技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種宮頸癌相關(guān)基因甲基化程度的檢測(cè)引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：宮頸癌是全球女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。2008年我國(guó)宮頸癌新發(fā)病例12.19/10萬，位于女性新發(fā)惡性腫瘤第6位；宮頸癌死亡病例3.90/10萬；我國(guó)的宮頸癌均呈現(xiàn)與發(fā)達(dá)國(guó)家相反的、明顯的上升趨勢(shì)。由于已有的研究證實(shí)了高危型人乳頭狀瘤病毒(hpv)感染與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)，因此目前預(yù)防宮頸癌的發(fā)生一般都是通過檢測(cè)女性是否感染了高危型的hpv病毒的角度來進(jìn)行的。2012年美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)(asccp)制定的“宮頸癌預(yù)防及早期診斷篩查指南”指出：如hpv16或hpv16/18陽性則需立即轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查。但臨床證據(jù)表明，只有很少比例的女人感染高危型的hpv病毒后會(huì)發(fā)展到宮頸癌。hpv感染是一種極為常見的病毒感染，高達(dá)75％的女性在其一生中可能感染hpv；但這種感染是多數(shù)一過性的，可自行清除，只有持續(xù)性的高危型hpv感染才可能誘發(fā)宮頸癌前病變；并且即使hpv感染引發(fā)了子宮頸上皮內(nèi)瘤變，真正發(fā)展到宮頸癌的機(jī)率也是很低的。因此就目前通過檢測(cè)hpv病毒，甚至通過病理分析子宮頸上皮內(nèi)瘤變來判斷受檢者患宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，會(huì)導(dǎo)致臨床的過度治療，浪費(fèi)大量的醫(yī)療資源。因此，臨床上急需能夠即時(shí)、準(zhǔn)確，并且費(fèi)用能為患者所承受的精確宮頸癌早篩的技術(shù)出現(xiàn)。基因甲基化是遺傳表觀學(xué)重要的組成部分?；蚣谆悄[瘤發(fā)生過程中的早期事件，是細(xì)胞的遺傳本質(zhì)和外界環(huán)境影響共同作用的結(jié)果?；虻膯?dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化后，往往使得該基因的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，隨之影響了細(xì)胞內(nèi)一系列的分子事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變。因此利用基因的甲基化來早期診斷腫瘤已經(jīng)成為分子檢驗(yàn)的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域；例如通過檢測(cè)septin9基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化診斷試劑盒已經(jīng)得到歐盟、美國(guó)fda，以及中國(guó)fda的批準(zhǔn)，用于早期結(jié)直腸癌篩查。在宮頸癌篩查中，由于能直接收集到宮頸的上皮細(xì)胞，因此通過分析宮頸細(xì)胞中的甲基化程度來早期診斷宮頸癌，較其他內(nèi)臟器官所發(fā)生的腫瘤，在臨床上更容易操作。目前已經(jīng)有眾多研究報(bào)道通過全基因組方法來尋找在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)甲基化，但在正常宮頸細(xì)胞中不發(fā)生甲基化的基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的是提供一種宮頸癌相關(guān)基因甲基化程度的檢測(cè)引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：檢測(cè)靶基因甲基化時(shí)，采取了雙探針定量pcr的方法，即甲基化位點(diǎn)的cpg島同時(shí)針對(duì)c堿基和u堿基設(shè)計(jì)探針(原理參考圖1)，并采用甲基化值來評(píng)估樣本中甲基化dna所占的比例(甲基化程度)。有了甲基化值后，就方便確定閾值來自動(dòng)化區(qū)分發(fā)生癌變和非癌變的臨床樣本。甲基化值＝100/[1+2(ctm-ctu)]，其中ctm是甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值，ctu是非甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值，若ct值>45個(gè)循環(huán)，則默認(rèn)為45。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種宮頸癌相關(guān)基因pax1、fam19a4、phactr3和dapk啟動(dòng)子甲基化程度的檢測(cè)引物，所述的檢測(cè)引物如下所示：針對(duì)pax1基因：pax1-f：5’-ttagggggtagttgagtaagtt-3’(如seqidno.1所示)；pax1-r：5’-aaaataacctataaatccccaaacaa-3’(如seqidno.2所示)；針對(duì)fam19a4基因：fam19a4-f：5’-ttttagtagtagttttaggtttt-3(如seqidno.3所示)’；fam19a4-r：5’-atcccttccaacccttctta-3’(如seqidno.4所示)；針對(duì)phactr3基因：phactr3-f：5’-gttgggggaagagaggtagatt-3’(如seqidno.5所示)；phactr3-r：5’-cttccaaaaacaaatacccaaac-3’(如seqidno.6所示)；針對(duì)dapk基因：dapk-f：5’-ttttggaggtgggaaagttg-3’(如seqidno.7所示)；dapk-r：5’-aaaaacaccctttattaaaactaaac-3’(如seqidno.8所示)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種宮頸癌相關(guān)基因pax1、fam19a4、phactr3和dapk甲基化程度的檢測(cè)探針，所述的檢測(cè)探針如下所示：針對(duì)pax1基因：pax1-m：5’-aaataaaacgcgacgcattat-3’(如seqidno.9所示)；pax1-u：5’-aaataaaacacaacacattataaccc-3’(如seqidno.10所示)；針對(duì)fam19a4基因：fam19a4-m：5’-ccgtaccgcctccccgcgaaaa-3’(如seqidno.11所示)；fam19a4-u：5’-ccataccacctccccacaaaa-3’(如seqidno.12所示)；針對(duì)phactr3基因：phactr3-m：5’-aacccaaaaccgacgctaaacga-3’(如seqidno.13所示)；phactr3-u：5’-aataacccaaaaccaacactaaac-3’(如seqidno.14所示)；針對(duì)dapk基因：dapk-m：5’-accccgcgcgcgcgtaaa-3’(如seqidno.15所示)；dapk-u：5’-acccctcaaccccacacacacat-3’(如seqidno.16所示)；m表示甲基化探針，u表示非甲基化探針，探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，同一基因的甲基化探針和非甲基化探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。所述的熒光報(bào)告基團(tuán)優(yōu)選為fam、tet、vic、hex或rox，所述的熒光淬滅基團(tuán)優(yōu)選為tamra、bhq1、bhq2或mgb。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針的檢測(cè)試劑盒。優(yōu)選，所述的檢測(cè)試劑盒還包括2×premixextaq。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的宮頸癌相關(guān)基因pax1、fam19a4、phactr3和dapk甲基化程度的檢測(cè)方法，包括以下步驟：提取待測(cè)宮頸組織的基因組dna，將提取的基因組dna進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，以亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的基因組dna為模板，分別用針對(duì)pax1基因的上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針、針對(duì)fam19a4基因的上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針、針對(duì)phactr3基因的上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針、針對(duì)dapk基因的上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針進(jìn)行雙探針熒光定量pcr擴(kuò)增，根據(jù)甲基化探針和非甲基化探針的熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)，讀取并記錄甲基化探針的起峰ct值和非甲基化探針的起峰ct值，根據(jù)公式：甲基化值＝100/[1+2(ctm-ctu)]，分別計(jì)算得到pax1、fam19a4、phactr3和dapk基因的甲基化值，其中，ctm為甲基化探針的起峰ct值，ctu為非甲基化探針的起峰ct值。所述的雙探針熒光定量pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)體系優(yōu)選為20μl：包括2×premixextaq10μl、上游引物0.25μm、下游引物0.25μm、甲基化探針0.40μm、非甲基化探針0.40μm和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna模板5μl，其余由水補(bǔ)足至20μl。所述的雙探針熒光定量pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)條件優(yōu)選為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，60℃退火延伸40s，共50個(gè)循環(huán)；4℃保存。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供pax1、fam19a4、phactr3和dapk基因作為輔助診斷宮頸癌生物標(biāo)志物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針在輔助診斷宮頸癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)宮頸組織中pax1、fam19a4、phactr3、dapk四個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度與宮頸癌極顯著相關(guān)，可以作為輔助診斷宮頸癌的生物標(biāo)志物，通過同時(shí)設(shè)計(jì)甲基化探針和非甲基化探針避免了非甲基化dna的影響，結(jié)果更可靠。與常規(guī)的宮頸癌診斷方法相比，本發(fā)明的方法具有快速、靈敏度和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠在早期及時(shí)對(duì)人宮頸癌進(jìn)行診斷，使得早期準(zhǔn)確診斷宮頸癌成為可能，避免了醫(yī)療資源的浪費(fèi)。附圖說明：圖1是甲基化探針和非甲基化探針及引物設(shè)計(jì)的原理參考圖，其中m代表cpg島的c堿基甲基化，u代表cpg島的c堿基非甲基化。圖2是fam19a4基因甲基化的檢測(cè)結(jié)果，a為非宮頸癌組織，b為宮頸癌組織。圖3是宮頸癌組患者和非宮頸癌對(duì)照的宮頸細(xì)胞中的甲基化值分布散點(diǎn)圖。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1：本發(fā)明針對(duì)人pax1、fam19a4、phactr3、dapk四個(gè)基因的甲基化位點(diǎn)的cpg島同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)c堿基(經(jīng)過亞硫酸鹽處理后，甲基化的cpg島的c堿基仍然保持c堿基)的甲基化探針和u堿基(經(jīng)過亞硫酸鹽處理后，沒有甲基化的cpg島的c堿基變成了u堿基)的非甲基化探針及特異性引物。每個(gè)基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，一條甲基化探針和一條非甲基化探針，甲基化探針檢測(cè)甲基化位點(diǎn)，非甲基化探針檢測(cè)非甲基化位點(diǎn)。1、pcr引物設(shè)計(jì)：表1.四個(gè)基因pcr引物序列注：f表示上游引物，r表示下游引物2、探針設(shè)計(jì)：本發(fā)明針對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)一條甲基化探針和一條非甲基化探針。8條探針序列如表2。表2.四個(gè)基因探針序列注：m表示甲基化探針，u表示非甲基化探針3、宮頸組織，和宮頸細(xì)胞刷片dna提取宮頸細(xì)胞刷片和保存液購自廣東潮州凱普生物化學(xué)公司。分別取800μl臨床上經(jīng)過病理已經(jīng)確認(rèn)為宮頸癌患者的宮頸刷片樣本和非宮頸癌對(duì)照人群的宮頸宮頸刷片樣本到1.5ml離心管，12000rpm離心3-5min，去掉上清，收集宮頸細(xì)胞。然后用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的組織基因組dna提取試劑盒提取基因組dna。4、dna的甲基化修飾轉(zhuǎn)化用美國(guó)zymoresearch公司的ezdnamethylation-goldkittm對(duì)基因組dna進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。經(jīng)過亞硫酸鹽處理后，dna中發(fā)生了甲基化的cpg島上的c堿基仍然保持c堿基，而沒有發(fā)生甲基化的cpg島上的c堿基則變成了u堿基，這樣就造成了甲基化的dna和非甲基化的dna的序列差異，可以為后續(xù)的核酸檢測(cè)方法檢出。經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna可以立即使用或放入-20℃保存待用，作為后續(xù)熒光定量pcr反應(yīng)的模板。5、熒光定量檢測(cè)：以步驟4的經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna為模板，用針對(duì)fam19a4基因的引物對(duì)fam19a4-f/fam19a4-r(見表1)及探針fam19a4-m和fam19a4-u(見表2)進(jìn)行熒光定量pcr(qpcr)擴(kuò)增。qpcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見表3和表4。表3.qpcr反應(yīng)體系qpcr反應(yīng)體系組成2×premixextaq(takara公司)10μl上游引物0.25μm(終濃度)下游引物0.25μm(終濃度)甲基化探針0.40μm(終濃度)非甲基化探針0.40μm(終濃度)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna模板5μlddh2o補(bǔ)足到20μl表4.qpcr反應(yīng)條件6、結(jié)果分析在非宮頸癌組織中，fam19a4基因甲基化的檢測(cè)結(jié)果見圖2a，非甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值為29，甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值為45。在宮頸癌組織中，fam19a4基因甲基化的檢測(cè)結(jié)果見圖2b，非甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值為30，甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值為33。代入公式：甲基化值＝100/[1+2(ctm-ctu)]，計(jì)算得到fam19a4基因在非宮頸癌組織中的甲基化值為0.015，在宮頸癌組織中的甲基化值為11.1。實(shí)施例2：按照實(shí)施例1的方法提取20個(gè)宮頸癌患者的宮頸刷片樣本(宮頸癌組)和20個(gè)非宮頸癌對(duì)照人群的宮頸刷片樣本(非宮頸癌組)的基因組dna，然后對(duì)提取的基因組dna進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna作為模板，分別針對(duì)pax1基因的引物對(duì)pax1-f/pax1-r及探針pax1-m和pax1-u、針對(duì)fam19a4基因的引物對(duì)fam19a4-f/fam19a4-r及探針fam19a4-m和fam19a4-u、針對(duì)phactr3基因的引物對(duì)phactr3-f/phactr3-r及探針phactr3-m和phactr3-u、針對(duì)dapk基因的引物對(duì)dapk-f/dapk-r及探針dapk-m和dapk–u(表1和表2)，按照實(shí)施例1的qpcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別進(jìn)行qpcr擴(kuò)增(thermofisher公司的abi7500熒光定量?jī)x器)。根據(jù)4個(gè)基因的甲基化探針和非甲基化探針在qpcr過程中進(jìn)入對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)的起峰ct值，代入公式：甲基化值＝100/[1+2(ctm-ctu)]，分別計(jì)算4個(gè)基因的甲基化值，結(jié)果如表5，以表5的數(shù)據(jù)作圖展示的效果如圖3。表5.宮頸癌組和非宮頸癌組的4個(gè)基因甲基化值的平均值宮頸癌組(20人份)非宮頸癌組(20人份)11.210.4213.40.1234.221.49.560.985.680.8823.30.3212.41.2115.61.133.231.0910.280.0915.60.1833.170.138.680.217.81.3235.470.4522.10.5616.740.6724.390.9943.21.4513.61.16從表5可知，宮頸癌患者的宮頸細(xì)胞中pax1、fam19a4、phactr3和dapk4個(gè)基因甲基化值的平均值達(dá)19.5，極顯著高于非宮頸癌對(duì)照的宮頸細(xì)胞中pax1、fam19a4、phactr3和dapk4個(gè)基因甲基化值的平均值(p﹤0.01)，可見，本發(fā)明能準(zhǔn)確區(qū)分出宮頸癌患者和非宮頸癌對(duì)照，因此，pax1、fam19a4、phactr3和dapk基因可以作為輔助診斷宮頸癌生物標(biāo)志物。我們定義當(dāng)pax1、fam19a4、phactr3和dapk4個(gè)基因甲基化值的平均值>1.8，即log2甲基化值>0.848時(shí)，就懷疑所檢測(cè)的宮頸刷片樣本中含有宮頸癌細(xì)胞，可以通過病理方法對(duì)宮頸細(xì)胞的癌變情況進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>廣州中心法則生物科技有限公司<120>一種宮頸癌相關(guān)基因甲基化程度的檢測(cè)引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用<160>16<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1ttagggggtagttgagtaagtt21<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列<400>2aaaataacctataaatccccaaacaa26<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3ttttagtagtagttttaggtttt23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4atcccttccaacccttctta20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5gttgggggaagagaggtagatt22<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6cttccaaaaacaaatacccaaac23<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ttttggaggtgggaaagttg20<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<400>8aaaaacaccctttattaaaactaaac26<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9aaataaaacgcgacgcattat21<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<400>10aaataaaacacaacacattataaccc26<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11ccgtaccgcctccccgcgaaaa22<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列<400>12ccataccacctccccacaaaa21<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列<400>13aacccaaaaccgacgctaaacga23<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<400>14aataacccaaaaccaacactaaac24<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列<400>15accccgcgcgcgcgtaaa18<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列<400>16acccctcaaccccacacacacat23當(dāng)前第1頁12