Map7在cn-aml組織樣品中表達(dá)水平的檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【專利摘要】MAP7在CN?AML組織樣品中表達(dá)水平的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)，其中之一引物對(duì)的序列是tcctgggagctgcaattaca(SEQ ID NO：2)和gggtgcttttggtcttctgg(SEQ ID NO：3)或者它們的互補(bǔ)序列。本發(fā)明引物對(duì)用于通過(guò)檢測(cè)微管結(jié)合蛋白7的表達(dá)高低而對(duì)正常核型急性髓系白血病患者危險(xiǎn)度分層或預(yù)后評(píng)估。本發(fā)明還提供了包含所述引物對(duì)的基因芯片和試劑盒。
【專利說(shuō)明】
MAP7在CN-AML組織樣品中表達(dá)水平的檢測(cè)方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及正常核型急性髓系白血病基因的檢測(cè)、危險(xiǎn)度分 層和臨床預(yù)后評(píng)估，特別是涉及正常核型急性髓系白血病基因的檢測(cè)引物、基因芯片和試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種異質(zhì)性極強(qiáng)的惡性血液 病，占成人急性白血病的80%左右（參見(jiàn)MROZEK K，HEEREMA N A，BL00MFIELD C D.， Cytogenetics in acute leukemia[J].Blood reviews,2004，18(2):115_36)，它包括許多 具有不同遺傳異常狀況和臨床特征的實(shí)體，預(yù)后具有高度的異質(zhì)性。染色體異位是其中最 常見(jiàn)的診斷和預(yù)后標(biāo)記物，但是在CN-AML中大約一半的患者沒(méi)有染色體異常，稱之為正常 核型急性髓系白血?。╟ytogenetically normal acute myeloid leukemia，CN_AML)。在 NCCN(National Comprehensive Cancer Network)危險(xiǎn)度分層指南中，CN-AML基本上全部 在中危組。但是CN-AML患者是一組內(nèi)部預(yù)后異質(zhì)性極強(qiáng)的整體，并且缺乏具有判斷預(yù)后的 特征性染色體，因此，目前臨床上CN-AML的分層診斷及個(gè)體化治療非常困難，亟待找到有效 的預(yù)后標(biāo)志物來(lái)確認(rèn)此類患者治療的強(qiáng)度，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的個(gè)體化治療，避免一部分預(yù)后良 好的患者治療強(qiáng)度過(guò)大，帶來(lái)眾多不必要的并發(fā)癥，同樣也避免另一部分預(yù)后不良的患者 治療強(qiáng)度不足，最終導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，CN-AML不具有染色體層面判斷其臨床預(yù)后的遺傳標(biāo)志物，但是有一 部分CN-AML內(nèi)部存在致病的基因突變，這些基因突變具有對(duì)CN-AML患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層和 臨床判斷預(yù)后的價(jià)值，例如攜帶FLT3-ITD(參見(jiàn)WHITMAN S P，MAHARRY K，RADMACHER M D, et al.FLT3 internal tandem duplication associates with adverse outcome and gene-and microRNA-expression signatures in patients 60 years of age or older with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study[J] .Blood,2010,116(18) :3622-6)的CN-AML患者具有不良預(yù)后， 而攜帶NPM1 突變（參見(jiàn)D0HNER K，SCHLENK R F，HABDANK M，et al.Mutant nucleophosmin (NMP1)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics:interaction with other gene mutation[J] .Blood, 2005,106(12) :3740-6)、CEBPA 雙突變（參見(jiàn) PAST0RE F，KLING D，H0STER E，et al.Long-term follow-up of cytogenetically normal CEBPA-mutated AML[J].Journal of hematology&oncology，2014，7)的患者具有相對(duì)良好預(yù)后。CN104508143A公開(kāi)了用于診 斷、預(yù)測(cè)、治療和處理急性髓系白血病的方法，該方法涉及預(yù)測(cè)患有急性髓系白血病患者 的生存率，包括：分析從所述患者分離的遺傳樣品是否存在細(xì)胞遺傳學(xué)異常，以及在基因 FLT3、NPMI、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WTI、IDHI、IDH2、ΚΙT、RUNXI、MLL-PTD、ASXLI、PHF6、 KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種敏感性高，通用性好，特異性強(qiáng)的標(biāo)志物，來(lái)檢測(cè)CN-AML 細(xì)胞或組織樣品，來(lái)幫助判斷CN-AML患者的危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后，是基于以下的考慮： (1)基因突變不能覆蓋所有的CN-AML，而基因表達(dá)可以覆蓋所有的CN-AML患者；（2) CN-AML 發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)理目前仍不清楚，尋求新的臨床預(yù)后標(biāo)志物有助于理解CN-AML的發(fā)病 機(jī)理，并且能為CN-AML的精準(zhǔn)靶向治療奠定基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)MAP7(microtubule associated proteins7,微管結(jié)合蛋白7)高表 達(dá)可提示正常核型急性髓系白血病細(xì)胞的存在，并且可提示正常核型急性髓系白血病患者 較高的危險(xiǎn)度分層和較差臨床預(yù)后。因此，本發(fā)明提供MAP7作為CN-AML標(biāo)志物，其敏感性 高，通用性好，特異性強(qiáng)，能用來(lái)幫助判斷CN-AML患者的危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后。
[0006] 一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高 低的方法，特征在于，使用微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針。所述檢測(cè)包括體外檢測(cè)， 包括非診斷目的檢測(cè)?；谂c正常對(duì)照細(xì)胞相比差異表達(dá)的MAP7的正常核型急性髓系白血 病癌癥特異性特征(signature)的鑒定及其應(yīng)用，設(shè)計(jì)MAP7基因引物對(duì)或探針，來(lái)檢測(cè)正常 核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7的表達(dá)高低，通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低來(lái)對(duì)CN-AML 患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層并分析臨床預(yù)后。MAP7高表達(dá)的CN-AML樣品具有較高的危險(xiǎn)度分層和 較差的臨床預(yù)后。MAP7低表達(dá)的CN-AML樣品具有較低的危險(xiǎn)度分層和較好的臨床預(yù)后。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管 結(jié)合蛋白7表達(dá)高低的試劑盒，特征在于，其中包含微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管 結(jié)合蛋白7表達(dá)高低的基因芯片，特征在于，其中包括固相載體和微管結(jié)合蛋白7基因的引 物對(duì)或者探針。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針在制備通過(guò)檢測(cè) 微管結(jié)合蛋白7的表達(dá)高低而對(duì)正常核型急性髓系白血病進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或預(yù)后評(píng)估的基 因芯片或試劑盒中的用途。
[0010] 更進(jìn)一步地，由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)正常核型急性髓系白血病與MAP7差異表達(dá)相關(guān)， 因此本發(fā)明提供了 MAP7基因在設(shè)計(jì)或制備用于正常核型急性髓系白血病檢測(cè)、危險(xiǎn)度分 層或預(yù)后評(píng)估的試劑或試劑盒中的用途。
[0011] 本發(fā)明還提供了 MAP7在篩選或制備用于治療正常核型急性髓系白血病的藥物中 的用途。
[0012] 在CN-AML細(xì)胞或正常細(xì)胞中MAP7差異表達(dá)的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果 的差異表達(dá)允許以許多方法使用該信息。例如，可評(píng)估特定的治療方案(例如，確定化療藥 物是否改善特定患者的長(zhǎng)期預(yù)后）。此外，MAP7基因表達(dá)譜(或個(gè)體基因）允許篩選抑制CN-AML表達(dá)譜或?qū)⒉涣碱A(yù)后譜轉(zhuǎn)變成更好的預(yù)后譜的藥物候選物。
[0013] 本發(fā)明也提供了測(cè)定CN-AML受試者的預(yù)后的方法，其包括，測(cè)量來(lái)自受試者的受 試樣品中MAP7基因產(chǎn)物的水平(其與CN-AML的特定預(yù)后例如好的或積極的預(yù)后、差的或不 利的預(yù)后相關(guān)）。根據(jù)這些方法，與對(duì)照樣品中相應(yīng)的MAP7基因產(chǎn)物的水平相比，受試樣品 中與特定預(yù)后相關(guān)的MAP7基因產(chǎn)物水平的改變，指示受試者患有具有特定預(yù)后的CN-AML。 MAP7基因產(chǎn)物表達(dá)高與不利（即，差)預(yù)后相關(guān)。不利預(yù)后的實(shí)例包括、但不限于，低存活率 和疾病快速進(jìn)展。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或 組織中MAP7表達(dá)高低的方法，特征在于，使用微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)，所述引物對(duì)的 序列是下面的序列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0015] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0016] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0017] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞 或組織中MAP7表達(dá)高低的方法，特征在于，使用微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)，所述引物對(duì) 的序列是下面的序列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0018] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0019] RIGHT PRBffiR agctagctgtttctcccgtt SEQ ID N0:6。
[0020] 在本發(fā)明的又一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞 或組織中MAP7表達(dá)高低的方法，特征在于，使用微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)，所述引物對(duì) 的序列是下面的序列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0021] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0022] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO：9
[0023] 在本發(fā)明提供的一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低 的試劑盒的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述試劑盒包含微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)，所述引物 對(duì)的序列是下面任一組的序列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0024] 第一組引物對(duì)：
[0025] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0026] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0027] 第二組引物對(duì)：
[0028] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0029] RIGHT PRBffiR agctagctgtttctcccgtt SEQ ID N0:6。
[0030] 第三組引物對(duì)：
[0031] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0032] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。
[0033] 在本發(fā)明提供的一種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低 的基因芯片的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基因芯片包括固相載體和微管結(jié)合蛋白7基因的 引物對(duì)，所述引物對(duì)的序列是下面任一組的序列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0034] 第一組引物對(duì)：
[0035] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0036] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0037] 第二組引物對(duì)：
[0038] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0039] RIGHT PRBffiR agctagctgtttctcccgtt SEQ ID N0:6。
[0040] 第三組引物對(duì)：
[0041] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0042] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。
[0043] 因此，優(yōu)選地，本發(fā)明也提供了一組引物對(duì)，特征在于，其序列是下面任一組的序 列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0044] 第一組引物對(duì)：
[0045] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0046] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3
[0047] 第二組引物對(duì)：
[0048] LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5
[0049] RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6
[0050] 或者
[0051 ] 第三組引物對(duì)：
[0052] LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8
[0053] RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。
[0054] 在本發(fā)明更優(yōu)選的技術(shù)方案中，提供了一組引物對(duì)，所述引物對(duì)是SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO :3的序列或者它們的互補(bǔ)序列：
[0055] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0056] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0057]
[0058] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種基因芯片，特征在于，其包括固相載體和上述引物對(duì) SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列。本發(fā)明也提供了一種試劑盒，其 包含上述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列。本發(fā)明上述引物 對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列、其基因芯片或試劑盒用于檢測(cè) 細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，上述引物對(duì)、基因芯 片、試劑盒用于檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低。在本發(fā)明的一 個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，上述引物對(duì)、基因芯片、試劑盒用于非診斷目的檢測(cè)正常核型急 性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低。
[0059]優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中MAP7表達(dá)高低的方法，特征在 于，使用本發(fā)明的上述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列、其 基因芯片或試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)正常 核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中MAP7表達(dá)高低的方法，特征在于，使用本發(fā)明的上 述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列、其基因芯片或試劑盒。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非診斷目的的檢測(cè)正常核型急性 髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中MAP7表達(dá)高低的方法，特征在于，使用本發(fā)明的上述引物對(duì) SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列、其基因芯片或試劑盒。所述檢測(cè) MAP7表達(dá)高低是對(duì)離體細(xì)胞或組織樣品的檢測(cè)。
[0060] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ) 序列在制備通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低而對(duì)正常核型急性髓系白血病患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層 或臨床預(yù)后評(píng)估的基因芯片中的用途；以及引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者 它們的互補(bǔ)序列在制備通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低而對(duì)正常核型急性髓系白血病患者進(jìn)行 危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后評(píng)估的試劑盒中的用途。
[0061] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中MAP7的表達(dá)高低的一組引物 對(duì)，其序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補(bǔ)序列：
[0062] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0063] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO:3。
[0064] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述MAP7的序列是SEQ ID NO: UPCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是 216,產(chǎn)物序列是SEQ ID N0:4。優(yōu)選地，所述細(xì)胞或組織樣品是CN-AML細(xì)胞或組織樣品，所 述檢測(cè)是非診斷目的的檢測(cè)。所述檢測(cè)是對(duì)離體細(xì)胞或組織進(jìn)行的。
[0065] 更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低的基因芯片，特征在于， 其包括固相載體和上述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補(bǔ)序列。本發(fā)明也 提供了一種用于檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低的試劑盒，其包含上述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，上述引物對(duì)SEQ ID N0:2 和SEQ ID N0:3或者它們的互補(bǔ)序列、基因芯片、試劑盒用于檢測(cè)正常核型急性髓系白血病 細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，上述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補(bǔ)序列、基因芯片、試劑盒用于非診斷目的檢測(cè)正常核型 急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低。
[0066] 更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中MAP7表達(dá)高 低的方法，特征在于，使用本發(fā)明的上述引物對(duì)SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它 們的互補(bǔ)序列、其基因芯片或試劑盒。更優(yōu)選地，其中所述細(xì)胞或組織樣品是正常核型急性 髓系白血病細(xì)胞或組織樣品。所述檢測(cè)MAP7表達(dá)高低是非診斷目的的，是對(duì)離體組織樣品 的檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了用于通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低而對(duì)正常 核型急性髓系白血病患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后評(píng)估的一組引物對(duì)，其序列是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3或者它們的互補(bǔ)序列：
[0067] LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2
[0068] RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3
[0069] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是216,擴(kuò)增產(chǎn)物序列是SEQ ID N0:4。
[0070] 在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了用于通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低而對(duì)正常核 型急性髓系白血病患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后評(píng)估的基因芯片，其包括固相載體和引 物，所述引物是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供了 序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補(bǔ)序列的引物在制備通過(guò)檢測(cè)MAP7的表 達(dá)高低而對(duì)正常核型急性髓系白血病患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后評(píng)估的基因芯片中 的用途。
[0071] 在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了用于通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低而對(duì)正常核 型急性髓系白血病患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或臨床預(yù)后評(píng)估的試劑盒，其包含序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的引物或者它們的互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供了序列是SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO: 3或者它們的互補(bǔ)序列的引物在制備通過(guò)檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低而對(duì)正常核型 急性髓系白血病患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或預(yù)后的試劑盒中的用途。
[0072] 在上面的具體實(shí)施方案中，使用的引物對(duì)可以用SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6代 替，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是194,擴(kuò)增產(chǎn)物序列是SEQ ID N0:7。使用的引物對(duì)還可以是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是224,擴(kuò)增產(chǎn)物序列是SEQ ID NO:10 JEQ ID NO:1 是所述MAP7的序列，4536bp。
[0073]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了 MAP7在篩選或制備用于治療急性髓系白血病的藥物中的 用途。
[0074]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了 MAP7基因在設(shè)計(jì)或制備用于正常核型急性髓系白血病 檢測(cè)、危險(xiǎn)度分層或預(yù)后評(píng)估的試劑或試劑盒中的用途。
[0075]本發(fā)明MAP7的引物對(duì)序列或者它們的互補(bǔ)序列、包含載體和MAP7引物對(duì)的基因芯 片、包含MAP7引物對(duì)的試劑盒、檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低 的方法，可以用于臨床或非臨床檢測(cè)MAP7表達(dá)水平，可以用于診斷或非診斷目的?？梢岳?本發(fā)明提供的檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織中MAP7表達(dá)高低的方法、MAP7基因 引物對(duì)、基因芯片、試劑盒，通過(guò)對(duì)CN-AML患者的細(xì)胞或組織樣品檢測(cè)MAP7的表達(dá)高低來(lái)對(duì) CN-AML患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層并分析臨床預(yù)后。MAP7高表達(dá)的CN-AML患者具有較高的危險(xiǎn)度 分層和較差的臨床預(yù)后。MAP7低表達(dá)的CN-AML患者具有較低的危險(xiǎn)度分層和較好的臨床預(yù) 后。本發(fā)明所述MAP7基因引物、基因芯片、試劑盒還可以用于非臨床或非診斷目的，包括但 不限于實(shí)驗(yàn)室研究，細(xì)胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)中MAP7的檢測(cè)，血液制品檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)控制等等。 [0076]本發(fā)明MAP7基因的引物對(duì)或者探針可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行設(shè) 計(jì)，通過(guò)本領(lǐng)域公知的生物或化學(xué)合成技術(shù)來(lái)制備本發(fā)明的引物對(duì)或探針?？墒褂枚喾N本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)測(cè)量基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。例如使用RNA印跡分析，Northern Blot，Southern Blot，Western Blot，或者熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)受試樣品中基因產(chǎn)物的 水平低于對(duì)照樣品中相應(yīng)的基因產(chǎn)物的水平，或者受試樣品中基因產(chǎn)物的水平高于對(duì)照樣 品中相應(yīng)的基因產(chǎn)物的水平。
[0077]附圖簡(jiǎn)要描述
[0078]圖1所示是MAP7在CN-AML患者和正常人樣本中的表達(dá)及與其它預(yù)后標(biāo)志物之間的 比較圖。
[0079] 圖1A所示是CN-AML患者骨髓標(biāo)本VS正常人骨髓標(biāo)本MAP7表達(dá)增高顯示圖。
[0080] 圖1B所示是CN-AML患者外周血標(biāo)本VS正常人外周血標(biāo)本MAP7表達(dá)增高顯示圖。
[0081 ] 圖1C所示是MAP7在FLT-ITD、NPM1突變、CEBPA突變患者中表達(dá)高低的比較結(jié)果圖。 MAP7的表達(dá)與FLT3-ITD成正相關(guān)，與雙突變CEBPA成負(fù)相關(guān)。
[0082]圖1D所示是其它預(yù)后標(biāo)志物中MAP7表達(dá)高低情況的結(jié)果圖。其它預(yù)后不良標(biāo)志物 更容易在MAP7高表達(dá)中出現(xiàn)，預(yù)后良好標(biāo)志物更容易在MAP7低表達(dá)中出現(xiàn)。
[0083]圖2所示是MAP7在CN-AML患者樣品中的檢測(cè)及預(yù)后生存分析顯示圖。
[0084]圖2A所示是對(duì)全部CN-AML骨髓樣品進(jìn)行MAP7表達(dá)水平檢測(cè)與總生存率(0S)分析 結(jié)果顯示圖。MAP7是CN-AML及CN-AML患者的不良預(yù)后標(biāo)志物。MAP7high具有較短的0S(p = 0.0441)。圖2B所示是對(duì)全部CN-AML骨髓樣品進(jìn)行MAP7表達(dá)水平檢測(cè)與無(wú)事件生存率(EFS) 分析結(jié)果顯示圖。MAP7是CN-AML及CN-AML患者的不良預(yù)后標(biāo)志物。MAP7high具有較短的EFS (p = 0.0114) 〇
[0085]圖2C所示是對(duì)CN-AML歐洲白血病協(xié)作組危險(xiǎn)度分層中（ELN)低?；颊哌M(jìn)行0S預(yù)后 分析的結(jié)果顯示圖（P = 〇. 8856)。
[0086]圖2D所示是對(duì)ELN分類中低危CN-AML患者進(jìn)行EFS預(yù)后分析的結(jié)果顯示圖（p = 0.9389)。
[0087] 圖2E所示是對(duì)ELN分類中中危-1患者進(jìn)行預(yù)后分析的結(jié)果顯示圖，MAP7hlgh具有較 短的 0S(p = 0.0344)。
[0088] 圖2F所示是對(duì)ELN分類中中危-1患者進(jìn)行預(yù)后分析的結(jié)果顯示圖，MAP7hlgh具有較 短的 EFS(p = 0.0052)。
【具體實(shí)施方式】
[0089] MAP7引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) MAP7表達(dá)高低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的熒光染料有Taqman探針、SYBR Green I等。SYBR Green I是一種熒光染料，可以和任意的雙鏈DNA結(jié)合，通過(guò)熒光信號(hào)的收集，反映模板拷貝 數(shù)的多少。本發(fā)明主要采用SYBR Green I進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
[0090] 實(shí)施例1總RNA的提取
[0091] 實(shí)驗(yàn)操作中，與RNA提取及檢測(cè)有關(guān)的微量移液器、Tip槍尖、EP管等均需經(jīng)過(guò)無(wú) RNase處理。
[0092] 1、裂解細(xì)胞：向收集的細(xì)胞沉淀中加入lml的QIAZ0L試劑，振蕩器震蕩混勻，室溫 作用15分鐘以上使其充分裂解。若加入QIAZ0L試劑后不能立刻提取RNA，可將其放入-20°C 保存，短期內(nèi)可用。
[0093] 2、按照氯仿:QIAZ0L體積比為1:4的比例，加入約300μ1氯仿，上下顛倒混勻1分鐘， 室溫靜置5-10分鐘，低溫離心:4°C，12600rpm離心10分鐘。
[0094] 3、離心完畢后，EP管內(nèi)液體分三層，上層為含有RNA的上清液，中下層為DNA和蛋白 質(zhì)。然后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，并加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，低溫靜置10 分鐘，離心:4°C，12600rpm離心15分鐘。
[0095] 4、棄上清，白色沉淀即為RNA，加入lml的75 %乙醇(DEPC水配制），輕輕顛倒混勻， 常溫離心:8000rpm離心5分鐘。
[0096] 5、溶解RNA:去上清，并將EP管倒扣于吸水紙上，吸干管口。再于離心機(jī)上空甩幾 秒，用加樣槍將剩余的酒精全部吸出，風(fēng)干3 - 5分鐘。加入一定體積的無(wú)核酸酶的水溶解 RNA〇
[0097] 6、紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。提取得到的RNA放-20 °C保存，一個(gè)月內(nèi)可用；置 于-80°C則可保存相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間。
[0098] 實(shí)施例2RNA反轉(zhuǎn)錄
[0099] 1、按照表1配制反轉(zhuǎn)錄體系，總反應(yīng)體積為25μ1(總RNA量為lyg)。以下操作均在冰 上進(jìn)行：
[0100]表1反轉(zhuǎn)錄體系的配制
[0102] 2、將以上各反應(yīng)組分配制到0.2ml的PCR反應(yīng)管中后，放入PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，程序?yàn)?7°C，2h; 4°C，forever。反應(yīng)結(jié)束后得到的產(chǎn)物即為cDNA，將反應(yīng)產(chǎn)物取出后放 于-20 °C保存待用。
[0103] 實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
[0104] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0105] 2、反應(yīng)管中先配制2倍體積的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXΠ 混合物，混勻后分裝至兩個(gè)0.2ml的PCR反應(yīng)管中，再分別加入目的基因 SEQ ID N0:l的引物對(duì)SEQIDN0:2和3或內(nèi)參GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的引物，輕輕混勾。
[0106] 3、將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，1分鐘;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40個(gè)循環(huán)。然后95°C，1分鐘;60°C，1分鐘，95°C，30s。熒光收集點(diǎn)在60 。(：，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR產(chǎn)物SEQ ID N0:4。
[0107] 4、將獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。
[0108] 表2 real time PCR mix的配制
[0110] 實(shí)施例4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
[0111] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0112] 2、反應(yīng)管中先配制2倍體積的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXΠ 混合物，混勻后分裝至兩個(gè)0.2ml的PCR反應(yīng)管中，再分別加入目的基因 SEQ ID NO: 1的引物對(duì)SEQ ID NO: 5和6或內(nèi)參GAPDH的引物，輕輕混勻。
[0113] 3、將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，1分鐘;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40個(gè)循環(huán)。然后95°C，1分鐘;60°C，1分鐘，95°C，30s。熒光收集點(diǎn)在60 。(：，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR產(chǎn)物SEQ ID N0:7。
[0114] 4、將獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。
[0115]表2 real time PCR mix的配制
[0117] 實(shí)施例5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
[0118] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0119] 2、反應(yīng)管中先配制2倍體積的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXΠ 混合物，混勻后分裝至兩個(gè)0.2ml的PCR反應(yīng)管中，再分別加入目的基因 SEQ ID NO: 1的引物對(duì)SEQ ID NO: 8和9或內(nèi)參GAPDH的引物，輕輕混勻。
[0120] 3、將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，1分鐘;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40個(gè)循環(huán)。然后95°C，1分鐘;60°C，1分鐘，95°C，30s。熒光收集點(diǎn)在60 。(：，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR產(chǎn)物SEQ ID N0:10。
[0121] 4、將獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。
[0122] 表2 real time PCR mix的配制
[0124] 實(shí)施例6 MAP7在CN-AML患者和正常人骨髓或外周血中的表達(dá)檢測(cè)和比較分析及 與其它CN-AML預(yù)后標(biāo)志物之間的比較
[0125] 對(duì)原始細(xì)胞在70-97 %的CN-AML患者骨髓樣品116例和正常人骨髓樣品5例，通過(guò) 基因芯片高通量基因表達(dá)水平檢測(cè)得到，根據(jù)實(shí)施例1 一2的試驗(yàn)條件，進(jìn)行MAP7表達(dá)檢測(cè)， 得到圖 1A，表明GSE1159(GSE是http://www.ncbi .nlm.nih. gov/geo中樣本檢測(cè)號(hào)）中 116例 CN-AML患者骨髓標(biāo)本（原始細(xì)胞在70-97%)VS 5例正常人骨髓樣品MAP7表達(dá)增高（p = 0.04)(圖1A)。以原始細(xì)胞在70-97%的CN-AML患者外周血樣品7例，正常人外周血樣品10例 進(jìn)行MAP7表達(dá)檢測(cè)，得到圖1B，表明GSE9476中7例CN-AML患者外周血樣品（原始細(xì)胞在70-97%)VS 10例正常人外周血樣品MAP7表達(dá)增高(p = 0.008)(圖1B)。
[0126] 實(shí)施例7 MAP7在CN-AML患者組織樣品中的表達(dá)檢測(cè)及與其它CN-AML預(yù)后標(biāo)志物 之間的比較
[0127]通過(guò)基因芯片高通量基因表達(dá)水平檢測(cè)方法，根據(jù)實(shí)施例1 一 2的試驗(yàn)條件，對(duì)CN-AML患者組織樣品中MAP7和其它預(yù)后標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAP7 的表達(dá)與FLT3-ITD成正相關(guān)，與雙突變CEBPA成負(fù)相關(guān)（圖1C)，其它預(yù)后不良標(biāo)志物更容易 在MAP7高表達(dá)中出現(xiàn)，預(yù)后良好標(biāo)志物更容易在MAP7低表達(dá)中出現(xiàn)，（圖1D)。
[0128] 實(shí)施例8 MAP7的表達(dá)水平檢測(cè)及與CN-AML其它指標(biāo)的單因素和多因素分析
[0129] 通過(guò)基因芯片高通量基因表達(dá)水平檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施例1 一 2的試驗(yàn)條件，對(duì)GSE6891 中129例初治的CN-AML患者(年齡小于60歲）的外周血樣品中MAP7的表達(dá)水平和CN-AML其它 指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素分析。
[0130] 單因素檢測(cè)和分析結(jié)果證實(shí)：在MAP7high組，1)攜帶FLT3-ITD的比例更高（p = 0.005) ;2)攜帶雙突變CEBPA的比例更低（p = 0.005) ;3)具有較高的ERG、WT1、DNMT3B、 DNMT3A、MAPKBP1、ITPR2、ATP1B1(P = 0.0004、P〈0.0001、P〈0.0001、P = 0.03、P = 0.01、P = 0·005、Ρ〈0·001)(表3)。
[0131] 多因素分析中同樣證實(shí)：與其它預(yù)后不良因素比較，在CN-AML中，MAP7hlgh均具有 較短的0S和EFS (表4)。
[0132] 表3 :MAP7的表達(dá)水平與CN-AML其它指標(biāo)的單因素分析
[0133]

[0135] 說(shuō)明：FAB，F(xiàn)rench-American-B;ritish classification(法、美、英分型系統(tǒng)）； ITD,internal tandem duplication(內(nèi)部串耳關(guān)重復(fù)）；TKD,tyrosine kinase domain(酪氨 酸激酶結(jié)構(gòu)域）。高ERG,BAALC,LEF1 ,WT1，DNMT3B，DMMT3A，MAPKP1, ITPR2和ATP1B1 表達(dá)分別 定義為高于所有樣品平均值的表達(dá)水平。
[0136] 表4:MAP7的表達(dá)水平與CN-AML其它指標(biāo)的多因素分析
[0137]
[0138] HR,hazards ratio(風(fēng)險(xiǎn)比）；CI，confidence interval(置信區(qū)間）〇
[0139] 實(shí)施例9 MAP7是CN-AML患者的不良預(yù)后標(biāo)志物
[0140]通過(guò)基因芯片高通量基因表達(dá)水平檢測(cè)方法，根據(jù)實(shí)施例1 一 2的試驗(yàn)條件，對(duì)CN-AML (129例，年齡小于60歲）患者的骨髓樣品進(jìn)行MAP7表達(dá)水平檢測(cè)，并且進(jìn)行預(yù)后分析。 MAP7high具有較短的0S(p = 0 · 0441)和EFS(p = 0 · 0114)(圖2A、B)。因?yàn)樵贓LN指南分類標(biāo)準(zhǔn) 中，CN-AML幾乎全部分布在中危-I，對(duì)ELN中危-I患者進(jìn)行了預(yù)后分析，在這一組患者樣品 中，MAP7 higt^樣具有較短的0S(p = 0.0344)和EFS(p = 0.0052)(圖2C、D)。
[0141] 結(jié)論:1)MAP7是CN-AML患者預(yù)后不良標(biāo)志物;2)MAP7在ELN指南中危-I中均是預(yù)后 不良標(biāo)志物，因此MAP7可以作為CN-AML危險(xiǎn)度分層和預(yù)后標(biāo)志物進(jìn)一步細(xì)化這類患者。 MAP7高表達(dá)的CN-AML患者具有較高的危險(xiǎn)度分層和較差的臨床預(yù)后，MAP7低表達(dá)的CN-AML 患者具有較低的危險(xiǎn)度分層和較好的臨床預(yù)后。
[0142] 上述實(shí)施例只是為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不是在任何方面限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0143] 序列表
[0144] SEQ ID N0:1:MAP7的mRNA序列，4536bp:

[0151] SEQ ID N0:4:MAP7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列：
[0153] SEQ ID N0:5:MAP7引物：
[0154] ccagaagaccaaaagcaccc
[0155] SEQ ID N0:6:MAP7引物：
[0156] agctagctgtttctcccgtt
[0157] SEQ ID NO :7 :MAP7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列：
[0159] SEQ ID N0:8:MAP7引物：
[0160] catcttgcagccccatcatc
[0161] SEQ ID N0:9:MAP7引物：
[0162] agctggttgtcttgctttgg
[0163] SEQ ID NO :10 :MAP7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管結(jié)合蛋白7表達(dá)高低 的試劑盒，特征在于，其中包含微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針。2. -種用于檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管結(jié)合蛋白7表達(dá)高低 的基因芯片，特征在于，其中包括固相載體和微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針。3. -種檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管結(jié)合蛋白7表達(dá)高低的方 法，特征在于，使用微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管結(jié)合蛋白7 表達(dá)高低的試劑盒，特征在于，其中所述微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)是下面任一組的序列 或者它們的互補(bǔ)序列： 第一組引物對(duì)： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二組引物對(duì)： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對(duì)： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。5. 根據(jù)權(quán)利要求2的檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管結(jié)合蛋白7 表達(dá)高低的基因芯片，特征在于，其中所述微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)是下面任一組的序 列或者它們的互補(bǔ)序列： 第一組引物對(duì)： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二組引物對(duì)： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對(duì)： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。6. 根據(jù)權(quán)利要求3的檢測(cè)正常核型急性髓系白血病細(xì)胞或組織樣品中微管結(jié)合蛋白7 表達(dá)高低的方法，特征在于，其中所述微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)是下面任一組的序列或 者它們的互補(bǔ)序列： 第一組引物對(duì)： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二組引物對(duì)： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對(duì)： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。7. -組引物對(duì)，特征在于，其序列是下面任一組的序列或者它們的互補(bǔ)序列： 第一組引物對(duì)： LEFT PRIMER tcctgggagctgcaattaca SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER gggtgcttttggtcttctgg SEQ ID NO：3 第二組引物對(duì)： LEFT PRIMER ccagaagaccaaaagcaccc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER agctagctgtttctcccgtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對(duì)： LEFT PRIMER catcttgcagccccatcatc SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER agctggttgtcttgctttgg SEQ ID NO:9。8. 微管結(jié)合蛋白7基因的引物對(duì)或者探針在制備通過(guò)檢測(cè)微管結(jié)合蛋白7的表達(dá)高低 而對(duì)正常核型急性髓系白血病進(jìn)行危險(xiǎn)度分層或預(yù)后評(píng)估的基因芯片或試劑盒中的用途。9. 微管結(jié)合蛋白7基因在設(shè)計(jì)或制備用于正常核型急性髓系白血病檢測(cè)、危險(xiǎn)度分層 或預(yù)后評(píng)估的試劑、試劑盒或基因芯片中的用途。10. 微管結(jié)合蛋白7基因在篩選或制備用于治療正常核型急性髓系白血病的藥物中的 用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969868SQ201610344737
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】石金龍, 付林, 付華平, 徐克曼, 王晶, 克曉燕
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)第三醫(yī)院