取最佳部位后機械破碎真鹽生植物組織，渦旋高速震蕩分離內(nèi)生細菌，通過特殊培養(yǎng)基低溫培養(yǎng)內(nèi)生細菌。本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，不僅可利用費用低廉的機器快速破碎真鹽生植物組織，渦旋震蕩使真鹽生植物組織中的內(nèi)生細菌釋放更加充分，而且通過特殊培養(yǎng)條件提高得率，從而在種類和數(shù)量上均獲得更好的真鹽生植物內(nèi)生細菌分離效果，以期盡可能獲得真鹽生植物體內(nèi)所有的內(nèi)生細菌，克服已有技術(shù)中的局限性。
[0007]本發(fā)明所述的一種分離真鹽生植物內(nèi)生細菌的方法，按下列步驟進行:
[0008]a、配制培養(yǎng)基:取5-15克真鹽生植物鹽角草、梭梭、囊果堿蓬、鹽爪爪、里海鹽爪爪、鹽穗木或鹽節(jié)木組織為同化枝、莖和根，剪碎后在IOOmL水中煮沸10-30min，溫度95-1000C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用10_20mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=1: 10混合，溫度121°C滅菌15-20min后，制成平板；
[0009]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物鹽角草、梭梭、囊果堿蓬、鹽爪爪、里海鹽爪爪、鹽穗木或鹽節(jié)木組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0010]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0011]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度0-4°C預(yù)冷處理30min-60min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為2-5片，功率為300W-350W的攪拌機充分打碎；
[0012]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0 .85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為2000rpm-3000rpm、室溫條件下震蕩10s_60s，取上清液；
[0013]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水進行10-100倍的稀釋，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)14-20天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌。
[0014]步驟a中真鹽生植物組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=1:1: 2。
[0015]步驟d 二次剪切和破碎中使用攪拌刀頭刀片數(shù)為5片，攪拌機功率為350W。
[0016]步驟e中在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩60s，取上清液。
[0017]本發(fā)明所述的一種分離獲得真鹽生植物內(nèi)生菌的方法，該方法中的真鹽生植物為對鹽角草(Salicornia europaea),梭梭(Haloxylon ammodendron),囊果喊蓬(Suaedaphysophora),鹽爪爪(Kalidium foliatum),里海鹽爪爪(Kalidium caspicum),鹽穗木(Halostachys caspica)，鹽節(jié)木(Halocnemum strobiIaceum)。
[0018]本發(fā)明所述的一種分離獲得真鹽生植物內(nèi)生菌的方法，與一般方法相比，該方法特點為:
[0019]1、通過二次剪切將真鹽生植物片段邊緣過度消毒部分去除，保留更多的內(nèi)生細菌源；
[0020]2、通過廉價易得的榨汁機充分打碎真鹽生植物組織，同時預(yù)冷處理可避免局部過熱對細胞的破壞；
[0021]3、高速渦旋震蕩可將內(nèi)生細菌從真鹽生植物組織上充分分離；
[0022]4、將一定比例的宿主真鹽生植物煮出液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基混合制成新的培養(yǎng)基，提供全面的物質(zhì)成分滿足真鹽生植物體內(nèi)各種內(nèi)生菌生長需求；
[0023]5、通過低溫培養(yǎng)以避免劣勢菌群和低溫生長菌群無法或者過慢生長而被忽略，從而獲得更好的真鹽生植物內(nèi)生細菌分離效果。
[0024]全面分離內(nèi)生細菌是研究真鹽生植物內(nèi)生菌的根本，分離效果優(yōu)劣是判斷分離方法是否科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。利用本發(fā)明方法分離真鹽生植物內(nèi)生細菌無論在數(shù)量和種類上均顯著優(yōu)于一般分離方法，因此，本發(fā)明是研究真鹽生植物內(nèi)生細菌的優(yōu)良方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為常規(guī)方法分離梭梭內(nèi)生細菌對照圖；
[0026]圖2為本發(fā)明實施例2分離梭梭內(nèi)生細菌圖；
[0027]圖3為常規(guī)方法分離里海鹽爪爪內(nèi)生細菌對照圖；
[0028]圖4為本發(fā)明 實施例5分離里海鹽爪爪內(nèi)生細菌圖；
[0029]圖5為常規(guī)方法分離囊果堿蓬內(nèi)生細菌對照圖；
[0030]圖6為本發(fā)明實施例3分離囊果堿蓬內(nèi)生細菌圖；
[0031]圖7為常規(guī)方法分離鹽穗木內(nèi)生細菌對照圖；
[0032]圖8為本發(fā)明實施例6分離鹽穗木內(nèi)生細菌圖；
[0033]圖9為常規(guī)方法分離鹽角草內(nèi)生細菌對照圖；
[0034]圖10為本發(fā)明實施例1分離鹽角草內(nèi)生細菌圖。
【具體實施方式】
[0035]以下實施方式和實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限定:
[0036]實施例1
[0037]a、配制培養(yǎng)基:取5克真鹽生植物鹽角草組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=1:1: 2，剪碎后在IOOmL水中煮沸l(wèi)Omin，溫度95°C，再將煮沸液通過3層紗布過濾，收集濾液，用IOmL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=I: 10混合，溫度121°C滅菌15min后，制成平板；
[0038]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物鹽角草組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0039]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0040]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物鹽角草片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度0°C預(yù)冷處理30min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為2片，功率為300W的攪拌機充分打碎；
[0041]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物鹽角草組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為2000rpm、室溫條件下震蕩10s，取上清液；
[0042]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋100倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)14天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化，即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0043]實施例2
[0044]a、配制培養(yǎng)基:取10克真鹽生植物梭梭組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=1:1: 2剪碎后在IOOmL水中煮沸15min，溫度100°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用15mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=I: 10混合，溫度121°C滅菌15_20min后，制成平板；；
[0045]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物梭梭組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0046]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0047]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物梭梭片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度1°C預(yù)冷處理40min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為3片，功率為350W的攪拌機充分打碎；
[0048]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物梭梭組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩20s，取上清液；
[0049]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋10倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)15天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0050]實施例3
[0051]a、配制培養(yǎng)基:取15克真鹽生植物囊果堿蓬組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=1:1: 2，剪碎后在IOOmL水中煮沸30min，溫度100°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用20mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=1: 10混合，溫度121°C滅菌20min后，制成平板；；
[0052]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物囊果堿蓬組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0053]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0054] d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物囊果堿蓬片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段，放入溫度3°C預(yù)冷處理50min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為4片，功率為300W的攪拌機充分打碎；[0055]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物囊果堿蓬組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為2500rpm、室溫條件下震蕩30s，取上清液；
[0056]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋80倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)18天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0057]實施例4
[0058]a、配制培養(yǎng)基:取5-15克真鹽生植物鹽爪爪組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=I: I: 2，剪碎后在IOOmL水中煮沸25min，溫度95°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用15mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=I: 10混合，溫度121°C滅菌20min后，制成平板；
[0059]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物鹽爪爪組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0060]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0061]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物鹽爪爪片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物鹽爪爪片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度4°C預(yù)冷處理60min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為5片，功率為350W的攪拌機充分打碎；
[0062]e、內(nèi)生 細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩60s，取上清液；
[0063]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋40倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)20天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0064]實施例5
[0065]a、配制培養(yǎng)基:取15克真鹽生植物里海鹽爪爪組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=I: I: 2，剪碎后在IOOmL水中煮沸25min，溫度98°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用15mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1_2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=I: 10混合，溫度121°C滅菌18min后，制成平板；；
[0066]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物里海鹽爪爪組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0067]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0068]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物里海鹽爪爪片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物里海鹽爪爪片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度3.5°C預(yù)冷處理35min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為4片，功率為350W的攪拌機充分打碎；
[0069]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩60s，取上清液；
[0070]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋50倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)20天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0071]實施例6
[0072]a、配制培養(yǎng)基:取5-15克真鹽生植物鹽穗木組織同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=I: I: 2，剪碎后在IOOmL水中煮沸30min，溫度100°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用20mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=1: 10混合，溫度121°C滅菌20min后，制成平板；；
[0073]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物鹽穗木組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0074]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0075]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物鹽穗木片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物鹽穗木片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度4°C預(yù)冷處理60min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為5片，功率為350W的攪拌機充分打碎；
[0076]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩60s，取上清液；
[0077]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋60倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)20天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0078]實施例7
[0079]a、配制培養(yǎng)基:取5-15克真鹽生植物鹽節(jié)木組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=I: I: 2，剪碎后在IOOmL水中煮沸30min，溫度95°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用18mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾，收集沖洗液，將沖洗液加入濾液中使總體積為IOOmL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=1: 10混合，溫度121°C滅菌20min后，制成平板；；
[0080]b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物鹽節(jié)木組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段；
[0081]C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果；
[0082]d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度4°C預(yù)冷處理60min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為5片，功率為350W的攪拌機充分打碎；
[0083]e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩60s，取上清液；
[0084]f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200 μ L上清液用無菌生理鹽水稀釋100倍，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°C恒溫培養(yǎng)14-20天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌，純化獲得純培養(yǎng)后于溫度4°C保存。
[0085]實施例8
[0086]采用常規(guī)方法對本發(fā)明中涉及的鹽角草，梭梭，囊果堿蓬，鹽爪爪，里海鹽爪爪，鹽穗木，鹽節(jié)木7種真鹽生植物分離內(nèi)生細菌作為對照:
[0087]其中所述的常規(guī)方法為:清洗后的植物組織剪切成1.5-2cm小段，體積濃度70%乙醇浸泡3-5min，2%次氯酸鈉浸泡l_2min進行表面消毒，消毒后的植物小段研磨后收集原液，原液梯度稀釋后涂布常規(guī)R2A培養(yǎng)平板，溫度30°C培養(yǎng)；
[0088]將實施例1-7獲得的細菌和常規(guī)方法對照獲得的細菌分別通過三區(qū)劃線純化，純菌落通過Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(Sangon)提取DNA，然后采用細菌通用引物 27f(5，-AGA GTTTAG TCC TGG CTC AG - 3，)，1492r (5，- TAC GGC TAC CTT GTT ACGACT T-3’)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送至上海生工公司測序，測得的16S rRNA基因序列在NCBI (http://www.Ncb1.nih.gov/index, html)通過 BLAST 比對后提交 GenBank 獲得序列號，結(jié)果統(tǒng)計如表1-7所示:
[0089] 表1.鹽角草內(nèi)生細菌分離情況
[0090]
【權(quán)利要求】
1.一種分離真鹽生植物內(nèi)生細菌的方法，其特征在于按下列步驟進行: a、配制培養(yǎng)基:取5-15克真鹽生植物鹽角草、梭梭、囊果堿蓬、鹽爪爪、里海鹽爪爪、鹽穗木或鹽節(jié)木組織為同化枝、莖和根，剪碎后在IOOmL水中煮沸10-30min，溫度95_100°C，再將煮沸液通過3-4層紗布過濾，收集濾液，用10-20 mL蒸餾水沖洗植物殘渣通過1-2層紗布過濾,收集沖洗液,將沖洗液加入收集的濾液中使總體積為100 mL,得到混合液，再將混合液與常規(guī)的R2A固體培養(yǎng)基按體積比為混合液:R2A固體培養(yǎng)基=I: 10混合，溫度121°C滅菌15-20min后，制成平板； b、植物預(yù)處理:將真鹽生植物鹽角草、梭梭、囊果堿蓬、鹽爪爪、里海鹽爪爪、鹽穗木或鹽節(jié)木組織經(jīng)超聲清洗后，切成4-6cm片段； C、表面消毒:將步驟b的片段進行表面消毒，先用有效氯濃度為3.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒3-3.5min,再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒3_3.5min,浸泡后用無菌水沖洗5次去除殘余表面消毒液，選取第5次洗滌后的水涂布檢測消毒結(jié)果； d、二次剪切和破碎:經(jīng)步驟c表面消毒后的真鹽生植物片段用無菌濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將真鹽生植物片段兩側(cè)0.5-lcm邊緣切除，然后將剩余部分剪切成0.5-lcm小段,放入溫度0-4°C預(yù)冷處理30min-60min的無菌干磨杯中，使用攪拌刀頭刀片數(shù)為2-5片，功率為300W-350W的攪拌機充分打碎； e、內(nèi)生細菌的分離:在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為2000rpm-3000rpm、室溫條件下震蕩10s-60s，取上清液； f、培養(yǎng)過程:在無菌條件下，將步驟e得到的200μ L上清液用無菌生理鹽水進行10-100倍的稀釋，再將稀釋液涂布于步驟a制備的平板上，將平板于溫度15°c恒溫培養(yǎng)14-20天后，挑取不同形態(tài)的菌落，純化即得真鹽生植物內(nèi)生細菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中真鹽生植物組織為同化枝、莖和根，其質(zhì)量比為枝:莖:根=1:1: 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d二次剪切和破碎中使用攪拌刀頭刀片數(shù)為5片，攪拌機功率為350W。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟e中在無菌條件下，取Ig真鹽生植物組織碎片轉(zhuǎn)入裝有9mL無菌質(zhì)量百分含量為0.85%生理鹽水的離心管中，置于渦旋震蕩器上，在轉(zhuǎn)速為3000rpm、室溫條件下震蕩60s，取上清液。
【文檔編號】C12N1/20GK103937719SQ201410163550
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】趙帥, 田長彥, 趙振勇 申請人:中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所