專利名稱：改進(jìn)的對(duì)mage-a表達(dá)的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)MAGE-A家族基因表達(dá)的檢測(cè)。更具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)甲基化或 非甲基化形式MAGE-A3的方法以及相關(guān)寡核苷酸、引物、探針、引物對(duì)和試劑盒。本發(fā)明的 方法涉及擴(kuò)增技術(shù)，特別是基于熒光的實(shí)時(shí)和終點(diǎn)PCR方法，并且具有診斷、預(yù)后和治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MAGE基因?qū)儆诎┌Y/睪丸抗原家族。MAGE基因家族包含超過(guò)20個(gè)成員，其 由 MAGEA、B、C 和 D 基因組成(Scanlan 等，(2002) Immunol Rev. 188 :22_32 ；Chomez 等， (2001)Cancer Res. 61(14) :5544_51)。它們?cè)谌旧w X 上成簇(Lucas 等，1998 Cancer Res. 58. 743-752 ;Lucas等，1999 Cancer Res 59 :4100_4103 ;Lucas等，2000 Int J Cancer 87:55-60 ；Lurquin 1997 Genomics 46:397—408 ；Muscatelli 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92 :4987-4991 ;PoId 等，1999Genomics 59 :161-167 ;Rogner 等 1995 Genomics 29 :725-731)，并且具有尚未確定的功能(Ohman 等 2001 Exp Cell Res. 265(2) 185-94) MAGE基因具有高度的同源性，尤其是，MAGE-A家族的成員具有60-98%的同源性。人MAGE-A3基因在多種類型的腫瘤中表達(dá)，包括黑素瘤(Furuta等，2004CanCer Sci.95,962-968.)、膀胱癌、肝細(xì)胞癌(Qiu 等，2006. ClinicalBiochemistry 39， 259-266)、胃癌(Honda 等，2004 British Journal of Cancer 90，838-843)、結(jié)腸直腸癌 (Kim 等，2006 World Journal of Gastroenterology 12,5651-5657)以及肺癌(NSCLC) (Scanlan等 2002 Immunol Rev. 188 :22_32 Jang等 2001 Cancer Res. 61，21 :7959_7963)。 除了睪丸生殖細(xì)胞或胎盤之外，在任何正常成體組織中未觀察到其表達(dá)(Haas等，1988 Am J Reprod ImmunolMicrobiol 18 47-51 ；Takahashi φ, 1995 Cancer Res 55:3478—382)。ifiJ^ #^tifg SE^ (Antigen-Specific Cancer Immunotherapeutics, ASCI)代表設(shè)計(jì)用于訓(xùn)練免疫系統(tǒng)以高度特異性方式識(shí)別并清除癌細(xì)胞的新藥物類型。由 此，ASCI允許靶向治療。ASCI具有兩個(gè)基本組分引導(dǎo)特異性針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的“腫 瘤抗原”和“佐劑系統(tǒng)”，其包含被選來(lái)增加抗腫瘤免疫應(yīng)答的免疫激活化合物。W099/40188 中描述了適用于ASCI的MAGE-A3抗原和構(gòu)建物，最近已經(jīng)報(bào)道了令人鼓舞的在非小細(xì)胞肺 癌(Non Small LungCancer, NSCLC)患者中使用 MAGE-A3 ASCI 的二期研究結(jié)果(J.Clin· Oncol. Vol. 25, No. 18S(June 20 Suppl.) 2007 :7554)。重要的是擁有下述的定量高通量測(cè)定，即能夠特異性鑒定會(huì)受益于免疫治療 的MAGE-A3表達(dá)患者，出于給藥目的監(jiān)測(cè)MAGE-A3表達(dá)，在臨床試驗(yàn)中鑒定Mage-A3表達(dá) 樣品，或者簡(jiǎn)單地鑒定早期癌癥患者。已經(jīng)描述了許多可應(yīng)用的診斷方法，其包括半定量 RT-PCR(De Plaen 等，1994 Immunogenetics40 (5) :360_9)，其它基于 PCR 的技術(shù)以及低密 度微陣列(Zammatteo 等，2002Clinical Chemistry 48 (1) 25-34)。此外，W02007/147876 中 描述了用于聯(lián)合MAGE-A3 ASCI使用的改進(jìn)的RT-PCR方法。現(xiàn)有測(cè)定最大的缺點(diǎn)在于它們需要分離RNA來(lái)評(píng)估MAGEA3的表達(dá)。甲醛固定石蠟包埋(Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded(FFPE))腫瘤組織是臨床中心常用的腫瘤組 織保存方法。在甲醛中固定改變了組織中RNA分子的結(jié)構(gòu)，造成交聯(lián)以及部分降解。部分 降解導(dǎo)致產(chǎn)生100-300堿基對(duì)的較小RNA片段。這些RNA的結(jié)構(gòu)改變限制了從FFPE組織 中提取的RNA應(yīng)用于檢測(cè)MAGE3表達(dá)水平。本發(fā)明的目的是提供消除了現(xiàn)有測(cè)定缺點(diǎn)的改進(jìn)測(cè)定。基因甲基化是基因表達(dá)的重要調(diào)控因素。特別地，特定基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG 二核 苷酸對(duì)中發(fā)現(xiàn)的胞嘧啶殘基甲基化可以通過(guò)下調(diào)基因表達(dá)對(duì)許多疾病狀況有貢獻(xiàn)。例如， 腫瘤抑制基因的異常甲基化可導(dǎo)致這些基因上調(diào)或下調(diào)，因此與許多癌癥的存在和發(fā)展相 關(guān)(Hoffmann等，2005Biochem Cell Biol83 :296_321)。異常基因甲基化模式經(jīng)常是組織 來(lái)源特異性的。因此，特定基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)可能具有預(yù)后或診斷應(yīng)用，并且可用于 確定疾病的相對(duì)階段以及預(yù)測(cè)對(duì)具體治療類型的響應(yīng)(Laird. 2003 Nat Rev Cancer 3 253-266)。在凝膠上顯現(xiàn)結(jié)果的甲基化-特異性PCR(MSP)(基于凝膠的MSP測(cè)定)廣泛應(yīng) 用于測(cè)定基因的表觀遺傳學(xué)沉默(Esteller M等，Cancer Res2001 ；61 :3225_9.)，盡管已 開發(fā)了使用其它技術(shù)的定量檢測(cè)(Laird Pff.，Nat RevCancer 2003 ；3 :253_66 ；Eads等， Nucleic Acids Res 2000 ；28 :E32 ；Mikeska T，等，J Mol Diagn 2007)。許多基于熒光的技術(shù)可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)。一個(gè)這樣的技術(shù)描述于US 6，090，552和EP 0912597，其已知以Amplifluor 形式出售。此方法還適用于終點(diǎn)監(jiān)測(cè)核 酸擴(kuò)增反應(yīng)。Vlassenbroeck 等人(Vlassenbroeck 等，2008. Journal of Molec. Diagn., νιο, No. 4)還描述了使用Amplifluor 技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化直接實(shí)時(shí)MSP測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及檢測(cè)MAGE-A3表達(dá)的改進(jìn)方法和/或測(cè)定。本發(fā)明還涉及某些類型的 治療，特別是基于抗原特異性癌癥免疫療法(ASCI)對(duì)患者進(jìn)行治療，所述患者通過(guò)使用本 文所述的寡核苷酸、引物、探針、引物對(duì)、試劑盒和/或方法被鑒定為表達(dá)MAGE-A3。通過(guò)測(cè) 定MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)而不是測(cè)定基因表達(dá)水平本身來(lái)監(jiān)測(cè)MAGE-A3蛋白表達(dá)。本 發(fā)明人顯示出，它們的甲基化檢測(cè)的甲基化狀態(tài)結(jié)果與RT-PCR測(cè)定獲得的結(jié)果具有良好 的一致性，所述RT-PCR測(cè)定建立了受益于MAGE-A3免疫療法的NSCLC中MAGE-A3表達(dá)的預(yù) 測(cè)值。因此，所述測(cè)定可用于選擇適于治療的患者，用于預(yù)測(cè)成功治療患者的可能性，以及 可用于幫助患者選擇治療。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸、引物或探針，所述寡核苷酸、引物或探針包 含 SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 25 中任意的核苷酸序列
或者基本由其組成或者由其組成，所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè)基因的甲基化狀 態(tài)。所述寡核苷酸、引物或探針優(yōu)選包含5’到3’順序的下列連續(xù)序列或基本由其組 成或由其組成(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸 用選自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體部分(moiety)和受體部分的第一部分標(biāo)記，其中所述供體 部分在受激發(fā)時(shí)發(fā)出一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)的熒光，所述受體部分吸收和/或淬滅所述供體部分發(fā)射的所述熒光；(b)第二單鏈核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸、基本由其組成或者由其組 成；(c)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸、基本由其組成或由其組成，其中 所述第三核苷酸序列中的核苷酸用選自所述供體部分和所述受體部分的第二部分標(biāo)記，所 述第二部分是所述組(group)中未用于標(biāo)記所述第一核苷酸序列的成員，其中所述第三核 苷酸序列反向互補(bǔ)于所述第一核苷酸序列，從而所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序 列之間可形成雙鏈體使得所述第一部分和所述第二部分鄰近，從而當(dāng)供體部分受激發(fā)發(fā)射 熒光時(shí)，受體部分吸收并淬滅所述供體部分發(fā)射的所述熒光；以及(d)在引物的3’端，第四單鏈核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸、基本由其組 成或者由其組成，所述核苷酸在其3，端包含SEQ ID NO. 2、4、5、7、8、11、13、14、16、17、19或 25中的任意核苷酸序列；其中當(dāng)未形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分和所述第二部分分開一定距離，該距 離阻止所述第一和第二部分之間的分子能量轉(zhuǎn)移。3’端的特異性核苷酸序列允許測(cè)定MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。用合適試劑處理 之后，這些引物優(yōu)先結(jié)合非甲基化形式的MAGEA3基因(如本文所討論的)。本文討論了這 些寡核苷酸的性能，這些討論可經(jīng)必要的修改加以應(yīng)用。通過(guò)核酸聚合酶，這些特異性核苷 酸序列能夠引發(fā)與包含MAGE A家族基因的甲基化或非甲基化DNA部分的核酸鏈互補(bǔ)的核 苷酸序列的合成。更優(yōu)選地，所述寡核苷酸、引物或探針由SEQ ID NO. 3、6、9、12、15或18的核苷酸
序列組成并用于擴(kuò)增目的基因的部分。本發(fā)明還提供了包含下列引物的引物對(duì)，所述引物包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、 8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19或25中任意的核苷酸序列，或基本由其組成或者由其組成。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了包含至少一個(gè)引物、引物對(duì)或引物組的試劑盒，所 述引物、引物對(duì)或引物組包含 SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19
或25中任意的核苷酸序列，或基本由其組成或者由其組成。所述試劑盒用于檢測(cè)基因、特 別是MAGE-A家族基因例如MAGE-A3的甲基化狀態(tài)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA樣品中Mage-A3基因甲基化狀態(tài)的方法， 其包括(a)用試劑接觸/處理含DNA樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中的非甲基化胞嘧啶 殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基，但所述試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘基(b)使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分的甲基化或非甲基化目的基因，所述引 物對(duì)的至少一個(gè)引物設(shè)計(jì)成僅分別結(jié)合用所述試劑處理之后的甲基化或非甲基化DNA，其 中所述引物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含SEQ ID N0. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或25中的任意核苷酸序列(根據(jù)需要)，或基本由其組成或者由其組成。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷癌癥或者癌癥傾向性(predisposition)的方 法，包括通過(guò)使用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中 MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，其中樣品中存在非甲基化MAGE-A3指示癌癥或者癌癥傾向性。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了確定MAGE-A3陽(yáng)性腫瘤存在的方法，包括通過(guò)使用 本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中MAGE-A3基因的甲基 化狀態(tài)，其中存在非甲基化MAGE-A3指示MAGE-A3陽(yáng)性腫瘤的存在?！癕GAE-A3陽(yáng)性腫瘤” 指表達(dá)MAGE-A3抗原的任何腫瘤或腫瘤細(xì)胞(分離自患者)。本發(fā)明還提供了鑒定和/或選擇適于用MAGE-A3免疫療法治療的患者的方法，包 括通過(guò)使用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中MAGE-A3 基因甲基化狀態(tài)，其中如果MAGE-A3基因是非甲基化的，則(優(yōu)選地)鑒定和/或選擇所述 對(duì)象進(jìn)行MAGE-A3免疫療法。因此，具有非甲基化MAGEA3的患者優(yōu)于所述基因甲基化的患
者ο或者，如果所述基因是非甲基化的，則優(yōu)選地不鑒定和/或選擇所述對(duì)象進(jìn)行使 用MAGE-A3免疫療法的治療。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)成功治療癌癥的可能性的方法，包括使用本文所 述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)， 其中如果所述基因是非甲基化的，則使用MAGE-A3免疫療法成功治療的可能性高于所述基 因甲基化的情況?；蛘撸瑯悠分袥](méi)有非甲基化的MAGE-A3指示對(duì)使用MAGE-A3免疫療法治療有抗性 的可能性高于所述基因非甲基化的情況。因此，甲基化MAG3-A3基因的檢測(cè)指示使用免疫 療法成功治療的可能性低。在另外的相關(guān)方面，本發(fā)明提供了選擇合適癌癥治療方案的方法，包括使用本文 所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中MAGE-A3基因甲基化狀 態(tài)，其中如果所述基因是非甲基化的，則選擇免疫療法進(jìn)行治療?；蛘?，如果所述基因是非甲基化的，則指示不使用免疫療法治療。本發(fā)明還提供了在對(duì)象中治療癌癥的方法，包括施用免疫療法，其中已基于對(duì) MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)選擇所述患者進(jìn)行治療，其中根據(jù)本發(fā)明的任何方法或者 通過(guò)使用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或者方法檢測(cè)MAGE-A3基因的 甲基化狀態(tài)。優(yōu)選地，對(duì)于本文所述的所有不同方面，非甲基化MAGE-A3基因的檢出對(duì)應(yīng)于 MAGE-A3蛋白水平的提高。本發(fā)明還提供了治療患者的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的任何方法通過(guò)使用本文所 述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法測(cè)定MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，以及然 后向所述患者施用根據(jù)本文所述的包含MAGE-A3的組合物。如果發(fā)現(xiàn)所述MAGE-A3基因是 非甲基化的，優(yōu)選施用所述組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了治療易感于MAGE-A3表達(dá)(MAGE-A3-expressing) 腫瘤復(fù)發(fā)的患者的方法，所述患者已經(jīng)接受治療除去了腫瘤組織，所述方法包括根據(jù)本 發(fā)明的任何方法或者通過(guò)使用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法測(cè)定 腫瘤組織中MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，以及然后向所述患者施用根據(jù)本文所述的包含 MAGE-A3的組合物。如果發(fā)現(xiàn)所述MAGE-A3基因是非甲基化的，優(yōu)選施用所述組合物。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了包含MAGE-A3的組合物在制備用于治療腫瘤患者 的藥物中的用途，其中已基于對(duì)MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)選擇所述患者進(jìn)行治療，其中根據(jù)本發(fā)明的任何方法或者通過(guò)使用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑 盒或者方法檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。本發(fā)明還提供了包含MAGE-A3的組合物，其用 于治療腫瘤患者，其中已基于對(duì)MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)選擇所述患者進(jìn)行治療， 其中根據(jù)本發(fā)明的任何方法或者通過(guò)使用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑 盒或者方法檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含MAGE-A3的組合物在制備藥物中的用 途，所述藥物用于治療易感于MAGE-A3表達(dá)腫瘤復(fù)發(fā)的患者，其中已基于對(duì)MAGE-A3基因甲 基化狀態(tài)的檢測(cè)選擇所述患者進(jìn)行治療，其中根據(jù)本發(fā)明的任何方法或者通過(guò)使用本文所 述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或者方法檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。還 提供了包含MAGE-A3的組合物，其用于治療易感于MAGE-A3表達(dá)腫瘤復(fù)發(fā)的患者，其中已基 于對(duì)MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)選擇所述患者進(jìn)行治療，其中根據(jù)本發(fā)明的任何方法 或者通過(guò)使用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或者方法檢測(cè)MAGE-A3基 因的甲基化狀態(tài)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或非甲基化MAGE-A3基因存在和/或 數(shù)量的測(cè)定。為了開發(fā)此測(cè)定，需要鑒定MAGE-A3基因中易于甲基化的區(qū)域，并且開發(fā)特定 的可以區(qū)分MAGE-A3基因的非甲基化形式和甲基化形式區(qū)的寡核苷酸。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或25中任意的核苷酸序列，或者基本由其組成，或者由其組 成。這些寡核苷酸可用于檢測(cè)目的基因的甲基化狀態(tài)。所述寡核苷酸可用作引物和/或探 針。在某些實(shí)施方式中，所述寡核苷酸檢測(cè)非甲基化形式的所述基因。用于檢測(cè)非甲基化 形式的合適寡核苷酸包含SEQ ID N0.2、4、5、7、8、ll、13或25中任意的核苷酸序列，或者基 本由其組成，或者由其組成。用于檢測(cè)甲基化形式的合適寡核苷酸包含SEQ ID NO. 14、16、 17或19中任意的核苷酸序列，或者基本由其組成，或者由其組成。在某些實(shí)施方式中，如 本發(fā)明所述這些寡核苷酸包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些優(yōu)選的寡核苷酸包含根據(jù)SEQ ID NO. 3,6,9 和12的序列，以檢測(cè)非甲基化形式的所述基因，以及SEQ ID NO. 15和18，以檢測(cè)甲基化形 式的所述基因。本發(fā)明的“基因”或“目的基因”優(yōu)選地為MAGEA3和/或MAGEA6基因。MAGEA3和 MAGEA6是由HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的基因符號(hào)。MAGEA3基因位于X染色體(位置q28)， 其基因序列以登錄號(hào)NM 005362和ENSG00000197172列出。MAGE-A3基因編碼黑素瘤抗原 家族A，3。MAGEA6基因位于X染色體(位置q28)。MAGE-A3經(jīng)?？苫Q地被稱為MAGE-3 或MAGEA3。類似地，MAGE-A6經(jīng)常可互換地被稱為MAGE-6或MAGEA6 ；其所有均在本文中使 用。這些基因的低甲基化可能與癌癥發(fā)生相關(guān)聯(lián)，例如黑素瘤或肺癌(包括NSCLC)。易于甲基化的CpG 二核苷酸通常集中在人基因的啟動(dòng)子區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中， 通過(guò)確定所述基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平來(lái)評(píng)估所述基因的甲基化狀態(tài)?！皢?dòng)子”是轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)(TSS)的上游區(qū)域，其從TSS延伸約IOkb、3kb、Ikb、500bp或者150至300bp。 對(duì)于MAG3-3，啟動(dòng)子區(qū)域的CpG分布相當(dāng)缺乏。術(shù)語(yǔ)“甲基化狀況”或者“甲基化狀態(tài)”指DNA序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)CpG 二核苷酸處 存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)?！案呒谆倍x為甲基化水平高于正常水平的增加。因此，它涉及基因的特定CpG位點(diǎn)處胞嘧啶的異常甲基化(5-mCyt)，經(jīng)常是在啟動(dòng) 子區(qū)。例如可以通過(guò)確定非癌細(xì)胞中甲基化的水平來(lái)確定甲基化的正常水平?！暗图谆敝?，相對(duì)于“正?！盌NA序列(在合適對(duì)照樣品中發(fā)現(xiàn)的)中相應(yīng)CpG 二核苷酸處發(fā)現(xiàn)的5-mCyt的量，(測(cè)試DAN樣品的)DNA序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)CpG 二核苷酸處 5-mCyt存在減少。同樣，例如可以通過(guò)確定非癌細(xì)胞中甲基化的水平來(lái)確定甲基化的“正 ?！彼?。在本發(fā)明中，MAGE-A3和/或MAGE-A6基因的低甲基化指示此腫瘤相關(guān)抗原基因 表達(dá)增加，其提供了可靠的癌癥指標(biāo)。在第二方面中，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或非甲基化基因的存在和 /或數(shù)量的方法，其包括將所述含DNA樣品與至少一種寡核苷酸相接觸的步驟，所述寡核苷 酸包含 SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 25 中任意的核苷酸 序列，或基本由其組成，或由其組成。所述方法優(yōu)選地包括評(píng)估所述基因是甲基化還是非甲 基化的額外步驟。如本文所述，這可能取決于寡核苷酸是否穩(wěn)定結(jié)合所述含DNA樣品中的 DNA。用于評(píng)估甲基化狀態(tài)的技術(shù)基于不同的方法?？衫脩?yīng)用本發(fā)明寡核苷酸的任何 合適技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)甲基化CpG 二核苷酸基序的方法使用選擇性修飾DNA 中非甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基的試劑。所述試劑不修飾甲基化的胞嘧 啶殘基，因此允許在下游過(guò)程中區(qū)分非甲基化和甲基化核酸分子，所述下游過(guò)程優(yōu)選地可 包括核酸擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑用作選擇性脫去非甲基化胞嘧啶殘基的氨基。 因此，在暴露于所述試劑之后，非甲基化DNA含有與相應(yīng)甲基化DNA不同的核苷酸序列。胞 嘧啶的脫氨基導(dǎo)致出現(xiàn)尿嘧啶殘基，其具有與胸腺嘧啶相同的堿基配對(duì)性質(zhì)，而不同于胞 嘧啶的堿基配對(duì)行為。這使得有可能區(qū)分甲基化和非甲基化胞嘧啶。用于評(píng)估序列差異的有用的常規(guī)技術(shù)使用寡核苷酸引物。有兩種引物設(shè)計(jì)的方法 可用。第一，可以設(shè)計(jì)自身不覆蓋任何DNA甲基化可能位點(diǎn)的引物。不同甲基化的位點(diǎn)的 序列變化位于兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)之間，對(duì)序列變化的顯現(xiàn)需要進(jìn)一步的測(cè)定步驟。第二，可 以設(shè)計(jì)與甲基化或非甲基化版本的初始處理序列特異性雜交的引物。雜交之后，可進(jìn)行擴(kuò) 增反應(yīng)，使用本領(lǐng)域已知的任何檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述引物與 DNA雜交。所述引物的特異性表明DNA是否已經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)修飾，其繼而表明DNA是否已 被甲基化。如果與靶標(biāo)有足夠的互補(bǔ)區(qū)域，例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè) 核苷酸，那么所述引物還可含有不干擾雜交但可能對(duì)其它操作有用的額外核苷酸殘基。這 些其它殘基的實(shí)例可以是限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，配體結(jié)合位點(diǎn)或者因子結(jié)合或連接子或 重復(fù)，或者用于可視化目的的殘基。所述寡核苷酸引物可以或可以不使得它們對(duì)于經(jīng)修飾 的甲基化殘基是特異性的。用作引物的優(yōu)選寡核苷酸包含SEQ ID N0.2、3、4、5、6、7、8、9、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或25中任意的核苷酸序列，或者基本由其組成，或者由其組 成。另一種區(qū)分經(jīng)修飾和非修飾核酸的方法是使用寡核苷酸探針。這些探針可直接與 經(jīng)修飾核酸或者經(jīng)修飾核酸的進(jìn)一步產(chǎn)物(例如擴(kuò)增得到的產(chǎn)物)雜交?；谔结樀臏y(cè)定 利用了寡核苷酸與特異性序列的雜交以及隨后對(duì)該雜交物的檢測(cè)。在檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物之前， 可以還有另外的純化步驟，例如沉淀步驟?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)記寡核 苷酸探針。這些包括但不限于熒光部分、放射性同位素標(biāo)記部分、生物發(fā)光部分、發(fā)光部
12分、化學(xué)發(fā)光部分、酶、底物、受體或配體。用作探針的優(yōu)選寡核苷酸包含SEQ ID N0.2、4、5、 7、8、11、13、14、16、17、19或25中的任意核苷酸序列，或者基本由其組成，或者由其組成?！肮押塑账嵋铩痹诒疚闹锌苫Q地指“引物”。類似地，“寡核苷酸探針”在本文中 可互換地指“探針”。在優(yōu)選實(shí)施方式中，使用甲基化特異性PCR(MSP)確定所述基因(或其部分，尤其 是CpG島)的甲基化狀態(tài)。MSP技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在MSP方法中，使用設(shè)計(jì)用于區(qū)分非甲基化 DNA與甲基化DNA的引物對(duì)擴(kuò)增DNA，其利用了亞硫酸氫鈉處理結(jié)果的序列差異(Herman JG 等.，Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Sep 3 ；93 (18) :9821_6 和 WO 97/46705)。MSP 方 法的具體實(shí)例有實(shí)時(shí)定量MSP (QMSP)，其允許可靠地實(shí)時(shí)定量甲基化DNA。實(shí)時(shí)方法一般是基于連續(xù)光學(xué)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程，并且利用熒光標(biāo)記的試劑，所述試 劑在產(chǎn)物中的結(jié)合可以被定量，并且該定量指示模板中序列的拷貝數(shù)。這些標(biāo)記的試劑可 以是熒光染料，其優(yōu)先結(jié)合雙鏈DNA，與雙鏈DNA的結(jié)合大大提高了其熒光?；蛘?，可使用 帶標(biāo)記的引物和/或帶標(biāo)記的探針。它們代表了公知市售實(shí)時(shí)擴(kuò)增技術(shù)的具體應(yīng)用，例如 TAQMAN、MOLECULARBEACONS、AMPLIFLUOR 和 SC0RPI0N、DzyNA 等等。這些實(shí)時(shí)方法經(jīng)常被用 于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。TaqMan技術(shù)使用線性水解的寡核苷酸探針，其含有熒光染料和淬滅染料。當(dāng)照 射時(shí)，激發(fā)的熒光染料將能量轉(zhuǎn)移到附近的淬滅染料分子，而不是發(fā)射熒光(FRET原理)。 TaqMan探針退火至PCR產(chǎn)物的內(nèi)部區(qū)域，在復(fù)制模板時(shí)被聚合酶的核酸外切酶活性所切 割。這使得淬滅劑的活性終止，報(bào)告染料開始發(fā)射熒光，每個(gè)循環(huán)中的增加與探針切割的比 例成正比。分子信標(biāo)也包含熒光和淬滅染料，但是它們被設(shè)計(jì)成當(dāng)在溶液中游離時(shí)為發(fā)夾結(jié) 構(gòu)，其導(dǎo)致兩種染料非常接近以發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)。當(dāng)退火步驟中該信標(biāo)與靶 標(biāo)雜交時(shí)，所述發(fā)夾線性化，兩種染料(供體和受體/淬滅劑)分開。檢測(cè)到的來(lái)自供體的 熒光增加與可用PCR產(chǎn)物的量相關(guān)聯(lián)。利用蝎型探針(scorpion probe)，使用單個(gè)寡核苷酸實(shí)現(xiàn)序列特異性引發(fā)和PCR 產(chǎn)物檢測(cè)。所述蝎型探針維持非雜交狀態(tài)的莖_環(huán)構(gòu)型，熒光團(tuán)和淬滅劑之間發(fā)生FRET。 莖的3’部分還包含于引物的延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列。此序列通過(guò)非擴(kuò)增單體與特異性引物 的5’端相連。在蝎型引物延伸之后，所述特異性探針序列能夠與延伸的擴(kuò)增子內(nèi)的互補(bǔ)序 列結(jié)合，由此打開發(fā)夾環(huán)，使得熒光團(tuán)和淬滅劑分開，提供熒光信號(hào)。在重甲基(Heavymethyl)中，所述引發(fā)是甲基化特異性的，但是非延伸的寡核苷 酸阻斷物提供了用于代替引物自身的此特異性。該阻斷物結(jié)合甲基化特異性形式的亞硫酸 氫鹽處理的DNA，其結(jié)合部位與引物結(jié)合部位重疊。當(dāng)所述阻斷物結(jié)合時(shí)，所述引物就無(wú)法 結(jié)合，因此不產(chǎn)生擴(kuò)增子。重甲基可以與實(shí)時(shí)檢測(cè)聯(lián)合使用。Plexor qPCR和qRT_PCR系統(tǒng)利用兩個(gè)經(jīng)修飾核苷酸之間的特異性相互作用， 來(lái)實(shí)現(xiàn)定量PCR分析。PCR引物之一含有鄰近5’端iso-dC殘基的熒光標(biāo)記。第二 PCR 引物是未標(biāo)記的。反應(yīng)混合物包含脫氧核苷酸和用淬滅劑dabcyl標(biāo)記的iso-dGTP。 Dabcyl-iso-dGTP優(yōu)先并入與iso_dC殘基互補(bǔ)的位置。dabcyl-sio_dGTP在此位置的引入 導(dǎo)致互補(bǔ)鏈上熒光染料的淬滅以及熒光的減少，其允許在擴(kuò)增過(guò)程中的定量。對(duì)于這些多重反應(yīng)，每個(gè)靶序列可使用帶有不同熒光團(tuán)的引物對(duì)。因此，包含 SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 25 中
任意核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成的寡核苷酸可用作上述方法的引物或探針， 以檢測(cè)目的基因的甲基化狀態(tài)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或非甲基化目的 基因存在和/或數(shù)量的實(shí)時(shí)方法，其包括(a)用試劑接觸/處理所述含DNA樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中的非甲基化胞 嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基，但所述試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘基(b)使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分甲基化或非甲基化目的基因，所述引物 對(duì)中的至少一個(gè)引物設(shè)計(jì)成僅分別結(jié)合用所述試劑處理之后的甲基化或非甲基化DNA序 列，其中所述引物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、 15、16、17、18或19中任意核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。本發(fā)明方法中的目的基因優(yōu)選地是MAGE-A3和/或MAGEA6基因。優(yōu)選地，所述引 物對(duì)中的至少一個(gè)引物是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)帶有分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體 和受體部分，所述分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分的設(shè)置使得在不擴(kuò)增時(shí)，所述受體部 分淬滅由所述供體部分發(fā)射的熒光(激發(fā)后)，以及在擴(kuò)增過(guò)程中，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞使 得所述供體和受體部分分開到足以產(chǎn)生可檢出的熒光信號(hào)。這可以實(shí)時(shí)檢測(cè)，以提供對(duì)甲 基化或非甲基化目的基因存在的指示。所述引物對(duì)中的包含SEQ ID N0.2、3、4、5、6、7、8、9、 11、12、13、14、15、16、17、18或19中任意核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成的引物 優(yōu)選帶有所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，確定甲基化或非甲基化基因的基因拷貝數(shù)。此處，本文所述方 法優(yōu)選包括另外步驟(c)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)甲基化或非甲基化目的基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)的結(jié)果定量，產(chǎn)生 基因拷貝數(shù)輸出。優(yōu)選地，步驟(c)另外的特征在于在循環(huán)閾值小于40時(shí)認(rèn)為所述擴(kuò)增是有效的。對(duì)于例如MageA3和/或MageA6基因的基因來(lái)說(shuō)，檢測(cè)非甲基化版本的所述基因 可能是最相關(guān)的。本發(fā)明的方法允許實(shí)時(shí)檢測(cè)樣品中甲基化或非甲基化目的基因的存在。因?yàn)楸景l(fā) 明的方法是定量方法，所以還可以隨著反應(yīng)的進(jìn)行測(cè)定甲基化或非甲基化形式目的基因的 (相對(duì)的)量。但是，不需要利用實(shí)時(shí)方法?？蓛H為了發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)DNA是否存在于樣品中而進(jìn) 行分析，。終點(diǎn)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)利用與廣泛用于實(shí)時(shí)PCR的相同的方法。所以，本發(fā)明的方法 可涵蓋檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或非甲基化目的基因存在和/或數(shù)量的終點(diǎn)法。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或非甲基化目的基因存在和/或數(shù) 量的(終點(diǎn))方法，其包括 (a)用試劑接觸/處理所述含DNA樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中的非甲基化胞 嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基，但所述試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘基
(b)使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分甲基化或非甲基化目的基因，所述引物 對(duì)中的至少一個(gè)引物設(shè)計(jì)成僅分別結(jié)合用所述試劑處理之后的甲基化或非甲基化DNA序 列，其中所述引物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、
1415、16、17、18、19或25中的任意核苷酸，或基本由其組成，或由其組成。如上所述，本發(fā)明方法中的目的基因優(yōu)選地是MAGE-A3和/或MAGEA6基因。優(yōu)選 地，所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)帶有特征如上所述 的分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分。包含SEQ IDN0. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、
16、17、18或19中的任意核苷酸序列，或基本由其組成，或者由其組成的所述引物對(duì)中的引 物優(yōu)選地帶有所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)于MAGE-A3和/或MAGE-A6基因來(lái)說(shuō)，檢測(cè)非甲基化版本的所述基因可能是最 相關(guān)的。包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13或25中任意核苷酸序列的，或者基本 由其組成，或者由其組成的引物設(shè)計(jì)成用于檢測(cè)用所述試劑處理后的非甲基化MAGEA3DNA。非甲基化基因的缺乏將指示甲基化基因的存在。但是，甲基化基因的檢測(cè)也在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。包含SEQ ID NO. 14、15、16、17、18或19中任意核苷酸序列的，或者基本由 其組成，或者由其組成的引物設(shè)計(jì)成用于檢測(cè)用所述試劑處理后的非甲基化MAGEA3 DNA。在要求甲基化或非甲基化基因拷貝數(shù)的情況下，所述方法優(yōu)選地包括另外的步 驟(c)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)甲基化或非甲基化目的基因的檢測(cè)結(jié)果定量，產(chǎn)生基因拷 貝數(shù)輸出。所有本發(fā)明的實(shí)施方式適用于本發(fā)明的終點(diǎn)方面，因此可經(jīng)必要的修改加以應(yīng) 用。終點(diǎn)分析可能需要使用熒光平板讀數(shù)器或其它合適裝置來(lái)測(cè)定擴(kuò)增結(jié)束時(shí)的熒光。本發(fā)明的方法最優(yōu)選是對(duì)于任何合適(含DNA)測(cè)試樣品進(jìn)行的離體或體外方法。 但是，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還可包括獲得所述樣品的步驟。所述測(cè)試樣品是含DNA 樣品，特別是包含目的基因的含DNA樣品。本發(fā)明的方法可用于診斷疾病，特別是當(dāng)目的基 因甲基化(已知)與疾病發(fā)生相關(guān)聯(lián)的情況。所述含DNA樣品可包含任何合適的組織樣品或體液。優(yōu)選地，所述測(cè)試樣品獲得 自人對(duì)象。對(duì)于癌癥應(yīng)用，所述樣品可包含取自懷疑為癌性的組織或者取自代表性體液的 組織樣品。MAGE-A3基因的低甲基化已經(jīng)與肺癌相關(guān)聯(lián)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本 發(fā)明方法的包含MAGE-A3基因的測(cè)試樣品優(yōu)選包含肺細(xì)胞或者來(lái)自肺細(xì)胞的核酸。最優(yōu) 選地，所述樣品是福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織。肺癌有兩種類型非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。名稱簡(jiǎn)單地描述了腫瘤中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型。所述測(cè)試樣 品優(yōu)選地包含來(lái)自非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的細(xì)胞或核酸。NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和 大細(xì)胞癌，其占到肺癌的約80%。在優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)癌癥是NSCLC時(shí)，樣品是肺組織樣 品或痰樣品。NSCLC很難治愈，可用的治療的目的傾向于盡可能延長(zhǎng)壽命和減輕疾病癥狀。 NSCLC是最常見的肺癌類型，并且與差的后果相關(guān)聯(lián)。MAGE-A3基因的低甲基化也已經(jīng)與膀胱癌相關(guān)聯(lián)。因此，在另外的實(shí)施方式中，用 于本發(fā)明方法的更優(yōu)選的測(cè)試樣品包含移行膀胱細(xì)胞或者鱗狀癌膀胱細(xì)胞。優(yōu)選地，所述 測(cè)試樣品獲得自膀胱組織。更優(yōu)選地，其來(lái)自于尿，并且含有來(lái)自移行膀胱細(xì)胞或者鱗狀癌 膀胱細(xì)胞的核酸。所述測(cè)試樣品可來(lái)源于液體尿、其沉淀物或者尿中的沉淀物。可使用任 何合適的方法收集組織和體液，其中的許多是本領(lǐng)域公知的。MAGE-A3基因的低甲基化也已經(jīng)與黑素瘤相關(guān)聯(lián)。黑素瘤是有顏色易得到的(accessible)病變，其在組織病理期限上界限分明。早期的放射狀生長(zhǎng)期(RGP)黑素瘤可 侵入表皮和乳突真皮，但是沒(méi)有轉(zhuǎn)移的能力；在此階段進(jìn)行切除幾乎可以完全治愈。隨后的 垂直生長(zhǎng)期(VGP)表示向更具侵略性階段的轉(zhuǎn)變，其能夠轉(zhuǎn)移。因此，非常關(guān)注在RGP/VGP 變化中發(fā)生的基因表達(dá)改變。因此，在另外的實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的更優(yōu)選的測(cè)試 樣品包含黑素瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，所述測(cè)試樣品獲得自皮膚病灶。用于本發(fā)明方法的其它含DNA樣品包括用于診斷、預(yù)后或個(gè)體化醫(yī)學(xué)用途的樣 品。這些樣品可獲得自手術(shù)樣品，例如活組織檢查或者細(xì)針吸出物，來(lái)自石蠟包埋的組織， 來(lái)自冷凍的腫瘤組織樣品，來(lái)自新鮮腫瘤組織樣品或者來(lái)自新鮮或冷凍的體液。非限制性 實(shí)例包括全血、骨髓、腦脊髓液、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血漿、尿、乳糜、大便、精液、 痰、乳頭吸出物、唾液、拭子樣品、結(jié)腸洗出樣品以及刷出樣品。可使用任何合適的方法收集 組織和體液，許多這樣的方法是本領(lǐng)域公知的?？芍苯舆M(jìn)行石蠟包埋樣品的評(píng)估，或者在組 織切片上進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“樣品”、“患者樣品”和“患者的樣品”可互換地使用，如上所述意為來(lái) 自患者的含DNA樣品。本發(fā)明的方法可以針對(duì)純化的或未純化的含DNA樣品進(jìn)行。但是，在優(yōu)選實(shí)施方 式中，在步驟(a)(試劑處理步驟)之前或者作為預(yù)先的步驟，從含DNA樣品中分離/提 取/純化DNA?？衫萌魏魏线m的DNA分離技術(shù)?？稍跇?biāo)準(zhǔn)教科書中見到提純方法的例 子，例如分子克隆(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(第三版)，Sambrook and Russell (具體參見其中附錄8和第5章)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，純化包括醇沉淀DNA。 優(yōu)選的醇包括乙醇和異丙醇。合適的純化方法還包括基于鹽的沉淀方法。因此，在一個(gè)具 體實(shí)施方式中，DNA純化方法包括使用高濃度的鹽沉淀雜質(zhì)。所述鹽可包括例如乙酸鉀和/ 或乙酸銨，或基本由其組成或者由其組成。所述方法可另外包括除去已沉淀雜質(zhì)然后通過(guò) 醇沉淀回收DNA的步驟。在一個(gè)替代性實(shí)施方式中，DNA純化方法基于使用有機(jī)溶劑從細(xì)胞裂解物中萃 取雜質(zhì)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括使用苯酚、氯仿和異戊醇提取DNA。使用 合適的條件來(lái)確保雜質(zhì)分離進(jìn)入有機(jī)相，而DNA保留在水相中。其它的試劑盒使用磁珠、 二氧化硅膜等。這些試劑盒在本領(lǐng)域中是公知的，并且是市售的。本發(fā)明的方法可使用 PUREGENE DNA純化試劑盒。在這些純化方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)醇沉淀回收提取的DNA，例如乙醇或異丙
醇沉淀。福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織是臨床中心常見的腫瘤組織保存方 法。這些FFPE包埋的樣品要求在DNA提取之前進(jìn)行脫蠟步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中， FFPE組織樣品或固定于載玻片上的樣品材料首先通過(guò)二甲苯處理脫蠟。與二甲苯接觸的時(shí) 間應(yīng)足以使得二甲苯接觸樣品并與其相互作用。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，F(xiàn)FPE樣品在 100%二甲苯中脫蠟約2小時(shí)。該步驟可重復(fù)一次以確保完全脫蠟。在二甲苯處理后，使用 70%乙醇將樣品再水化。根據(jù)需要，本發(fā)明的方法也可包括(也在步驟(a)之前或者作為預(yù)備步驟)對(duì)樣 品中分離/提取/純化的DNA進(jìn)行定量。對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行定量可使用任何合適的方法 完成。對(duì)核酸的定量可以例如基于使用分光光度計(jì)、熒光計(jì)或UV透射儀。合適技術(shù)的例子 描述于標(biāo)準(zhǔn)教科書中，例如分子克隆(Molecular Cloning-Α Laboratory Manual)(第三版)，Sambrook and Russell (具體參見其中附錄8)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑盒例如 來(lái)自MolecularProbes，Invitrogen的Picogreen DNA定量試劑盒可用于對(duì)DNA進(jìn)行定量。本發(fā)明的方法依賴于選擇性修飾DNA中的非甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢出的 經(jīng)修飾殘基的試劑。所述試劑的作用方式已經(jīng)進(jìn)行了闡述。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，選擇性 修飾DNA中非甲基化胞嘧啶殘基一產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基但是不修飾甲基化胞嘧啶殘 基的試劑包括亞硫酸氫鹽試劑或基本由其組成或由其組成(Frommer等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199289 1827-1831)。一些含有亞硫酸氫鹽的試劑是本領(lǐng)域已知的，用于進(jìn)行脫氨 基作用反應(yīng)的合適試劑盒是市售的(例如來(lái)自Zymo Research的EZ DNA甲基化試劑盒)。 用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的試劑包括亞硫酸氫鈉或者基本由其組成或者由其組成。一旦用所述試劑對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行了處理，然后需要檢測(cè)由所述試劑引起的核 苷酸序列的差異。使用核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行該檢測(cè)。如所述，功能相關(guān)的甲基化最經(jīng)常與基因 的啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)聯(lián)。具體地，所謂的“CpG島”包含相對(duì)高的CpG殘基出現(xiàn)率(incidence)， 并且經(jīng)常在基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)。存在多種軟件程序來(lái)鑒定目的基因中的CpG島。因此， 本發(fā)明的方法可包括使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分甲基化或非甲基化目的基因。如 上所討論的，因?yàn)榇芯考谆癄顟B(tài)的目的殘基通常在目的基因的所定義的CpG島和/或 啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)，所以所述引物對(duì)通常僅僅擴(kuò)增基因的一部分(在該區(qū)域內(nèi))而不是整 個(gè)基因。根據(jù)本發(fā)明方法可擴(kuò)增任何合適的基因部分，只要擴(kuò)增產(chǎn)物作為目的基因存在的 可靠指標(biāo)是可檢出的。特別地，容易檢出的擴(kuò)增產(chǎn)物為約50至250bp。甚至更優(yōu)選地，使用 為了擴(kuò)增甲基化或非甲基化目的基因的至少一個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)生約100至200bp或者50 至IOObp的擴(kuò)增產(chǎn)物。這對(duì)于組織樣品來(lái)說(shuō)是特別相關(guān)的，尤其是石蠟包埋的樣品，在其中 通常獲得的DNA質(zhì)量受限并且可能需要較小的擴(kuò)增子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可檢出的 擴(kuò)增產(chǎn)物包含至少SEQ ID NO. 2、4、5、7、8、11、13、14、16、17或19中任意的核苷酸序列。優(yōu) 選地，產(chǎn)生(約)100bp、110bp、115bp、120bp、125bp、126bp、130bp、135bp、140bp 或 142bp 的 擴(kuò)增產(chǎn)物。所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物，優(yōu)選兩個(gè)引物，設(shè)計(jì)成僅僅與用所述試劑處理后的 甲基化或非甲基化DNA序列結(jié)合。因此，根據(jù)所述方法的應(yīng)用，所述引物通過(guò)僅僅與基因的 甲基化形式(其在用所述試劑處理之后保持未修飾)或者基因的非甲基化形式(其被所述 試劑修飾)堿基配對(duì)來(lái)區(qū)分甲基化和非甲基化基因。所以，所述引物必須覆蓋目的基因中 至少一個(gè)甲基化位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述引物與包含至少1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)甲基化位點(diǎn)的 基因區(qū)域結(jié)合。最優(yōu)選地，所述引物設(shè)計(jì)為結(jié)合其中引物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)CpG對(duì)中所有胞嘧啶 殘基都是甲基化或非甲基化的序列，即“完全甲基化”或“完全非甲基化”序列。但是，如果 單個(gè)或幾個(gè)甲基化位點(diǎn)具有功能相關(guān)性，所述引物可設(shè)計(jì)成結(jié)合為了結(jié)合有效發(fā)生僅僅這 些殘基必須是甲基化(保持為胞嘧啶)或非甲基化(轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?的靶序列?？梢酝ㄟ^(guò) 合適的引物設(shè)計(jì)完全避免其它(無(wú)功能相關(guān)性)可能的甲基化位點(diǎn)，或者引物可設(shè)計(jì)成獨(dú) 立結(jié)合這些較少相關(guān)性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)(例如通過(guò)在引物序列中合適位置包含G和A殘 基的混合)。因此，僅僅當(dāng)甲基化或非甲基化形式的目的基因存在于原始含DNA樣品中時(shí)， 才預(yù)期出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。另外的或者作為替代的，對(duì)于所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物僅僅結(jié)合 用所述試劑處理后的非甲基化DNA序列，而另一個(gè)引物結(jié)合僅結(jié)合處理后的甲基化DNA，可能是合適的，例如當(dāng)基因包含甲基化的功能性重要位點(diǎn)以及分開的非甲基化功能性重要位 點(diǎn)時(shí)。優(yōu)選地，所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物是含有莖環(huán)或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的引物，所述結(jié)構(gòu) 帶有分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分。根據(jù)需要，此引物可以是或不是區(qū)分甲基化和非 甲基化DNA的引物。所述引物的設(shè)置使得在沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)，受體部分淬滅供體部分在激發(fā)后 發(fā)射的熒光。因此，在引物引導(dǎo)的擴(kuò)增之前或者沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)，所述莖環(huán)或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)保持 完好。供體部分發(fā)射的熒光被受體部分有效地接收，導(dǎo)致熒光淬滅。在擴(kuò)增期間，所述引物的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的構(gòu)型改變。特別的，一旦引物摻入擴(kuò)增 產(chǎn)物，以及特別地?fù)饺腚p鏈DNA (特別是在第二輪擴(kuò)增期間)，所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞。 此結(jié)構(gòu)上的變化使得供體和受體部分充分分離，受體部分不再能夠有效淬滅供體部分所發(fā) 射的熒光。因此，供體部分產(chǎn)生可檢出的熒光信號(hào)。對(duì)此信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)，以提供對(duì)甲基化或 非甲基化目的基因的基因拷貝數(shù)的指示。因此，本發(fā)明的方法可利用寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增核酸，所述寡核苷酸用分子能量轉(zhuǎn)移 (MET)標(biāo)簽可檢出地進(jìn)行標(biāo)記。所述引物包含MET對(duì)的供體和/或受體部分，其摻入擴(kuò)增反 應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中，使得所擴(kuò)增的產(chǎn)物含有MET對(duì)的供體和受體部分兩者。當(dāng)所擴(kuò)增的產(chǎn)物是雙鏈時(shí)，摻入擴(kuò)增產(chǎn)物的MET對(duì)可以在同一條鏈上或者當(dāng)擴(kuò)增 是三擴(kuò)增(triamplification)時(shí)在不同的鏈上。在用于擴(kuò)增的聚合酶具有5’ -3’核酸外 切酶活性的某些情況下，MET對(duì)部分之一可以被核酸外切酶活性從至少一些擴(kuò)增產(chǎn)物群體 中切下。此核酸外切酶活性對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增方法無(wú)害。如本文所述，本發(fā)明的方法可適于許多擴(kuò)增核酸序列的方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)、三擴(kuò)增及其它擴(kuò)增體系。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，MET是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中用供體和受體部 分對(duì)寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，其中所述供體部分是熒光團(tuán)，所述受體部分可以是熒光團(tuán)，使得供 體部分所發(fā)射的熒光能量被受體部分所吸收。所述受體部分可以是淬滅劑。因此，擴(kuò)增引 物是含有供體和受體部分的發(fā)夾引物，其設(shè)置使得所述受體部分淬滅所述供體的熒光。當(dāng) 所述引物摻入擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，其構(gòu)型變化，淬滅終止，可檢測(cè)到所述供體部分的熒光。本發(fā)明的方法允許檢測(cè)沒(méi)有預(yù)先分離非摻入寡核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，它們?cè)?許通過(guò)將帶標(biāo)記的寡核苷酸摻入到產(chǎn)物中直接檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還涉及確定參照基因的表達(dá)。參照基因?qū)?于允許不同樣品之間的比較來(lái)說(shuō)十分重要。通過(guò)選擇被認(rèn)為在所比較的樣品之間穩(wěn)定且可 靠表達(dá)的合適基因，檢測(cè)參照基因和目的基因的擴(kuò)增考慮了樣品中變異性，例如原料的量、 酶效率、樣品降解等等。在可靠的輸入DNA量存在下，參照基因理想地應(yīng)該為在所測(cè)試的 樣品之間表達(dá)不變的基因。因此，來(lái)自目的基因的結(jié)果可以針對(duì)相應(yīng)拷貝數(shù)的參照基因歸 一化。本發(fā)明的合適參照基因包括β-肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核糖體 RNA基因例如18S核糖體RNA和RNA聚合酶II基因(Radonic Α.等，Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 23 ；313 (4) :856_62)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述參照基因是 β-肌動(dòng)蛋白。因此，本發(fā)明方法的另外特征可以是使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增參照基因的至少一 部分，其中所述引物對(duì)中的至少一個(gè)引物是含有具有上述特征的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物。
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根據(jù)本發(fā)明方法可擴(kuò)增參照基因任何合適的部分，只要擴(kuò)增產(chǎn)物作為參照基因存 在的可靠指標(biāo)是可檢出的。特別地，容易檢出的擴(kuò)增產(chǎn)物為約50至250bp。甚至更優(yōu)選地， 使用為了擴(kuò)增參照基因的至少一個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)生約100至200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。這對(duì)于 組織樣品來(lái)說(shuō)是特別適當(dāng)?shù)?，由其石蠟包埋的樣品，在其中通常獲得的DNA質(zhì)量受限。在一些參照基因包括在本發(fā)明方法中的實(shí)施方式中，所述方法的特征還可以有， 包括針對(duì)甲基化或非甲基化目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)(實(shí)時(shí))檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量的方法步驟 還包括針對(duì)參照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)參照基因?qū)崟r(shí)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行定量，以產(chǎn)生每種情況的 基因拷貝數(shù)輸出，任選地還包括通過(guò)用甲基化或非甲基化目的基因的基因拷貝數(shù)除以參照 基因基因拷貝數(shù)來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化。另外，所述方法的特征是循環(huán)閾值小于40時(shí)擴(kuò)增被認(rèn)為是有效的。優(yōu)選地，對(duì)于 目的基因和參照基因都是如此。至少一部分參照基因的擴(kuò)增通常利用至少一個(gè)引物對(duì)。優(yōu)選地，與目的基因相同， 所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物是含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，所述結(jié)構(gòu)帶有分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和 受體部分。擴(kuò)增過(guò)程中這種結(jié)構(gòu)的作用方式已經(jīng)進(jìn)行了解釋。用于本發(fā)明方法的“發(fā)夾”引物最優(yōu)選如US6，090, 552和EP0912597所述，其內(nèi)容 以整體并入本文。這些引物是市售的Amplifluor 引物。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方 式中，用于擴(kuò)增目的基因和/或參照基因一部分的含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物包含5’至3’順序 的下列序列或者基本由其組成或者由其組成(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸 用選自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體部分和受體部分的第一部分標(biāo)記，其中所述供體部分在受激 發(fā)時(shí)發(fā)出一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)的熒光，所述受體部分吸收和/或淬滅所述供體部分發(fā)射的 所述熒光；(b)第二單鏈核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸、基本由其組成或者由其組 成；(c)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸、基本由其組成或由其組成，其中 所述第三核苷酸序列中的核苷酸用選自所述供體部分和所述受體部分的第二部分標(biāo)記，所 述第二部分是所述組中未用于標(biāo)記所述第一核苷酸序列的成員，其中所述第三核苷酸序列 反向互補(bǔ)于所述第一核苷酸序列，從而所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間可 形成雙鏈體使得所述第一部分和所述第二部分鄰近，從而當(dāng)供體部分受激發(fā)發(fā)射熒光時(shí)， 受體部分吸收并淬滅所述供體部分發(fā)射的所述熒光；以及(d)在引物的3’端，第四單鏈核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸、基本由其 組成或者由其組成，所述核苷酸在其3，端包含SEQ ID NO. 2、4、5、7、8、11、13、14、16、17、19 或25中的任意序列(因此能夠通過(guò)核酸聚合酶引發(fā)與包含所述基因的甲基化或非甲基化 DNA部分的核酸鏈互補(bǔ)的核苷酸序列的合成)；其中當(dāng)未形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分 和所述第二部分分開一定距離，該距離阻止所述第一和第二部分之間的分子能量轉(zhuǎn)移。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述供體部分和受體部分形成熒光能量共振轉(zhuǎn)移 (FRET)對(duì)。分子能量轉(zhuǎn)移(MET)是能量非放射性地在供體分子和受體分子之間轉(zhuǎn)移的過(guò) 程。熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)是MET的一種形式。FRET來(lái)自于某些化合物的性質(zhì)；當(dāng)暴 露于特定光波長(zhǎng)導(dǎo)致激發(fā)時(shí)，它們發(fā)出不同波長(zhǎng)的光(即它們發(fā)出熒光)。這些化合物被稱為熒光團(tuán)。在FRET中，能量非放射性地在作為熒光團(tuán)的供體分子與受體分子之間長(zhǎng)距 離傳遞(10-100埃)。供體吸收光子并將該能量非放射性地傳遞給受體(Fdrster, 1949， Z. Naturforsch. A4 :321_327 ；Clegg, 1992，Methods Enzymo 1. 211 :353_388)。當(dāng)激發(fā)和發(fā) 射光譜重疊的兩個(gè)熒光團(tuán)距離很近時(shí)，一個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)會(huì)導(dǎo)致其發(fā)光，該光的波長(zhǎng)被第 二熒光團(tuán)所吸收并激活其發(fā)出熒光。換句話說(shuō)，所述第一(供體)熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)能量通過(guò) 共振誘導(dǎo)偶極-偶極交互作用轉(zhuǎn)移至鄰近的第二(受體)熒光團(tuán)。因此，供體分子的半衰 期減少，其熒光淬滅，而受體分子的熒光強(qiáng)度增加并且去極化。當(dāng)供體的激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到 非熒光團(tuán)受體時(shí)，供體的熒光淬滅，而所述受體沒(méi)有隨后發(fā)射熒光。在該情況下，所述受體 起淬滅劑作用。淬滅劑和受體(acceptor)都可在本發(fā)明中應(yīng)用?？蓞⑴c熒光能量共振轉(zhuǎn) 移(FRET)的分子對(duì)稱為FRET對(duì)。為了發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，供體和受體分子必須通常非常接近 (至多 70 至 100 埃)(Clegg, 1992，MethodsEnzymol. 211 :353_388 ；Selvin, 1995，Methods Enzymol. 246:300-334)。能量轉(zhuǎn)移的效率隨著供體和受體分子距離的增加快速降低。根 據(jù)F0rster (1949，Ζ. Naturforsch. A4 =321-327)，能量轉(zhuǎn)移的效率與 DXlO"6 成正比，其中 D 是供體和受體之間的距離。事實(shí)上，這表示FRET最多在約70埃的距離上可最有效地發(fā)生。 常用于FRET的分子在獨(dú)立的章節(jié)中討論。熒光團(tuán)是供體還是受體根據(jù)其激發(fā)和發(fā)射光譜 進(jìn)行定義，其的熒光團(tuán)是成對(duì)的。例如，F(xiàn)AM被488nm波長(zhǎng)的光最有效地激發(fā)，發(fā)射光的光 譜為500至650nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。FAM是用于J0E、TAMRA和ROX的合適供體熒光 團(tuán)(所有這些均具有514nm的最大激發(fā))。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述供體部分是熒光素或其衍生物，所述受體部 分是DABCYL。優(yōu)選地，熒光素衍生物包含6-羧基熒光素，或基本由其組成，或由其組成。MET標(biāo)記可連接在所述引物的任何合適位點(diǎn)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述 供體和受體部分位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)核苷酸上，使得當(dāng)莖環(huán)完好時(shí)，所述部分彼此在物理 上非常接近。然而，本發(fā)明的引物可以用處于任意下述位置的部分來(lái)標(biāo)記，所述位置有效允 許一旦所述引物摻入擴(kuò)增產(chǎn)物在供體和受體沒(méi)有擴(kuò)增和分離的情況下各個(gè)供體和受體之 間發(fā)生MET/FRET。因?yàn)椴慌c靶基因結(jié)合，所以所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列不依賴于靶基因的核苷酸序 列(目的基因或參照基因)。因此，可以設(shè)計(jì)“通用”莖環(huán)或發(fā)夾序列，其隨后可與序列特 異性引物結(jié)合以便于目的基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)。主要的序列要求是所述序列形成莖環(huán)/發(fā)夾結(jié) 構(gòu)，其在沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)是穩(wěn)定的(因此確保有效淬滅)。因此，所述引物的序列特異性部分結(jié) 合模板鏈并引導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。因此，所述引物在第一輪擴(kuò)增中變成擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分。當(dāng) 互補(bǔ)鏈合成時(shí)，擴(kuò)增經(jīng)過(guò)莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)而發(fā)生。這使得熒光團(tuán)和淬滅劑分子分離，由此導(dǎo) 致熒光隨著擴(kuò)增的進(jìn)行而產(chǎn)生。莖環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選存在于擴(kuò)增所用引物的序列特異性部分的5’端。如上所述，此檢測(cè)序列一般用FRET對(duì)標(biāo)記。優(yōu)選地，F(xiàn)RET中的一個(gè)部分朝向、接 近或處于所述序列的5’端，另一部分朝向、接近或處于所述序列的3’端，使得當(dāng)莖環(huán)或發(fā) 夾結(jié)構(gòu)保持完好時(shí)，兩個(gè)部分之間的FRET有效。如實(shí)驗(yàn)章節(jié)詳細(xì)描述的，引物必須仔細(xì)選擇，以確保本發(fā)明方法的靈敏度和特異 性。因此，用于檢測(cè)所述基因甲基化狀態(tài)的特別優(yōu)選的引物包括包含如下所示核苷酸序列 或基本由其組成或由其組成的引物
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5，_-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCU-3，(SEQ ID NO. 1)
5，_-ATTTTTGTTTGGAATTTAGGGTAG-3‘ (SEQ ID NO. 2)
和/'或，
5，--AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCCAACATCAAACCATCACTCA-3，(SEQ ID N0. 3)
和/'或，
5，--CCAACATCAAACCATCACTCA-3，(SEQ ID NO. 4)
和/'或，
5，--TGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3，(SEQ ID NO. 5)
和/'或，
5，--AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3，(SEQ ID NO. 6)
和/'或，
5，--CCCTCCACCAACATCAAA-3，(SEQ ID NO. 7)
和/'或，
5，--TTAGGATGTGATGTTATTGATTTGT-3‘ (SEQ ID NO. 8)
和/'或，
5，--AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTTAGGATGTGATGTTATTGATTTGT-3’ (SEQ ID NO.9)
和/'或，
5，--TGTTTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3’ (SEQ ID NO. 11)
和/'或，
5，--AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGTTTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3’ (SEQ ID NO.12)
和/'或，
5，--CCATCACTCATTACTCAAAACAAA-3’ (SEQ ID NO. 13)
和/'或，
5，--ATTTTTGTTCGGAATTTAGGGTAG-3’ (SEQ ID NO. 14)
和/'或，
5，--AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCCGACGTCAAACCGTCGCTCG-3，(SEQ ID NO. 15)
和/'或，
5，--CCGACGTCAAACCGTCGCTCG-3’ (SEQ ID NO. 16)
和/'或，
5，--CGGAATTTAGGGTAGTATCGT-3’ (SEQ ID NO. 17)
和/'或，
5，--AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUCCCTCCGCCGACGTCAAA-3’(SEQ ID NO. 18)
和/'或，
5，--CCCTCCGCCGACGTCAAA-3，(SEQ ID NO. 19)
SEQID NO 1表示發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列。
SEQID NO 2、5、8或11表示正向引物序列，其與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的Mage啟動(dòng)子非甲基化序列互補(bǔ)
SEQID NO 1表示發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列
SEQID NO 6、9和12包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及分別包含SEQ ID NO. 5、8和11的序列。SEQ ID NO. 4、7和13表示反向引物序列，其與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的Mage啟動(dòng)子非甲 基化序列互補(bǔ)。SEQ ID NO 3包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及SEQ ID NO. 4的序列。SEQ ID NO 14和17表示正向引物序列，其與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的Mage啟動(dòng)子甲基 化序列互補(bǔ)SEQ ID NO. 16和19表示反向引物序列，其與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的Mage啟動(dòng)子甲基 化序列互補(bǔ)。SEQ ID NO 15和18包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及分別包含SEQ ID NO. 16和19的序列。如實(shí)驗(yàn)章節(jié)中詳細(xì)所述，MAGE-A3的表達(dá)和甲基化水平在包含SEQ IDN0. 2、5或 11的測(cè)定中顯示出最佳一致性，所有三個(gè)引物包含序列5’ TGGAATTTAGGGTAG 3’ (SEQ ID NO. 25)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合MAGE-A3的啟動(dòng)子區(qū)的優(yōu)選引物包含SEQ ID N0. 25。所述引物與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的MAGE-A3序列互補(bǔ)的部分優(yōu)選小于25bp ；優(yōu)選23、22、 21、20或19bp長(zhǎng)。因此，此優(yōu)選引物的Mage-A3特異性部分優(yōu)選地為24至18bp，或者23至 19bp長(zhǎng)。優(yōu)選，長(zhǎng)19bp。因此，所述引物可包含序列5‘-ATTTTTGTTTGGAATTTAGGGTAGTATTG T-3，(SEQ ID N0. 26)的23、22、21、20或19個(gè)連續(xù)堿基的任意序列。所述引物的Mage_A3 特異性部分最優(yōu)選由SEQ ID NO. 2、4、5或7所示核苷酸序列組成。包含SEQ ID N0. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12或13中任意核苷酸序列或基本由其組 成或由其組成的引物對(duì)檢測(cè)低甲基化(非甲基化)MAGE-A3基因特別有用。優(yōu)選的引物具 有SEQ ID NO. 2、3、4、5、6或7的核苷酸序列。包含SEQ ID N0. 14、15、16、17、18或19中任意核苷酸序列或基本由其組成或由其 組成的引物對(duì)檢測(cè)高甲基化(甲基化)MAGE-A3基因特別有用。優(yōu)選用于本發(fā)明方法/試劑盒和測(cè)定的引物對(duì)包含至少一個(gè)下述引物，即該引物 包含 SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 25 中任意核苷酸序列 或基本由其組成或由其組成。優(yōu)選地引物對(duì)包含以下的任意核苷酸序列或基本由其組成或 由其組成:SEQ ID NO. 2 禾口 3 ； SEQ ID N0. 6 禾口 7 ； SEQ ID N0. 9 禾口 4 ；SEQ ID N0. 12 和 13 ； SEQ ID N0. 14和15 ；或SEQ ID N0. 17和18。最優(yōu)選的引物對(duì)包含SEQ ID N0. 6和7的核苷酸 序列，或基本由其組成，或由其組成。所述引物之一或兩者可以用合適莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)標(biāo)記或者合成為包含合適的莖 環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)帶有供體和受體部分，優(yōu)選在5’端，如上文詳細(xì)所述。在一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方式中，所述引物之一或兩者可以，優(yōu)選在5’端，用莖環(huán)結(jié)構(gòu)標(biāo)記或者合成為包含莖環(huán) 結(jié)構(gòu)，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含下述核苷酸序列或基本由其組成或由其組成5，-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCU-3，(SEQ ID NO :1)。此檢測(cè)序列一般用FRET對(duì)標(biāo)記。優(yōu)選地，F(xiàn)RET中的一個(gè)部分朝向、接近或處于所 述序列的5’端，另一部分朝向、接近或處于所述序列的3’端，使得當(dāng)莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)保持 完好時(shí)，兩個(gè)部分之間的FRET有效。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 由其是包含SEQ ID NO :1所示序列或基本由其組成或由其組成的核酸，在5’端用FAM標(biāo)記 在3’端用DABCYL標(biāo)記。其它優(yōu)選的組合在本文中有討論，這些討論可經(jīng)必要的修改加以 應(yīng)用。
這些引物形成本發(fā)明的不同方面。這些引物的其它特征在下文詳細(xì)說(shuō)明中(實(shí)驗(yàn) 部分)有總結(jié)。應(yīng)注意這些序列的變體可用于本發(fā)明。特別的，可根據(jù)需要添加其它側(cè)翼 序列，例如用以改善結(jié)合特異性或者莖環(huán)的形成。變體序列優(yōu)選地與SEQ ID N0:1至9和 11至19或25所示引物和/或探針的核苷酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者至少99%的核苷酸序 列同一性。所述引物和發(fā)夾結(jié)構(gòu)可根據(jù)需要摻入合成核苷酸類似物，或者可以是基于DNA、 RNA或PNA的，或其混合物。類似地，根據(jù)需要可利用作為替代的熒光供體和受體部分/FRET 對(duì)。除了用熒光供體和受體部分標(biāo)記之外，所述引物可包含經(jīng)修飾的寡核苷酸以及其它附 加基團(tuán)和標(biāo)記，只要不損害作為本發(fā)明方法中引物和/或莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)的功能。對(duì)每個(gè)引物對(duì)來(lái)說(shuō)，至少一個(gè)引物用分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分標(biāo)記，其 設(shè)置使得在不擴(kuò)增時(shí)，所述受體部分淬滅由所述供體部分發(fā)射的熒光(激發(fā)后)，以及在擴(kuò) 增過(guò)程中，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)破壞使得所述供體和受體部分分開到足以產(chǎn)生可檢出熒光信號(hào)， 對(duì)其實(shí)時(shí)檢測(cè)以提供所述基因的基因拷貝數(shù)指示。優(yōu)選地，所述供體部分和所述受體部分 是FRET對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述供體部分和所述受體部分選自5_羧基熒光素或6-羧 基熒光素(FAM)、2’，7’_ 二甲氧基-4’，5’_ 二氯-6-羧基熒光素(JOE)、羅丹明、6-羧基羅 丹明(R6G)、N，N，N’_四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5_(2’_氨 基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、鄰氨基苯甲酰胺、香豆素、鋱螯合衍生物、孔雀綠、活性 紅4、DABCYL、四甲基羅丹明、芘丁酸酯、曙紅硝基酪氨酸、乙錠和得克薩斯紅。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，所述供體部分選自熒光素、5-羧基熒光素或6-羧基熒光素(FAM)、5-(2’-氨基 乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、鄰氨基苯甲酰胺、香豆素、鋱螯合衍生物、孔雀綠和活性紅 4，所述受體部分選自DABCYL、四甲基羅丹明、芘丁酸酯、曙紅硝基酪氨酸、乙錠和得克薩斯 紅。優(yōu)選地，所述供體部分是熒光素或其衍生物，所述受體部分是DABCYL，最優(yōu)選地所述供 體部分是6-羧基熒光素。本文討論了其它優(yōu)選的組合，特別是在多重性背景中，本發(fā)明這 些方法也設(shè)想了這些組合。本發(fā)明還提供了可用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。所述試劑盒可包含有關(guān)本文 所述本發(fā)明多種方法(和用途)提及的任何優(yōu)選特征。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA樣 品中甲基化或非甲基化目的基因存在和/或數(shù)量的試劑盒，其包含本發(fā)明的至少一個(gè)引物 對(duì)。優(yōu)選地，所述試劑盒包含本發(fā)明用于檢測(cè)非甲基化和/或甲基化MAGE-A3基因的存在 和/或數(shù)量的引物對(duì)，以及用于檢測(cè)參照基因特別是β “肌動(dòng)蛋白的存在和/或數(shù)量的引 物對(duì)。因此，所述試劑盒可包含引物對(duì)，所述引物對(duì)包含引物，所述引物包含SEQ ID NO 2、 3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19或25所示核苷酸序列或基本由其組成或由 其組成。優(yōu)選地，每個(gè)引物對(duì)中至少一個(gè)引物由合適的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)標(biāo)記，以便于實(shí)時(shí)檢 測(cè)，如上所討論的(這些討論可經(jīng)必要的修改加以應(yīng)用)。最優(yōu)選地，每個(gè)引物對(duì)中至少一 個(gè)引物摻入了莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或基本由其 組成或由其組成。所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)由合適的供體和受體部分所標(biāo)記，如本文所討論的(這些 討論可經(jīng)必要的修改加以應(yīng)用)。如上所述，這些引物的其它特征在下文詳細(xì)說(shuō)明中(實(shí)驗(yàn)部分)有總結(jié)。如本文 所述，應(yīng)注意這些序列的變體可用于本發(fā)明。如本文所述，根據(jù)需要可利用作為替代的熒光 供體和受體部分/FRET對(duì)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，如本文所述，本發(fā)明的試劑盒還包含修飾非甲基化胞嘧啶的 試劑(優(yōu)先于被保護(hù)的甲基化胞嘧啶殘基)。這些試劑可用于區(qū)分甲基化和非甲基化的胞 嘧啶殘基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑包含亞硫酸氫鹽，優(yōu)選亞硫酸氫鈉。該試劑能 夠?qū)⒎羌谆奏埢D(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶保持不變。殘基的這一差異可 用于在下游過(guò)程中區(qū)分甲基化和非甲基化核酸，例如使用區(qū)分胞嘧啶和尿嘧啶(胞嘧啶與 鳥嘌呤配對(duì)，而尿嘧啶與腺嘌呤配對(duì))的引物的PCR。如針對(duì)本發(fā)明的方法所討論的，可利用合適的對(duì)照來(lái)作為該方法的質(zhì)量控制。因 此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒還包含甲基化狀態(tài)已知的一種或多種對(duì)照核酸分 子、基本上由其組成或者由其組成。這些(一種或多種)對(duì)照核酸分子可包含已知為或者 經(jīng)處理使得為甲基化的核酸和/或已知為或者經(jīng)處理使得為非甲基化的核酸。合適內(nèi)參基 因的一個(gè)例子是肌動(dòng)蛋白，其通常是非甲基化的，但可以經(jīng)處理使得為甲基化。本發(fā)明的試劑盒另外可包含合適的緩沖液和其它進(jìn)行本發(fā)明權(quán)利要求方法的試 劑。因此，所提供的有關(guān)本發(fā)明方法的討論在這里可經(jīng)必要的修改加以應(yīng)用，出于簡(jiǎn)潔起見 不再重復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒還包含核酸擴(kuò)增緩沖液、基本上由其組成或 者由其組成。所述試劑盒還可另外包含催化核酸擴(kuò)增的酶、基本由其組成或由其組成。因此，所 述試劑盒還可另外包含用于核酸擴(kuò)增的合適的聚合酶、基本由其組成或由其組成。實(shí)例包 括A類和B類聚合酶，例如Taq、Pfu, Vent等。根據(jù)需要，所述試劑盒的多種成分可分開包裝在獨(dú)立的區(qū)室中，或者可以例如共 同保存。所述試劑盒還可加入合適的使用說(shuō)明，例如，其可打印在獨(dú)立的紙張上或者并入 試劑盒的包裝中。該說(shuō)明可便于本發(fā)明試劑盒用于合適的實(shí)時(shí)擴(kuò)增裝置，這些裝置很多是 市售的。本發(fā)明實(shí)時(shí)方法的最后一步包括對(duì)實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比甲基化或非甲基化目的基 因以及任選的參照基因(如果包含的話)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量?？墒褂靡唤M標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生 標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)需要，每種標(biāo)準(zhǔn)品包含已知拷貝數(shù)或濃度的目的基因和/或參照基因。 通常，熒光的基準(zhǔn)值設(shè)置于表示背景熒光。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，利用序列檢測(cè)系統(tǒng) (Sequence Detection System, SDS)軟件。在檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物之前，此軟件設(shè)置了 3至15個(gè) 擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)的默認(rèn)基線范圍。然后，將熒光閾值定義為此基線之上的統(tǒng)計(jì)上顯著的值。通 常，所述閾值設(shè)置為基線熒光之上10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。隨裝置提供了合適的軟件來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增 反應(yīng)。該軟件自動(dòng)計(jì)算反應(yīng)的基線和閾值。然后，可以針對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品確定循環(huán)閾值(Ct)。 這是實(shí)現(xiàn)閾值擴(kuò)增水平所需要的循環(huán)數(shù)。因此，反應(yīng)混合物中基因標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度越高， 實(shí)現(xiàn)特定擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量所需的循環(huán)數(shù)就越少。Ct相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品DNA組的已知初始拷貝數(shù) 的Iogltl作圖產(chǎn)生一條直線。這是標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，在使用時(shí)，擴(kuò)增目的基因和參照基因的 Ct值可各自內(nèi)插到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定含DNA樣品的拷貝數(shù)。因此，所述方法的輸出 是目的基因和參照基因各自的基因拷貝數(shù)。結(jié)果可以通過(guò)用甲基化或非甲基化目的基因的 基因拷貝數(shù)除以參照基因的基因拷貝數(shù)來(lái)歸一化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的方法。優(yōu)選地，使用SDS軟件，優(yōu)選 地包括合適算法，例如Auto CT算法以自動(dòng)產(chǎn)生各個(gè)檢測(cè)的基線和閾值。
雖然本發(fā)明的方法可用于任何合適的擴(kuò)增方法，但是最優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。因此，盡管PCR是優(yōu)選的擴(kuò)增方法，為包含基本技術(shù)的變體例如巢式PCR， 等同形式也可包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)例包括但不限于，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)例如NASBA、3SR、 TMA和三擴(kuò)增，其所有均為本領(lǐng)域公知的，合適試劑是市售的。其它合適的擴(kuò)增方法包括 但不限于，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR) (Barringer等，1990)、MLPA、靶標(biāo)多核苷酸序列選擇性擴(kuò) 增(美國(guó)專利No. 6410276)、共有序列引發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(美國(guó)專利No. 4437975)、侵 入技術(shù)(Third Wave Technologies, Madison, WI)、鏈替換技術(shù)、隨意引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (W090/06995)以及缺口替換擴(kuò)增(W02004/067726)。本發(fā)明的實(shí)時(shí)PCR方法一般包括下列步驟降低溫度以允許引物退火、升高溫度 進(jìn)行引物延伸、升高溫度進(jìn)行變性以及降低溫度以收集數(shù)據(jù)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述 數(shù)據(jù)收集步驟在約60攝氏度和64攝氏度之間的溫度下進(jìn)行，最優(yōu)選在約62攝氏度，因?yàn)?其已顯示產(chǎn)生最大的靈敏度和最特異性的結(jié)果，如實(shí)施例章節(jié)所討論的。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的溫度特征包括40至50個(gè)重復(fù)，優(yōu)選地 大約45個(gè)重復(fù)的循環(huán)(a)約 50°C，約 2 分鐘(b)約 95°C，約 10 分鐘(c)約 ％°C，約 I5 秒(d)約 62°C，約 1 分鐘本發(fā)明方法中所示的產(chǎn)生特異性且靈敏性結(jié)果的優(yōu)選反應(yīng)流程為，第1階段 50°C, 2 分鐘，第 2 階段95°C，10 分鐘，第 3 階段95°C，15 秒，59°C，30 秒，59°C，30 秒(= 平臺(tái)數(shù)據(jù)收集)，45個(gè)重復(fù)。本發(fā)明的方法有可能用于在同一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多于一個(gè)目的基因。通過(guò)使用數(shù)個(gè) 特異性引物組，可以在相同反應(yīng)混合物中進(jìn)行數(shù)個(gè)核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增。這可以被稱為“多重”。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，每個(gè)靶標(biāo)的一個(gè)或兩個(gè)引物可以是發(fā)夾引物，其由形成FRET對(duì)的 熒光部分和淬滅部分標(biāo)記。數(shù)個(gè)核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增要求使用具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的不同熒光供 體和/或受體部分標(biāo)記每個(gè)引物組。在擴(kuò)增后的檢測(cè)和分析過(guò)程中，照射反應(yīng)混合物并在 反應(yīng)中所用每個(gè)引物組的每個(gè)特定的特征性波長(zhǎng)處進(jìn)行讀取。因此，可確定混合物中哪個(gè) 具體靶標(biāo)DNA被擴(kuò)增和標(biāo)記。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，使用兩個(gè)或更多用于擴(kuò)增不同靶序 列的引物對(duì)。因此，可以在單個(gè)含DNA樣品中檢測(cè)一組甲基化/非甲基化目的基因的存在 和/或數(shù)量。多重也可用于在同一反應(yīng)中檢測(cè)目的基因和參照基因的背景下使用。用合適的可 區(qū)分供體和/或受體部分標(biāo)記的引物允許通過(guò)目的基因和參照基因的分別擴(kuò)增產(chǎn)生信號(hào)， 以進(jìn)行區(qū)分。在一個(gè)實(shí)施方式中，通用淬滅劑與各自具有可區(qū)分的最大發(fā)射波長(zhǎng)的(多個(gè))合 適熒光團(tuán)供體一起使用。特別優(yōu)選的淬滅劑是DABCYL?？梢耘c作為淬滅劑的DABCYL — 起使用下列熒光團(tuán)來(lái)允許多重檢測(cè)香豆素(最大發(fā)射475nm)、EDANS(491nm)、熒光素 (515nm)、螢光黃(523nm)、BODIPY (525nm)，曙紅(543nm)、四甲基羅丹明(575nm)和德克薩 斯紅(615nm) (Tyagi 等·，Nature Biotechnology, Vol. 16，Jan 1998 ；49-53)。其它優(yōu)選的 組合在本文中有討論。
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在一個(gè)替代性實(shí)施方式中，含DNA樣品可以分開，本發(fā)明方法對(duì)適宜部分的樣品 實(shí)施以獲得可直接比較的結(jié)果。因此，當(dāng)檢測(cè)目的基因和參照基因時(shí)，樣品可以分為兩部 分，從而允許在一部分樣品中實(shí)時(shí)檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增，在另一部分樣品中實(shí)時(shí)檢測(cè)參照 基因的擴(kuò)增。根據(jù)需要，將樣品分開，從而允許進(jìn)行合適的對(duì)照反應(yīng)。此方案的益處在于通 用FRET對(duì)可用于標(biāo)記每個(gè)引物對(duì)，并消除檢測(cè)一個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射的必要性。但是，此 方法依賴于初始時(shí)獲得合適樣品，從而允許將樣品分開。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，雖然可利 用任何合適的反應(yīng)體積，擴(kuò)增步驟的總反應(yīng)體積為約10至40微升，更優(yōu)選約10至30微升， 最優(yōu)選約12微升。在一個(gè)方面，本發(fā)明的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法用于診斷癌 癥或癌癥傾向性，其中樣品中存在非甲基化(或低甲基化)MAGE-A3指示癌癥或癌癥傾向 性。因此，本發(fā)明提供了用于診斷癌癥或癌癥傾向性的試劑盒、方法和引物。“診斷”在本文中的定義包括篩選疾病或疾病前期，鑒定疾病或疾病前期，監(jiān)測(cè)疾 病的分級(jí)和狀態(tài)及進(jìn)展，檢查治療后疾病的復(fù)發(fā)以及監(jiān)測(cè)特定治療的成功。此檢測(cè)還可具 有預(yù)測(cè)值，其包含在術(shù)語(yǔ)“診斷”的定義中。此測(cè)試的預(yù)測(cè)值可用作對(duì)癌癥潛在敏感性的標(biāo) 志物，或者作為癌癥進(jìn)展的標(biāo)志物。因此，可在疾病有機(jī)會(huì)以可在患者中鑒定出的癥狀的形 式展現(xiàn)出來(lái)之前鑒定具有風(fēng)險(xiǎn)的患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，癌癥選自肺癌、黑素瘤或膀 胱癌。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用于診斷的方法和測(cè)定使用至少一個(gè)寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 25 中任意核苷酸序列，或基本 由其組成，或由其組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，癌癥或癌癥傾向性的診斷使用寡核苷酸， 其包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13或25中任意核苷酸序列，或基本由其組成， 或由其組成，并檢測(cè)所述基因的非甲基化形式。在一個(gè)替代實(shí)施方式中，用于診斷的方法和 測(cè)定使用至少一個(gè)寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 14、16、17或19中任意核苷酸序列，或基本 由其組成，或由其組成。測(cè)試可以診斷性地實(shí)施或與治療方案一起實(shí)施。如上所述，已經(jīng)描述了確定NSCLC 中MAGE-A3預(yù)測(cè)值的RT-PCR測(cè)定。這些測(cè)定可用于選擇適于用MAGE-A3免疫療法進(jìn)行治 療的患者。本發(fā)明人顯示了，設(shè)計(jì)用于利用本發(fā)明的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)或試劑 盒檢測(cè)非甲基化MAGE-A3的測(cè)定可以可靠地針對(duì)MAGE-A3表達(dá)對(duì)樣品進(jìn)行分類。使用甲基 化測(cè)試獲得的甲基化狀態(tài)結(jié)果與現(xiàn)有針對(duì)RNA樣品使用的用于MAGE-A3檢測(cè)的RT-PCR測(cè) 試所得結(jié)果一致性良好。因此，所述甲基化測(cè)試具有臨床用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)在對(duì)象中癌癥成功治療可能性的方法，包括(a)用試劑接觸/處理獲得自對(duì)象的含DNA測(cè)試樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中 的非甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基，但所述試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘
基(b)使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分非甲基化MAGE-A3基因，所述引物對(duì)中 的至少一個(gè)引物設(shè)計(jì)成僅分別結(jié)合用所述試劑處理之后的非甲基化DNA序列，其中所述引 物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含SEQ ID NO. 2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13或25中任意的核苷酸 序列，或基本由其組成，或由其組成(c)確定MAG3-A3基因的甲基化狀態(tài)；其中，樣品中非甲基化MAGE-A3的存在指示使用MAGE-A3免疫療法的成功治療可能性高于檢測(cè)到無(wú)或低水平非甲基化MAGE-A3基因的情況。步驟(c)包括鑒定是否形成擴(kuò)增產(chǎn)物。所述擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定(使用本文所述的任 何合適技術(shù))指示樣品中非甲基化或低甲基化MAGEA3的存在。當(dāng)然，相反的情況也適用，因此本發(fā)明的方法可類似地使用以確定是否可能 對(duì)MAGEA3免疫治療劑有抗性或者使用其治療不成功，樣品中不存在非甲基化MAGE-A3 指示有可能對(duì)治療有抗性和/或治療可能不成功。在某些實(shí)施方式中，也可在互補(bǔ) (complementary)方法中使用甲基化DNA的特異性引物。本發(fā)明的方法還可用于為患者選擇合適的治療過(guò)程，存在非甲基化MAGE-A3指示 MAGE-A3免疫治療劑可有利地施用，而不存在或低水平的非甲基化MAGE-A3指示免疫治療 劑是相反指示的(contra-indicated)。所提供的有關(guān)本發(fā)明寡核苷酸、引物或探針、引物 對(duì)、試劑盒或方法的討論加以必要的修改適用于本方面，因此根據(jù)需要，本發(fā)明的本方面設(shè) 想了所有實(shí)施方式。“成功治療的可能性”指使用所列治療劑中的任一種或多種治療癌癥成功的可能 性，優(yōu)選MAGE-A3免疫治療劑或者包含MAGE-A3的組合物。“抗性”定義為使用任一種特定免疫治療劑成功治療癌癥的概率降低和/或?qū)崿F(xiàn)治 療效果需要更高的劑量。MageA3的低甲基化可能與某些癌癥類型相關(guān)聯(lián)。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本 發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中膀胱癌、肺癌包括NSCLC或黑素瘤傾向或發(fā)生的方法，其包括使用 本發(fā)明的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)， 其中樣品中檢測(cè)到非甲基化MAGE-A3指示癌癥(特別是黑素瘤)、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC))、或膀胱癌(包括移行細(xì)胞癌)的傾向或發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述腫瘤或 癌癥選自乳腺癌；頭頸癌包括食道癌；鱗狀細(xì)胞癌；精原細(xì)胞瘤；肝癌；多發(fā)性骨髓瘤和結(jié) 腸癌。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定MAGE-A3陽(yáng)性腫瘤存在的方法，其包括使用本 文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中MAGE-A3基因的甲基化 狀態(tài)，其中非甲基化MAGE-A3的存在指示MAGE-A3陽(yáng)性腫瘤的存在。測(cè)試可以診斷性地實(shí)施或者與治療方案一起實(shí)施。已經(jīng)開發(fā)了 MAGE-A3特異性免 疫療法(ASCI)，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的評(píng)價(jià)。測(cè)試還可用于確定什么樣的治療或預(yù)防方 案用于患者，并且可用于監(jiān)測(cè)治療方案的效果。因此，本發(fā)明還提供了鑒定和/或選擇適于使用MAGE-A3免疫療法治療的患者的 方法，其包括使用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)MAGE-A3基 因的甲基化狀態(tài)，其中如果MAGE-A3基因是非甲基化的，則所述對(duì)象鑒定為和/或選擇進(jìn)行 使用MAGE-A3免疫療法的治療?；蛘?，如果所述基因不是非甲基化的，則優(yōu)選地不選擇所述對(duì)象進(jìn)行使用MAGE-A3 免疫療法的治療。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)成功治療癌癥可能性的方法，其包括使用本 文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中MAGE-A3基因的甲 基化狀態(tài)，其中如果所述基因是非甲基化的，則使用MAGE-A3免疫療法成功治療的可能性 高于所述基因?yàn)榧谆那闆r。
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換句話說(shuō)，樣品中不存在非甲基化MAGE-A3指示對(duì)使用MAGE-A3免疫療法有抗性 的可能性高于所述基因是非甲基化的情況。因此，檢測(cè)到甲基化MAGE-A3基因(或者未檢 測(cè)到低甲基化基因)指示使用免疫療法成功治療的概率較低。 因此，根據(jù)關(guān)于MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，可選擇患者群體進(jìn)行治療。這導(dǎo)致了 更加集中且個(gè)人化的醫(yī)學(xué)形式，由此使得成功率提高，這是因?yàn)閷⑹褂米钣锌赡苡行У乃?物對(duì)患者進(jìn)行治療。在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供了選擇合適的癌癥治療方案的方法，其包括使 用本文所述食物療法因?yàn)楣押塑账?、引物或探針、引物?duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中 MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是非甲基化的，則選擇免疫療法(特別是 MAGE免疫療法)進(jìn)行治療?；蛘?，如果所述基因不是非甲基化的，則不指示使用免疫療法進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供了治療對(duì)象中的癌癥的方法，其包括施用免疫療法，其中已基于根 據(jù)本發(fā)明的任何方法或通過(guò)使用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法對(duì) MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的測(cè)定選擇所述對(duì)象進(jìn)行治療。優(yōu)選地，對(duì)于本文所述的所有不同 方面，非甲基化MAGE-A3基因的檢測(cè)對(duì)應(yīng)于MAGE-A3蛋白水平的增加?？捎糜诒景l(fā)明的MAGE-A3免疫療法包括基于MAGE-A3的組合物。包含MAGE-A3 的組合物的實(shí)例包括包含全長(zhǎng)MAGE-A3、基本上全長(zhǎng)MAGE-A3以及MAGE-A3片段(例如 MAGE-A3肽)的組合物?？捎糜诒景l(fā)明的肽的實(shí)例包括下列MAGE-A3肽 所述MAGE蛋白可以是全長(zhǎng)MAGE-A3，或者可包含基本上全長(zhǎng)的MAGE3片段，例如 MAGE3的3-314位氨基酸(總長(zhǎng)312個(gè)氨基酸)，或者其它MAGE-A3片段，其中MAGE-A3蛋 白的N末端和/或C末端缺失1至10個(gè)氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述MAGE-A3蛋白、片段或肽可與融合伴侶蛋白相連。MAGE-A3蛋白、片段或肽與融合伴侶蛋白可以是化學(xué)綴合的，或者可以作為重組融 合蛋白表達(dá)。在所述抗原和伴侶以重組融合蛋白的形式表達(dá)的實(shí)施方式中，可允許在表達(dá) 體系中產(chǎn)生比非融合蛋白更高的水平。因此，所述融合伴侶蛋白可參與提供T輔助表位(免 疫融合伴侶蛋白)，優(yōu)選地人識(shí)別的T輔助表位，和/或參與以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量表 達(dá)所述蛋白(表達(dá)增強(qiáng)子蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述融合伴侶可以既是免疫融合伴侶 蛋白又是表達(dá)增強(qiáng)伴侶蛋白。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可使用的免疫融合伴侶蛋白來(lái)源于蛋白D，一種革蘭 氏陰性細(xì)菌即B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(W091/18926)， 或其衍生物。所述蛋白D衍生物可包含所述蛋白的前三分之一，或者約所述蛋白的前三分 之一。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白D的N-端前109個(gè)殘基可用作融合伴侶，從而為MAGE-A3 抗原提供額外的外源T細(xì)胞表位并增加在大腸桿菌中的表達(dá)水平(因此也用作表達(dá)增強(qiáng) 子)。在一個(gè)替代性實(shí)施方式中，蛋白D衍生物可包含N端前100-110個(gè)氨基酸或者N端 約前100-110個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白D或其衍生物可以是脂質(zhì)化的，可使 用脂蛋白D 脂類尾可保證將所述抗原最佳地呈遞到抗原呈遞細(xì)胞。在一個(gè)替代性實(shí)施方 式中，所述蛋白D或其衍生物不是脂質(zhì)化的。蛋白D的“分泌序列”或“信號(hào)序列”指天然 蛋白的約1至16、17、18或19位氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白D的分泌或信號(hào)序列指 蛋白D的N端19個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，在蛋白D融合伴侶的N端包含分泌或信號(hào) 序列。如本文所用的，“前三分之一(1/3)”、“前109個(gè)氨基酸”和“N-端前100-110個(gè)氨基 酸”指蛋白D序列緊跟分泌或信號(hào)序列的氨基酸。所述信號(hào)序列的2-K和3-L氨基酸可任 選地由氨基酸2-M和3-D取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，MAGE-A3可以是蛋白D-MAGE-A3_His，432個(gè)氨基酸殘基的融 合蛋白。此融合蛋白包含蛋白D的信號(hào)序列，蛋白D的1至109位氨基酸、MAGE-A3蛋白的 312個(gè)氨基酸(3-314位氨基酸)、間隔子以及可便于生產(chǎn)過(guò)程中純化該融合蛋白的多組氨 酸尾(His)，例如i)蛋白D的18殘基信號(hào)序列以及N端前109個(gè)殘基；ii)兩個(gè)非相關(guān)的殘基(蛋氨酸和天冬氨酸)；iii)天然MAGE-3蛋白的3-314位殘基；iv)用作絞鏈區(qū)的兩個(gè)甘氨酸殘基；以及ν)七個(gè)組氨酸殘基。此分子的氨基酸序列顯示于圖10 (SEQ ID NO :40)。該抗原及下文所總結(jié)的那些 更詳細(xì)地描述于W099/40188中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫融合伴侶蛋白可以是稱為L(zhǎng)ytA的蛋白或其衍生 的蛋白。LytA來(lái)源于肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)，其合成N-乙?；?L-丙 氨酸酰胺酶，即酰胺酶LytA,(由LytA基因編碼(Gene, 43 (1986) 265-272頁(yè)))，其是一種 特異性降解肽聚糖骨架中某些鍵的自溶素。LytA蛋白的C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與膽堿或者一些 膽堿類似物例如DEAE的親和性。已經(jīng)對(duì)此性能有所研究，開發(fā)出大腸桿菌-LytA表達(dá)質(zhì) 粒，其可用于表達(dá)融合蛋白。在其氨基端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已經(jīng)有描述 (Biotechnology 10, (1992)795-798)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用所述分子的C端部分?？墒褂闷鹗加?78位殘基的在C端發(fā)現(xiàn)的LytA分子的重復(fù)部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，LytA 部分可包括188-305位殘基。其它融合伴侶包括來(lái)自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NSl (紅細(xì)胞凝集素)。在一個(gè)實(shí)施 方式中，可利用NS 1的N端81個(gè)氨基酸，盡管可使用不同的片段，只要它們包含T輔助表 位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，MAGE-A3蛋白可包含衍生化的游離巰基。這樣的抗 原已描述于W099/40188。特別地，可使用羧基酰胺化或羧基甲基化衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，MAGE-A3組合物包含編碼本文所述MAGE-A3蛋白、片段或肽 或融合蛋白的核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述序列可插入到合適的表達(dá)載體 中，可用于DNA/RNA疫苗。表達(dá)所述核酸的微生物載體也可用作載體遞送的免疫治療劑。合適病毒載體的例子包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病 毒包括單純皰疹病毒、α病毒、痘病毒例如金絲雀痘病毒和牛痘病毒的體系。使用這些病 毒的基因轉(zhuǎn)移方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)將本發(fā)明的 多核苷酸穩(wěn)定整合宿主基因組中，盡管不優(yōu)選這樣的重組。相反地，復(fù)制缺陷腺病毒載體保 持為附加體形式，因此允許瞬時(shí)表達(dá)。能夠在昆蟲細(xì)胞(例如桿狀病毒載體)、人細(xì)胞、酵母 或細(xì)菌中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體可用于產(chǎn)生大量由本發(fā)明多核苷酸編碼的MAGE-A3蛋白，例如用 作亞單位疫苗或免疫測(cè)定。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用作活載體的腺病毒是復(fù)制缺陷型猿腺病毒。通常，這 些病毒含有El缺失，可以在轉(zhuǎn)化了 El基因的細(xì)胞系中培養(yǎng)。優(yōu)選的猿腺病毒是分離自黑 猩猩的病毒。特別的，C68(也稱為Pan 9)(參見美國(guó)專利No. 6083716)和Pan 5、6和Pan 7 (W0 03/046124)優(yōu)選用于本發(fā)明。可操作這些載體以插入本發(fā)明的異源基因，使得可表達(dá) 所述基因產(chǎn)物。這些重組腺病毒載體的用途、配方和制造在WO 03/046142中詳細(xì)描述。獲得核酸序列和產(chǎn)生表達(dá)載體的常規(guī)重組技術(shù)描述于Maniatis等.，Molecular Cloning-Α Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor，1982—1989。對(duì)于基于蛋白的組合物而言，本發(fā)明的蛋白可以溶于液體的形式或者凍干的形式 提供。每人劑量可包含1至1000微克蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述劑量可包含30-300
微克蛋白。本文所述含MAGE-A3的組合物還可包含疫苗佐劑和/或免疫刺激細(xì)胞因子或趨化 因子。用于本發(fā)明的合適疫苗佐劑是市售的，例如弗氏不完全佐劑和完全輔劑(Difco Laboratories, Detroit, MI) ；Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ) ；AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA)；鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(alum)或磷 酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗軕乙海货；牵魂?yáng)離子或陰離子衍生化的多糖； 聚磷腈；生物可降解的微球體；單磷酰脂A和quil Α。細(xì)胞因子，例如GM-CSF或白細(xì)胞介 素-2、-7或-12以及趨化因子也可用作佐劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑可包含單磷酰脂A例如3-de-O-?；瘑瘟柞Ｖ?A(3D-MPL)和鋁鹽的組合?；蛘撸鲎魟┛砂?D-MPL，或其它toll樣受體4(TLR4)配 體，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯，如WO 98/50399、WO 01/34617和WO 03/065806中所公開的?？墒褂玫牧硪环N佐劑是皂角苷，例如QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, ΜΑ)，其可單獨(dú)使用或者與其它佐劑聯(lián)合使用。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，本方 法提供了單磷酰脂A與皂角苷衍生物的組合，例如QS21和3D-MPL的組合，如WO 94/00153 中所述，或者其中QS21被膽固醇淬滅的組合物，如W096/33739中所述。其它的合適制劑包 括水包油乳劑和維生素Ε。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑包含水包油乳劑中的QS21、3D-MPL 和維生素EjBWO 95/17210中所述。用于本發(fā)明的其它佐劑可包含TLR9拮抗劑，例如含非甲基化CpG的寡核苷酸，其 中CpG 二核苷酸是非甲基化的。這些寡核苷酸是公知的，描述于例如WO 96/02555。用于本發(fā)明的合適寡核苷酸(在此背景下)可包括 含CpG寡核苷酸也可單獨(dú)使用或者與其它佐劑聯(lián)合使用。例如，在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述佐劑包含含CpG寡核苷酸與皂角苷衍生物的組合，特別地包含如WO 00/09159和WO 00/62800所公開的CpG與QS21的組合。因此，本發(fā)明提供了如本文所述的包含MAGE-A3的組合物，其中所述佐劑包含 3D-MPL、QS21、CpG寡核苷酸、聚乙烯醚或酯中的一種或多種或者這些佐劑的兩種或更多種 的組合。在一些實(shí)施方式中，所述組合物中MAGE-A3組分可以水包油或油包水乳液形式存 在，或者以脂質(zhì)體制劑存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑可包含3D-MPL、QS21和免疫激活CpG寡核苷酸中的 一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方式中，存在所有三種佐劑成分。所述成分可以脂質(zhì)體制劑或水 包油乳劑形式存在，例如WO 95/17210中所述的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，3D-MPL和QS21以水包油乳液形式存在，沒(méi)有CpG寡核苷酸。所用的3D-MPL的量一般很小，但是取決于所述制劑可以為1_1000微克/劑，優(yōu)選 1-500微克/劑，更優(yōu)選1至100微克/齊IJ。本發(fā)明佐劑中CpG或免疫激活寡核苷酸的量一般很少，但是取決于所述制劑可以為1-1000微克/劑，優(yōu)選1-500微克/劑，更優(yōu)選1至100微克/劑。本發(fā)明佐劑中所用皂角苷的量可以為1-1000微克/劑，優(yōu)選1-500微克/劑，更 優(yōu)選1至250微克/劑，最優(yōu)選1至100微克/劑。本文所述的佐劑制劑可另外包含水包油乳液和/或維生素E，或者配制為脂質(zhì)體 組合物。其它合適的佐劑包括Montanide ISA 720(Seppic, France)、SAF(Chiron, California, United States)、ISCOMS (CSL)、MF-59 (Chiron)、Ribi Detox、RC-529 (GSK, Hamilton, MT)以及其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)。一般地，每人劑量可包含0. 1至1000微克的抗原，例如0. 1至500微克、0. 1至100
微克或者0. 1至50微克?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究確定特定免疫治療劑的最佳量，所述研究包括觀 察接種對(duì)象中的適當(dāng)免疫應(yīng)答。在最初的接種之后，對(duì)象可接受一次或多次適當(dāng)間隔的加 強(qiáng)免疫。作為替代地，用于本發(fā)明方法的組合物可包括藥物組合物，其包含在可藥用賦形 劑中的本文所述MAGE-A3。接下來(lái)參考下列非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明


圖1 :MAGEA3_U引物在非反轉(zhuǎn)序列上的位置(圖la-SEQ ID NO 10)以及對(duì)應(yīng)的反 轉(zhuǎn)序列上的位置(圖Ib-SEQ ID N0:41)。MAGEA3_G01 U引物位置由框顯示，MAGEA3_G02U 引物位置高亮顯示，MAGEA3_FURUTAU引物位置以粗體顯示，MAGEA3_QIU U引物位置以下劃
線顯示，由表示的G位置對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖2 :MAGEA3_G0_2_U引物在非反轉(zhuǎn)序列上的位置(圖2a_SEQ ID NO 10)以及對(duì) 應(yīng)的反轉(zhuǎn)序列上的位置(圖2b-SEQ ID NO :41)，下劃線起點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖3:檢測(cè)限示意圖。圖 3a :MAGEA3_G0_2U 輸入 U DNA (LNCaP 細(xì)胞)相對(duì) Ct 值作圖，1. 5ng 的 U 輸入 DNA仍可檢出 圖 3b :MAGEA3_Furuta_U 輸入 U DNA (Gerl 細(xì)胞)相對(duì) Ct 值作圖，1. 5ng 的 U 輸入 DNA仍可檢出圖4 Amplifluor 技術(shù)的示意圖。所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物(在該情況下為正向引物)包含“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，其帶有 分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體(FAM)和受體部分(DABCYL)。在不擴(kuò)增時(shí)，供體部分發(fā)射的熒光被 受體部分有效地接收，導(dǎo)致熒光淬滅。在擴(kuò)增期間，引物被摻入擴(kuò)增產(chǎn)物。在第二輪擴(kuò)增中， 莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞。受體部分不再能夠有效淬滅供體部分發(fā)射的熒光。因此，供體部 分產(chǎn)生可檢出的熒光信號(hào)。圖5 樣品分類(甲基化、非甲基化或無(wú)效)的判定樹(Decision tree)。圖6 黑素瘤樣品中的MAGE-A3甲基化狀態(tài)通過(guò)將真陽(yáng)性率(靈敏度)作為假陽(yáng) 性率(100-特異性)的函數(shù)作圖，計(jì)算4個(gè)MAGE-A3非甲基化測(cè)定的受試者工作特征(ROC) 曲線。圖6a :G0丄U測(cè)定靈敏度91. 7 %、特異性76. 5%、截?cái)?14. 8，曲線下面積(AUC)
32為0. 912。95% CI范圍為0. 781至0. 977，面積=5的顯著性P = 0. 0001。圖6b :G0_2_U測(cè)定靈敏度87. 5%、特異性100%、截?cái)?92. 6，曲線下面積(AUC) 為0. 971。95% CI范圍為0. 863至0. 996，面積=5的顯著性P = 0. 0001。圖6c :Furuta_U測(cè)定靈敏度66. 7 %、特異性100%、截?cái)?43. 1，曲線下面積 (AUC)為 0. 939。95% CI 范圍為 0. 817 至 0. 989，面積=5 的顯著性 P = 0. 0001。圖6d :Qiu_U測(cè)定靈敏度83. 3%、特異性94. 1%、截?cái)?31. 1，曲線下面積(AUC) 為0. 944。95% CI范圍為0. 824至0. 990，面積=5的顯著性P = 0. 0001。圖6e 四個(gè)測(cè)定中每個(gè)所得結(jié)果的總結(jié)表。圖7 肺活組織檢查中的MAGE-A3甲基化狀態(tài)通過(guò)將真陽(yáng)性率(靈敏度)作為 假陽(yáng)性率(100-特異性)的函數(shù)作圖，計(jì)算4個(gè)MAGE-A3非甲基化測(cè)定的受試者工作特征 (ROC)曲線。圖7a :G0丄U測(cè)定靈敏度84. 6%、特異性91. 7%、截?cái)?15. 8，曲線下面積(AUC) 為 0. 954.。95% CI 范圍為 0. 868 至 0. 990，面積=5 的顯著性 P = O. 0001。圖7b :G0_2_U測(cè)定靈敏度88.5%、特異性94.4%、截?cái)?08.28，曲線下面積 (AUC)為 0. 971。95% CI 范圍為 0. 893 至 0. 996，面積=5 的顯著性 P = 0. 0001。圖7c :Furuta_U測(cè)定靈敏度84. 6 %、特異性91. 7 %、截?cái)?96. 8，曲線下面積 (AUC)為 0. 949。95% CI 范圍為 0. 861 至 0. 988，面積=5 的顯著性 P = 0. 0001。圖7d :Qiu_U測(cè)定靈敏度84. 6%、特異性91. 7%、截?cái)?76. 71，曲線下面積(AUC) 為0. 948。95% CI范圍為0. 859至0. 988，面積=5的顯著性P = O. 0001。圖7e 肺活組織檢查的四個(gè)測(cè)定中每個(gè)所得結(jié)果的總結(jié)表。圖8 肺FFPE樣品中的MAGE-A3甲基化狀態(tài)通過(guò)將真陽(yáng)性率(靈敏度)作為假陽(yáng) 性率(100-特異性)的函數(shù)作圖，計(jì)算4個(gè)MAGE-A3非甲基化測(cè)定的受試者工作特征(ROC) 曲線。圖8a :G0丄U測(cè)定靈敏度84. 0%、特異性96. 0%、截?cái)?1. 88，曲線下面積(AUC) 為0. 933。95% CI范圍為0. 825至0. 984，面積=5的顯著性P = O. 0001。圖8b :G0_2_U測(cè)定靈敏度84. 0%、特異性96. 3%、截?cái)?7. 75，曲線下面積(AUC) 為0. 932。95% CI范圍為0. 826至0. 983，面積=5的顯著性P = O. 0001。圖8c :Furuta_U測(cè)定靈敏度80. 0%、特異性96. 2%、截?cái)?14. 26，曲線下面積 (AUC)為 0. 923。95% CI 范圍為 0. 813 至 0. 979，面積=5 的顯著性 P = 0. 0001。圖8d:Qiu_U測(cè)定靈敏度72.0%、特異性96. 2%、截?cái)?8. 91，曲線下面積(AUC) 為0. 912。95% CI范圍為0. 799至0. 973，面積=5的顯著性P = 0. 0001。圖8e 肺FFPE樣品的四個(gè)測(cè)定中每個(gè)所得結(jié)果的總結(jié)表。圖9 在反應(yīng)過(guò)程的不同步驟摻入時(shí)黑色素對(duì)PCR抑制的影響。圖9a 通過(guò)MAGE-A3U實(shí)時(shí)MSP處理的有和沒(méi)有摻入的黑色素的LNCaP細(xì)胞系材 料。BT =亞硫酸氫鹽處理。圖9b:通過(guò)Gst-Pi M實(shí)時(shí)MSP處理的有和沒(méi)有摻入的黑色素的MCF7細(xì)胞系材料。圖 10 蛋白 D-MAGE-A3_His單下劃線=蛋白D的前109個(gè)氨基酸雙下劃線=蛋白D信號(hào)序列(18aa)
|力口框t =插入的/替換的序列在2-3位Met-Asp (替換的)；在128-129位
Met-Asp (插入的)以及在442-443位Gly-Gly (插入的)粗體=MAGE3的片段MAGE3的3-314位氨基酸(共312AA)灰色=7個(gè)his的尾發(fā)明詳沭-實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1 實(shí)時(shí)Airolifluor測(cè)定開發(fā)了基于直接實(shí)時(shí)熒光的甲基化特異性PCR測(cè)定(實(shí)時(shí)MSP測(cè)定)，以確定MGMT 啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)(Vlassenbroeck等.，J Mol Diagn 2008，10 :332_337)。此技術(shù)在第 70頁(yè)圖4的圖例中舉例說(shuō)明和概括。使用該技術(shù)成功地進(jìn)行了 Mage-A3的分析物定量。這由平行擴(kuò)增/定量過(guò)程組 成，其中使用Mage-A3的特異性引物和引物/檢測(cè)物對(duì)，使用了 ABI Prism 7900HT裝置 (Applied Biosystems)上的Amplifluor 測(cè)定格式。正向引物/檢測(cè)物和反向引物在反應(yīng)混合物中的引物終濃度均為lOOnM。每個(gè)PCR 反應(yīng)使用12. 5微升含有Rox的iTaqTM Supermix (BioRad, 2x緩沖液)。包含5微升經(jīng)修 飾模板DNA在內(nèi)的每個(gè)反應(yīng)的總體積為25微升。ABI7900HT SDS裝置在使用10分鐘前打 開，使得加熱蓋達(dá)到105攝氏度。使用下列溫度特征階段1 :50攝氏度2分鐘，階段2 95 攝氏度10分鐘，階段3 95攝氏度15秒，62攝氏度1分鐘(平臺(tái)數(shù)據(jù)收集)，重復(fù)45次。按照如下所述產(chǎn)生用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒材料PCR擴(kuò)增并克隆由引物確定的啟動(dòng) 子序列(使用合適的分離的且經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的細(xì)胞系DNA)。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證序列，并將 其與公開的啟動(dòng)子序列進(jìn)行比較。包括標(biāo)準(zhǔn)曲線(2X 106_20個(gè)拷貝)，以通過(guò)將未知樣品的Ct值內(nèi)插 (interpolation)到標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定未知樣品的拷貝數(shù)。0 _肌動(dòng)蛋白用作測(cè)定中的參照基因。實(shí)施例2 :MAGE~A3測(cè)定和引物設(shè)計(jì)除了新引物序列之外，合成可用于檢測(cè)非甲基化MAGE-A3的引物，如Qiu等 人Clinical Biochemistry 39 (2006)，259—2 Jang 等人Cancer Research61 (2001), 7959-7963 和 Furuta 等人Cancer Sci 95 (2004)，962-968 所述的，并顯示于表 1。使用適于MSP要求的Primerf軟件進(jìn)行用于檢測(cè)非甲基化或者甲基化形式Mage A3 的正向(F)和反向(R)引物的電子(in silico)設(shè)計(jì)(http://fokker.wi.mit.edu/ primer3/input. htm)。條件如下擴(kuò)增子大小:60_120nt ；引物大小18_27nt ；熔解溫度 55-65攝氏度；最大3，自我互補(bǔ)=0 ；TSS周圍的200bp窗口(返回?cái)?shù)=2000)。設(shè)計(jì)U_引物用以檢測(cè)非甲基化Mage-A3，而設(shè)計(jì)M_引物用以檢測(cè)甲基化 Mage-A3。最后，保留引物 A MAGE_A3 和 MAGEA3_G0_1_U_F、MAGEA3_G0_2_U_R、MAGEA3_G0_1_ U_R_AMP、MAGEA3_G0_2_U_F_AMP、MAGEA3_G0_1_M_F、MAGEA3_G0_2_M_F、MAGEA3_G0_1_M_R_ AMP和MAGEA3_G0_2_M_R_AMP進(jìn)行進(jìn)一步的研究。U引物相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的位 置顯示于圖1和圖2中。引物的位置在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍。正向或反向引物之一合成為包含合適的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在5 ’端帶有供體 和受體部分，具有核苷酸序列5，AGCGATGCGTTCGAGCATCGCU3，(SEQ ID NO 1)。
測(cè)試了不同的MAGEA3引物組合。最后，保留4個(gè)U_測(cè)定和2個(gè)M_測(cè)定進(jìn)行進(jìn)一 步的開發(fā)。每個(gè)測(cè)定所選擇的引物組合在表1中概述。
表1 :MAGEA3的引物和amplifluor檢測(cè)物的序列實(shí)施例3 分析測(cè)定的件能使用重新構(gòu)建的底物證明該測(cè)定的分析性能(檢出限和特異性)。檢出限為了確定MSP對(duì)非甲基化模式的靈敏性，連續(xù)稀釋陽(yáng)性證實(shí)的細(xì)胞系材料(LNCaP 和Gerl)，將其與對(duì)照(陰性)細(xì)胞系DNA(DU145)混合。制備1/10、1/100和1/500的稀 釋度(參見表2)。使用來(lái)自Zymo Research的EZDNA甲基化試劑盒對(duì)總量750ng的DNA (U DNA+M DNA)進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。
表2 細(xì)胞混合物稀釋方案隨后，將2. 4微升化學(xué)處理的DNA用作MAGEA3實(shí)時(shí)MSP的模板，使用非甲基化 G0_2_U測(cè)定(LNCaP/DU145 DNA混合物)和非甲基化Furuta測(cè)定(Gerl/DU145 DNA混合 物)的特異性引物。結(jié)果在圖3中顯示。如所見的，MAGEA3 G0_2_U和MAGEA3_Furuta實(shí)時(shí)MSP的檢測(cè)下限可重復(fù)地設(shè)置 在1.5ng(l/500稀釋)，這考慮了整個(gè)樣品制備程序。因?yàn)槊總€(gè)PCR反應(yīng)使用10%的樣品， 最終的分析靈敏度是0. 15ng。分析特異件通過(guò)使用了CpGenomeTM 通用甲基化 / 非甲基化 DNA(ChemiconIntemational， CA, USA ；目錄號(hào)#S7821和目錄號(hào)#S7822)的MSP以及隨后的瓊脂糖凝膠分析確認(rèn)MAGEA3 G0_l_U/G0_2_U/Furuta_U* QIU_U 引物組的特異性。簡(jiǎn)言之，在 I Cycler(Bio-Rad)上進(jìn) 行amplifluor實(shí)時(shí)MSP，其使用下列溫度設(shè)置階段1 :50攝氏度2分鐘，階段2 95攝氏度 10分鐘，階段3 95攝氏度15秒，62攝氏度1分鐘(=平臺(tái)數(shù)據(jù)收集)，重復(fù)45次。弓丨物 高特異性對(duì)基于Amplifluor的檢測(cè)來(lái)說(shuō)是必需的，所以在階段3施加溫度梯度，以選擇最 佳退火溫度(57攝氏度、58. 1攝氏度、60. 3攝氏度和61. 8攝氏度)。在3%瓊脂糖凝膠上將所有所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。當(dāng)CpGenomeTM通用甲基化 DNA用作模板DNA時(shí)(在57攝氏度下測(cè)試)沒(méi)有可見條帶，證實(shí)了對(duì)非甲基化DNA的特異 性。另外，使用序列比對(duì)在MAGE-A家族的其它基因成員中研究MAGEA3測(cè)定的特異 性。在表 3 中顯示 MAGE-A3 G0_l_U/G0_2_U/Furuta_U 和 QIU_U 引物組相對(duì)于 MAGE-A2 和 MAGE-A12序列(反轉(zhuǎn)(converted)序列)的錯(cuò)配數(shù)。所研究的U引物顯示對(duì)MAGE-A3U/ MAGE-A6U是特異性的。 表3:序列比對(duì)克降MAGE-A3調(diào)節(jié)序列和件能標(biāo)準(zhǔn)曲線使用表4中所示的側(cè)翼引物克隆364bp的調(diào)節(jié)性MAGE-A3 U DNA序列。 表4 用于產(chǎn)生MAGEA3質(zhì)粒材料的側(cè)翼引物此克隆的材料用作實(shí)時(shí)MSP的標(biāo)準(zhǔn)曲線材料。首先通過(guò)進(jìn)行兩個(gè)平板的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 曲線O^lO6IMO1拷貝)(2個(gè)不同的操作者，3個(gè)PCR混合物/操作者/平板)證實(shí)可重 復(fù)性。監(jiān)測(cè)斜率、PCR效率和R2值，給出可接受的結(jié)果。件能標(biāo)準(zhǔn)曲線一式兩份加載連續(xù)稀釋的MAGEA3質(zhì)粒材料(2X IO6至2X IO1拷貝/5 μ 1)，使用 表1中列出的引物和Amplifluor檢測(cè)物序列，采用下列優(yōu)化的溫度設(shè)置階段1 :50攝氏度2分鐘，階段2 :95攝氏度1分鐘，階段3 :95攝氏度15秒，59攝氏度30秒，59攝氏度30秒 (平臺(tái)數(shù)據(jù)收集)，重復(fù)45次。使用SDS 2.2軟件(Applied Biosystems)產(chǎn)生結(jié)果，輸出 為Ct值(擴(kuò)增曲線跨過(guò)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，由軟件自動(dòng)設(shè)置)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的性能顯示于表5。
表5 :MAGEA3的斜率和PCR效率總結(jié)實(shí)施例4 測(cè)定對(duì)于細(xì)胞系材料的件能研究了 19個(gè)細(xì)胞系的MAGEA3甲基化狀態(tài)。下面分別顯示對(duì)于MAGEA3U和M測(cè)定
來(lái)說(shuō)最佳的甲基化和非甲基化細(xì)胞系。 表6 通過(guò)MAGEA3U測(cè)定處理的細(xì)胞系 表7 通過(guò)MAGEA3M測(cè)定處理的細(xì)胞系實(shí)施例5 中間精密度通過(guò)對(duì)非甲基化和甲基化版本的MAGEA3啟動(dòng)子序列重復(fù)進(jìn)行相同的測(cè)定來(lái)測(cè)試 中間精密度。重復(fù)地測(cè)量不同數(shù)量的完全修飾的MAGEA3 U和MAGEA3M啟動(dòng)子DNA分子(標(biāo) 準(zhǔn)曲線材料)。另外，通過(guò)在不同的兩天(每天每個(gè)操作員一式兩份地進(jìn)行3個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn) 曲線稀釋)由兩個(gè)不同的熟練實(shí)驗(yàn)室操作員(操作員A和B)重復(fù)地進(jìn)行測(cè)定來(lái)測(cè)試操作 員因素。表8和9概述了測(cè)試GO 1和GO 2U和M MAGEA3測(cè)定的中間精密度所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。 顯示對(duì)于相同數(shù)量的分子所有結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0. 11和1. 29之間。所有相關(guān)系數(shù)(不同 操作員和日期)的概述顯示于表9中，平均R2的范圍為0.9959至0.9997)。
表8:檢測(cè)中間精密度(在不同的兩天，操作員A和B)欄目1 分子數(shù)量(log)， 表9 所發(fā)現(xiàn)的每個(gè)分析的稀釋系列的相關(guān)系數(shù)實(shí)施例6 黑餼素干擾之前已有報(bào)道稱對(duì)含有黑色素的樣品進(jìn)行PCR的效率低。Eckhart等人(2000)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于黑素細(xì)胞的RNA和cDNA制劑都含有RT-PCR抑制 劑，其與核酸共純化。對(duì)候選抑制劑黑色素的研究顯示其可逆地結(jié)合熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 并抑制其活性。在通過(guò)MAGEA3 U amplifluor測(cè)定處理黑素瘤樣品之前，研究了黑色素可 能導(dǎo)致的抑制。如Eckhart等人所述制備合成黑色素。簡(jiǎn)言之，將黑色素(SIGMA M8631)以2mg/ ml的濃度溶于蒸餾水，徹底渦旋混勻，在室溫下水浴超聲處理10分鐘。通過(guò)在9000g下離 心除去不溶的黑色素。通過(guò)在反應(yīng)過(guò)程的不同步驟加入黑色素來(lái)測(cè)試可能的抑制作用1)在提取之前將1微克和5微克制備的黑色素添加到250，000個(gè)LNCaP細(xì)胞和250，000 個(gè) MCF7 細(xì)胞2)提取后將1微克和5微克制備的黑色素添加到1微克LNCaP和MCF7DNA3)亞硫酸氫鹽處理后將1微克和5微克制備的黑色素直接摻入PCR反應(yīng)。改變 亞硫酸氫鹽洗脫體積以使得在PCR反應(yīng)中具有恒定的模板濃度(稱為“a”，例如LNCaP a) 或恒定的模板量(稱為“b”，例如LNCaP b)。將這些含有黑色素的LNCaP和MCF7樣品與對(duì)應(yīng)地非摻入黑色素的樣品同時(shí)進(jìn)行處理。使用PUREGENE DNA純化試劑盒和EZ DNA甲基化試劑盒進(jìn)一步處理樣品。 將化學(xué)修飾的DNA用作MAGEA3 U、Gst-Pi M和ACTB實(shí)時(shí)MSP的輸入材料。計(jì)算所測(cè)試基因啟動(dòng)子和ACTB參照基因的回收拷貝數(shù)并針對(duì)每個(gè)情況進(jìn)行比較。結(jié)果顯示于圖9。當(dāng)在DNA提取之前或之后加入黑色素時(shí)，沒(méi)有觀察到顯著的PCR 抑制作用。黑色素僅在直接摻入PCR反應(yīng)時(shí)顯示明顯的抑制。與RT-PCR不同，可以通過(guò)實(shí) 時(shí)MSP處理具有高黑色素含量的黑素瘤樣品，而沒(méi)有PCR抑制的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例7 黑素瘤/肺樣品的MAGE-A3甲某化狀杰以及與RNA表汰的一致件材料和方法臨床樣品由GSKBio提供來(lái)自黑素瘤和肺癌的手術(shù)樣品根據(jù)GSKBio RNA表達(dá)數(shù)據(jù)將基因 組DNA樣品(gDNA) ,RNAlater 溶液中的活組織檢查材料以及相應(yīng)的甲醛固定石蠟包埋 組織(FFPE)分為MAGEA3陽(yáng)性或MAGEA3陰性。所提供樣品組的概述在表10中詳述. 表10:臨床樣品收集*根據(jù)相應(yīng)RNA later :組織進(jìn)行的分類細(xì)胞系每個(gè)測(cè)定中包含細(xì)胞系作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。在對(duì)臨床樣品進(jìn)行amplifluor實(shí) 時(shí)MSP測(cè)定之前，對(duì)細(xì)胞系材料確認(rèn)所述測(cè)定的靈敏度和特異性。在表11中概述最佳的 MAGEA3甲基化和非甲基化細(xì)胞系。Gerl、Staq enCRL9609獲得自GSKBio，細(xì)胞系LNCaP和DU145購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)。
表11 :MAGEA3對(duì)照細(xì)胞系DNA 分離首先在750微升二甲苯中將甲醛固定石蠟包埋的樣品脫蠟2小時(shí)。進(jìn)行第二次二 甲苯處理(400 μ 1 二甲苯，2小時(shí))，然后加入250微升70%的乙醇，之后以13000rpm離心 15分鐘。除去上清，在室溫下將樣品風(fēng)干。在除去RNA later 容液后，使用刀片將RNA later 中的樣品切成非常小的塊。然后，使用經(jīng)典的苯酚/氯仿提取法提取DNA，并重懸于50微升LoTE (3mM TRIS， 0. 2mM EDTA,ρΗ8·0)。使用PiC0green dsDNA定量試劑盒(MolecularProbes,#_P7589)按照制造商的 建議對(duì)DNA進(jìn)行定量。隨該試劑盒提供的λ DNA用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用FluoStar Galaxy 平板讀數(shù)器(BMG Lab technologies, Germany)收集數(shù)據(jù)。DNA修飾使用來(lái)自Zymo Research的EZ DNA甲基化試劑盒對(duì)1. 5 μ gDNA進(jìn)行亞 硫酸氫鹽修飾。簡(jiǎn)言之，45微升等分試樣與5微升的M-稀釋緩沖液混合，在37攝氏度下IlOOrpm 搖動(dòng)孵育15分鐘。然后，加入100微升稀釋的CT轉(zhuǎn)化(conversion)試劑，將樣品在70攝 氏度下黑暗中以IlOOrpm搖動(dòng)孵育3小時(shí)。轉(zhuǎn)化后，再根據(jù)制造商的說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽 和脫磺酸鹽，在25微升Tris-HCl ImM pH8. 0中洗脫。修飾的DNA保存于-80攝氏度至進(jìn)
一步處理。DNA擴(kuò)增在來(lái)自Applied Biosystems的7900HT快速實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀上進(jìn)行實(shí) 時(shí) MSP。測(cè)試設(shè)計(jì)成靶向非甲基化版本基因啟動(dòng)子序列的四個(gè)MAGEA3低甲基化測(cè)定與所提 供的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的一致性，所述RNA表達(dá)數(shù)據(jù)是根據(jù)W02007/147876中所述方法檢測(cè)，例 如，使用表2的引物和探針，SEQ ID NO :3、4和13的MAGE-A3外顯子3特異性引物和探針。還 測(cè)定了獨(dú)立的參照基因β -肌動(dòng)蛋白(ACTB)。引物和amplifluor檢測(cè)物序列顯示于表1。將2. 4微升經(jīng)修飾的基因組DNA樣品添加到12微升終體積的PCR反應(yīng)，其包含 6微升含Rox的iTaq Supermix (BioRad，2x緩沖液)，正向引物/檢測(cè)物和反向引物的終 引物濃度均為ΙΟΟηΜ。每個(gè)MAGEA3設(shè)計(jì)的循環(huán)條件為50攝氏度2分鐘；95攝氏度10分 鐘；然后45個(gè)循環(huán)的95攝氏度15秒、59攝氏度30秒[對(duì)于ACTB為62攝氏度]和59攝氏度30秒[對(duì)于ACTB為62攝氏度](=平臺(tái)數(shù)據(jù)收集)。使用SDS 2. 2. 2軟件(Applied Biosystems)產(chǎn)生結(jié)果，輸出為Ct值(擴(kuò)增 曲線跨越閾值的循環(huán)數(shù)，由軟件自動(dòng)設(shè)置)，然后用于根據(jù)20-2xl(T6基因拷貝等價(jià)物 (equivalents)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上所作圖的值的線性回歸計(jì)算拷貝數(shù)，使用含有亞硫酸氫鹽修 飾的目的序列的質(zhì)粒DNA或純化的PCR產(chǎn)物。計(jì)算MAGEA3和ACTB之間的比值，得到測(cè)定 結(jié)果。為了解釋該數(shù)據(jù)，根據(jù)非盲性RNA表達(dá)數(shù)據(jù)定義臨床截?cái)嘀?閾值)。根據(jù)圖5中所示的判定樹將樣品分為甲基化、非甲基化或無(wú)效的。每個(gè)測(cè)定中包含細(xì)胞系作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，其在DNA提取步驟進(jìn)入程序。當(dāng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)時(shí)認(rèn)為測(cè)定是有效的a)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的PCR效率均高于80% ； b)至少4個(gè)相關(guān)數(shù)據(jù)點(diǎn)的r~2高于0.990 ；c)兩個(gè)重復(fù)(duplicates)之間的ACt< 1.5 ； d)通常包括的NTC未擴(kuò)增；e)可檢出陽(yáng)性細(xì)胞系測(cè)定對(duì)照的10%的1. 5微克轉(zhuǎn)化反應(yīng)；以 及f)在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)未檢出陰性細(xì)胞系測(cè)定對(duì)照的10%的1. 5微克轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 甲基化和基因表汰之間的一致件黑素瘤針對(duì)相同樣品組比較MAGEA3的表達(dá)和甲基化水平?？偣玻褂肦T-PCR和實(shí)時(shí)MSP 處理了 41份黑素瘤樣品。測(cè)試了幾種MAGEA3 U amplifluor測(cè)定設(shè)計(jì)，以確定哪種測(cè)定與 GSK提供的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的一致性最佳。以具有最大一致性以及最少假陽(yáng)性的方式設(shè)置臨 床截?cái)嘀?參見表12)。這些樣品中MAGEA3甲基化狀態(tài)的R0C曲線顯示于圖6。在17個(gè) 陰性樣品中，9個(gè)是其它MAGE-A家族成員陽(yáng)性的；G0_2_U和Furuta U測(cè)定正確地將這9個(gè) 樣品歸類(100%特異性)。將這些數(shù)據(jù)匯總，MAGEA3_G0_2_U測(cè)定運(yùn)行最佳，其具有92. 7 %的一致性和100 % 的特異性。
MAGEA3—G 0—1—UMAGEA3—GO— 2—UMAGEA3 Furuta UMAGEA3 Qiu U截?cái)嘀?15330946434正確歸類MAGEA3陰性 (GSK— 17)13171716正確歸類MAGEA3陽(yáng)性 (GSK — 24)22211620正確歸類樣品 (樣品總數(shù)41)35383336一致性85.4%92. 7%80.5%87. 8% 表12 黑素瘤樣品一致性數(shù)據(jù)
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肺樣品(活組織檢杳和FFPE)對(duì)不同的樣品組測(cè)試如上所述的相同設(shè)置通過(guò)4個(gè)MAGEA3 Uamplifluor測(cè)定篩 選52個(gè)肺FFPE樣品和61個(gè)RNA later 中的肺組織，并與相應(yīng)的RNA數(shù)據(jù)比較一致性。這些肺活組織檢查和FFPE樣品中MAGEA3甲基化狀態(tài)的R0C曲線分別顯示于圖7 和圖8中。在MAGEA3陰性樣品中，9個(gè)是其它MAGE-A家族成員陽(yáng)性的；MAGEA3U測(cè)定正確 地將全部的9個(gè)樣品歸類(100%特異性)。所得結(jié)果證實(shí)了 MAGEA3_G0_2_U測(cè)定是運(yùn)行最 佳的測(cè)定，其在FFPE中具有90. 4%的一致性以及在活組織檢查中具有91. 8%的一致性，保 持100%的特異性(表13)。 表13 肺樣品一致性數(shù)據(jù)(MAGEA3_G0_2_U測(cè)定)實(shí)施例8 通過(guò)MAGEA3測(cè)定檢測(cè)肺樣品通過(guò)MAGEA3 (U & M測(cè)定版本)和0 -肌動(dòng)蛋白測(cè)定處理來(lái)自肺癌的DNA，平行處 理LNCaP & DU145對(duì)照細(xì)胞系。測(cè)試了幾種MAGEA3 Uamplifluor測(cè)定設(shè)計(jì)，以確定哪種測(cè) 定與MAGEA3 G0_2 U測(cè)定的一致性最佳。使用如實(shí)施例7所述的實(shí)驗(yàn)條件。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯 示高于80%的效率。R2高于0. 99。對(duì)于MAGEA3 G0_2 U測(cè)定截?cái)嘀翟O(shè)在29 ；對(duì)于MAGEA3 G0_1 U測(cè)定設(shè)在22 ；對(duì)于MAGEA3 Furuta U測(cè)定設(shè)在229 ；對(duì)于MAGEA3 Qiu測(cè)定設(shè)在87 ； 對(duì)于MAGEA3 G0_1 M測(cè)定設(shè)在148以及對(duì)于MAGEA3 G0_2 M測(cè)定設(shè)在167。針對(duì)相同樣品 組比較MAGEA3的甲基化水平。結(jié)果顯示于表14和15。對(duì)于MAGEA3 G0_2 U測(cè)定(截?cái)嘀?=29)_3個(gè)樣品歸類為無(wú)效，這些樣品不包含在與其它U & M測(cè)定的比較中；-9個(gè)樣品歸類為非甲基化；-15個(gè)樣品歸類為甲基化。對(duì)于有效樣品，四個(gè)MAGEA3 U測(cè)定給出相似的結(jié)果，與MAGEA3 G0_2U測(cè)定有96% 的一致性。MAGEA3 M測(cè)定給出與MAGEA3 G0_2 U測(cè)定71 %和75%的一致性。
表14 比較不同U測(cè)定的總表，其顯示于G0_2 U測(cè)定相比的U測(cè)定所計(jì)算出的一 致性(該表僅考慮有效樣品)。 表15 比較不同M測(cè)定的總表，其顯示與G0_2 U測(cè)定相比的M測(cè)定所計(jì)算出的一 致性(該表僅考慮有效樣品)。本發(fā)明不限于本文所述具體實(shí)施方式
的范圍。事實(shí)上，除了本文所描述的那些之 外，從前述說(shuō)明和附圖出發(fā)本發(fā)明的許多修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。這 些修改落入所附權(quán)利要求的范圍。此外，認(rèn)為本文所述的所有實(shí)施方式廣泛適用，并且根據(jù) 需要可與任何及所有其它一致實(shí)施方式相組合。本文引用了多個(gè)出版物，其公開通過(guò)引用以整體并入本文。
權(quán)利要求
寡核苷酸、引物或探針，其包含SEQ ID NO.5、6、7、2、3、4、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19或25中任意的核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成，所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸、引物或探針，其包含SEQID N0.5、6、7、2、3、4或25中 任意的核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成，所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè) 基因的甲基化狀態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸、引物或探針，其包含5’到3’順序的下列連續(xù)序列或基 本由其組成或由其組成(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用選 自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體部分和受體部分的第一部分標(biāo)記，其中所述供體部分在受激發(fā)時(shí) 發(fā)出一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)的熒光，所述受體部分吸收和/或淬滅所述供體部分發(fā)射的所述 熒光；(b)第二單鏈核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸、基本由其組成或者由其組成；(c)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸、基本由其組成或由其組成，其中所述 第三核苷酸序列中的核苷酸用選自所述供體部分和所述受體部分的第二部分標(biāo)記，所述第 二部分是所述組中未用于標(biāo)記所述第一核苷酸序列的成員，其中所述第三核苷酸序列反向 互補(bǔ)于所述第一核苷酸序列，從而所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間可形成 雙鏈體使得所述第一部分和所述第二部分鄰近，從而當(dāng)供體部分受激發(fā)發(fā)射熒光時(shí)，受體 部分吸收并淬滅所述供體部分發(fā)射的所述熒光；以及(d)在引物的3’端，第四單鏈核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸、基本由其組成或 者由其組成，所述核苷酸在其3，端包含SEQ ID N0.5、7、2、4、8、ll、13或25中的任意序列、 基本由其組成或者由其組成(因此能夠通過(guò)核酸聚合酶引發(fā)與包含MAGE A3基因的非甲基 化DNA部分的核酸鏈互補(bǔ)的核苷酸序列的合成)；其中當(dāng)未形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分和所述第二部分分開一定距離，該距離阻 止所述第一和第二部分之間的分子能量轉(zhuǎn)移。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸、引物或探針，其包含5’到3’順序的下列連續(xù)序列或基 本由其組成或由其組成(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用選 自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體部分和受體部分的第一部分標(biāo)記，其中所述供體部分在受激發(fā)時(shí) 發(fā)出一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)的熒光，所述受體部分吸收和/或淬滅所述供體部分發(fā)射的所述 熒光；(b)第二單鏈核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸、基本由其組成或者由其組成；(c)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸、基本由其組成或由其組成，其中所述 第三核苷酸序列中的核苷酸用選自所述供體部分和所述受體部分的第二部分標(biāo)記，所述第 二部分是所述組中未用于標(biāo)記所述第一核苷酸序列的成員，其中所述第三核苷酸序列反向 互補(bǔ)于所述第一核苷酸序列，從而所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間可形成 雙鏈體使得所述第一部分和所述第二部分鄰近，從而當(dāng)供體部分受激發(fā)發(fā)射熒光時(shí)，受體 部分吸收并淬滅所述供體部分發(fā)射的所述熒光；以及(d)在引物的3’端，第四單鏈核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸、基本由其組成或者由其組成，所述核苷酸在其3’端包含SEQ ID NO. 14、16、17或19中的任意序列、基本 由其組成或者由其組成(因此能夠通過(guò)核酸聚合酶引發(fā)與包含MAGE A3基因的甲基化DNA 部分的核酸鏈互補(bǔ)的核苷酸序列的合成)；其中當(dāng)未形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分和所述第二部分分開一定距離，該距離阻 止所述第一和第二部分之間的分子能量轉(zhuǎn)移。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的寡核苷酸、引物或探針，其中所述第四單鏈核苷酸序列包含約8至 40個(gè)核苷酸或基本由其組成或由其組成，所述核苷酸在其3’端包含SEQ ID N0.5、7、2、4或 25的任意序列。
6.引物對(duì)，其包含根據(jù)前述任一權(quán)利要求的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的引物對(duì)，包含根據(jù)權(quán)利要求5的引物。
8.引物對(duì)，包含SEQ ID NO. 6 和 7、SEQ ID NO. 2 和 3、SEQ ID NO. 9 和 4、SEQ ID NO. 12 和13、SEQ ID NO. 14和15、或者SEQ ID NO. 17和18的核苷酸序列或基本由其組成或由其 組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的引物對(duì)，其包含SEQID NO. 6和7或SEQ ID NO. 2和3的核苷酸 序列或基本由其組成或由其組成。
10.用于檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)的試劑盒，其包含至少一個(gè)如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)定 義的寡核苷酸、引物或探針或者如權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)定義的引物對(duì)。
11.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)定義的寡核苷酸、引物或探針或者權(quán)利要求6至9任一項(xiàng)定 義的引物對(duì)或者權(quán)利要求10定義的試劑盒，其中所述基因是MAGE-A3基因。
12.檢測(cè)含DNA樣品中非甲基化Mage-A3基因存在和/或數(shù)量的方法，包括(a)用試劑接觸/處理所述含DNA樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中的非甲基化胞嘧啶 殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基，但所述試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘基(b)使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分非甲基化的目的基因，所述引物對(duì)中的至少 一個(gè)引物設(shè)計(jì)成僅結(jié)合用所述試劑處理之后的非甲基化DNA序列，其中所述引物對(duì)中的至 少一個(gè)引物包含SEQ ID NO. 5、6、7、2、3、4、8、9、11、12、13或25中的任意核苷酸序列，或基 本由其組成，或由其組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述引物對(duì)中的至少一個(gè)引物包含SEQID NO. 5、6、 7、2、3、4或25中的任意核苷酸序列，基本由其組成或由其組成。
14.檢測(cè)含DNA樣品中甲基化Mage-A3基因存在和/或數(shù)量的方法，包括(a)用試劑接觸/處理所述含DNA樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中的非甲基化胞嘧啶 殘基以產(chǎn)生可檢出的經(jīng)修飾殘基，但所述試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘基(b)使用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增至少一部分甲基化的目的基因，所述引物對(duì)中的至少一 個(gè)引物設(shè)計(jì)成僅結(jié)合用所述試劑處理之后的甲基化DNA序列，其中所述引物對(duì)中的至少一 個(gè)引物包含SEQ ID NO. 14、15、16、17、18或19中的任意核苷酸序列，或基本由其組成，或由 其組成。
15.診斷癌癥或癌癥傾向性的方法，包括通過(guò)使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要 求11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引物對(duì)， 根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)樣品中 MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，其中樣品中非甲基化MAGE-A3的存在指示癌癥或癌癥傾向性。
16.鑒定和/或選擇適于用MAGE-A3免疫療法治療的患者的方法，包括通過(guò)使用權(quán)利 要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或 權(quán)利要求11定義的引物對(duì)，根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中 任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)樣品中MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果MAGE-A3基因是非甲基化 的，則所述對(duì)象被鑒定為和/或被選擇用MAGE-A3免疫療法進(jìn)行治療。
17.預(yù)測(cè)癌癥成功治療可能性的方法，包括通過(guò)使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要 求11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引物對(duì)， 根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)患者樣品 中MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是非甲基化的，則使用MAGE-A3免疫療法 成功治療的可能性高于所述基因是甲基化的情況。
18.選擇合適癌癥治療方案的方法，包括通過(guò)使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要求 11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引物對(duì)，根 據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)患者樣品中 MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是非甲基化的，則選擇免疫療法進(jìn)行治療。
19.治療對(duì)象中癌癥的方法，所述方法包括施用免疫療法，其中已在檢測(cè)MAGE-A3基 因甲基化狀態(tài)的基礎(chǔ)上選擇所述對(duì)象進(jìn)行治療，其中通過(guò)使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán) 利要求11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引 物對(duì)，根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè) MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。
20.治療患者的方法，包括使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的寡核苷 酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引物對(duì)，根據(jù)權(quán)利要求10或 11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)， 然后將包含MAGE-A3的組合物施用給所述患者(如果發(fā)現(xiàn)MAGE-A3基因是非甲基化的？)。
21.治療易感于MAGE-A3表達(dá)腫瘤復(fù)發(fā)的患者的方法，所述患者已經(jīng)過(guò)治療移除了腫 瘤組織，所述方法包括使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的寡核苷酸、引物 或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引物對(duì)，根據(jù)權(quán)利要求10或11的試 劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)腫瘤組織中MAGE-A3基因的甲基化 狀態(tài)，然后將包含MAGE-A3的組合物施用給所述患者(如果發(fā)現(xiàn)MAGE-A3基因是非甲基化 的？)。
22.包含MAGE-A3的組合物在制備用于治療腫瘤患者的藥物中的用途，其中已在檢測(cè) MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的基礎(chǔ)上選擇所述對(duì)象進(jìn)行治療，其中通過(guò)使用權(quán)利要求1-5中 任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11 定義的引物對(duì)，根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方 法，檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。
23.包含MAGE-A3的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療易感于MAGE-A3表 達(dá)腫瘤復(fù)發(fā)的患者，其中已在檢測(cè)MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)的基礎(chǔ)上選擇所述對(duì)象進(jìn)行治 療，其中通過(guò)使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的寡核苷酸、引物或探針，權(quán)利 要求6-9中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11定義的引物對(duì)，根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，或者根 據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，檢測(cè)MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)的方法或用途，其中包含MAGE-A3的組合物包含全 長(zhǎng)MAGE-A3、基本上全長(zhǎng)的MAGE-A3或MAGE-A3片段，例如MAGE-A3肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法或用途，其中MAGE-A3肽選自
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法或用途，其中所述MAGE是全長(zhǎng)MAGE-A3，或者基本上全長(zhǎng) 的MAGE3片段，其中MAGE-A3蛋白的N末端和/或C末端缺失1至10個(gè)氨基酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法或用途，其中所述MAGE-A3是MAGE3的3-314位氨基酸(總 共312個(gè)氨基酸)。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法或用途，其中所述MAGE-A3蛋白、片段或肽與融合伴侶蛋白 相連。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法或用途，其中所述MAGE-A3蛋白、片段或肽與融合伴侶蛋白 化學(xué)綴合或者表達(dá)為重組融合蛋白。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的方法或用途，其中所述融合伴侶蛋白是蛋白D，一種革蘭 氏陰性細(xì)菌流感嗜血桿菌B的表面蛋白，或其衍生物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法或用途，其中蛋白D衍生物包括蛋白D的前1/3，蛋白D的 約前1/3，蛋白D的N端前100-110個(gè)殘基，蛋白D的N端前109個(gè)殘基。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法或用途，其中蛋白D融合伴侶的N末端還包含分泌或 信號(hào)序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求26至32任一項(xiàng)的方法或用途，其中MAGE-A3是融合蛋白，其包含 蛋白D的信號(hào)序列；蛋白D的1至109位氨基酸；MAGE-A3蛋白的312個(gè)氨基酸(3-314位 氨基酸)；間隔子；以及多組氨酸尾。
34.根據(jù)權(quán)利要求28或30的方法或用途，其中所述融合伴侶蛋白是LytA或其衍生 物，所述衍生物包含LytA分子C末端起始自178位殘基的重復(fù)部分或由其組成，或者包含 188-305位殘基。
35.根據(jù)權(quán)利要求28或30的方法或用途，其中所述融合伴侶蛋白是NSl(紅細(xì)胞凝集 素)，或其包含NSl的N端81個(gè)氨基酸的衍生物。
36.根據(jù)權(quán)利要求20至35中任一項(xiàng)的方法或用途，其中MAGE-A3包含衍生化的游離巰基。
37.根據(jù)權(quán)利要求20至36中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述組合物包含編碼MAGE-A3 蛋白、片段或肽或其融合蛋白的核酸分子。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法或用途，其中所述核酸分子在表達(dá)載體中提供。
39.根據(jù)權(quán)利要求20至38中任一項(xiàng)的方法或用途，其中含有MAGE-A3的組合物還包含 佐劑、免疫刺激細(xì)胞因子和趨化因子中的一種或多種。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法或用途，其中所述佐劑包含單磷酰脂A或其衍生物、皂角苷 或其衍生物以及TLR9拮抗劑中的一種或多種。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40的方法或用途，其中所述TLR9激動(dòng)劑是含CpG的寡核苷酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述佐劑配制在水包油乳劑或 油包水乳劑中，任選地含有膽固醇和/或維生素E，或者配制在脂質(zhì)體組合物中。
全文摘要
寡核苷酸、引物或探針包含SEQ ID NO.5、6、7、2、3、4、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19或25中任意的核苷酸序列。該類核苷酸可用于基因(特別是MAGE-A3基因)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)。該類核苷酸在用于確定MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)以及用于診斷癌癥、指導(dǎo)治療和選擇治療對(duì)象的引物對(duì)、試劑盒和方法中可用。所述引物或探針可以包含環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)并可以在實(shí)時(shí)甲基化特異PCR中使用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101932723SQ200880117371
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者I·弗拉森布雷克, K·比勞 申請(qǐng)人:腫瘤甲基化科學(xué)公司;葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司