本發(fā)明屬于生物技術(shù)的分子生物學檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種同時檢測奶牛β-酪蛋白a1、a2、a3、b、c、e、f、h1和i變體型的引物、方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：鮮牛奶是僅次于人類母乳的營養(yǎng)成分最全面、營養(yǎng)價值最高的液體食品，它含有很多人體必需的氨基酸，被譽為“白色血液”。蛋白約占牛奶比重的3.4％，酪蛋白和乳清蛋白是牛奶的主要兩種蛋白，其中，酪蛋白約占牛奶蛋白的80％，包括alphas1，alphas2，beta，kappa四種類型，而beta酪蛋白(β酪蛋白)約占蛋白質(zhì)總量的30％，是氨基酸的重要來源。β-酪蛋白中含有209個氨基酸，而它至少含有13種不同的氨基酸組成，研究報道β-酪蛋白有a1、a2、a3、b、c、d、e、f、h1、h2、i、g等遺傳變體型。牛奶對人體的生長發(fā)育非常重要，但有的人一喝牛奶就拉肚子。這是什么原因引起的呢？營養(yǎng)專家認為這是因為牛奶中含有乳糖，而有的人又缺乏消化乳糖的酶，該癥狀也被稱為“乳糖不耐癥”。但近些年，國內(nèi)外研究證明a1、b和c等變體型β-酪蛋白是引起人喝牛奶后腹痛、拉肚子等癥狀的又一重要原因。通過蛋白氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)其區(qū)別主要在于β-酪蛋白基因發(fā)生了一個堿基變化，從而導(dǎo)致相應(yīng)位置氨基酸由脯氨酸變成組氨酸。由于該氨基酸的變化，導(dǎo)致牛奶在消化過程中消化酶可在其組氨酸處特異性水解，產(chǎn)生一種由七個氨基酸組成的肽段，被稱為β-酪啡肽(bcm-7)。而a2和a3等變體型β酪蛋白此處氨基酸為脯氨酸，不能夠被相關(guān)酶特異性水解，因此不能夠形成bcm-7?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，bcm-7能穿過胃腸壁進入血液循環(huán)，影響人的消化系統(tǒng)和免疫細胞，并與一些疾病有關(guān)，如ⅰ型糖尿病、消化系統(tǒng)疾病、免疫功能紊亂、呼吸功能障礙和突然性嬰兒死亡綜合征等。目前，新西蘭a2有限公司掌握著a2型β-酪蛋白的篩選檢測技術(shù)，并已在中國的京東和淘寶等大型互聯(lián)網(wǎng)電商平臺銷售a2platinum白金嬰幼兒配方奶粉系列產(chǎn)品，也在積極拓展在北美及亞洲的其他國際市場。乳業(yè)是一個國家發(fā)達程度和食品消費水平的重要標志，未來乳業(yè)將更加注重質(zhì)量型的發(fā)展，a2奶將會更多地受到消費者的青睞。因此，開展適合國內(nèi)a2型β-酪蛋白荷斯坦牛種質(zhì)創(chuàng)新關(guān)鍵技術(shù)的研究，定向培育具有a2型的荷斯坦優(yōu)質(zhì)種子母牛和種公牛，加大a2奶的市場供應(yīng)，對提升中國乳業(yè)行業(yè)發(fā)展具有重要的意義和推動作用。因此，有必要建立一種準確、快速、低成本區(qū)分不同變體型β-酪蛋白奶牛的方法。檢測牛乳蛋白多態(tài)性的方法主要分為蛋白和分子水平進行分析。在蛋白水平檢測方面，劉建新等人(高效液相色譜法分析中國荷斯坦奶牛乳蛋白多態(tài)性，《中國食品學報》第12卷第10期，2012年)報道了通過反向高效液相色譜法分析中國荷斯坦奶牛乳蛋白多態(tài)性的方法，并成功檢測了牛乳中包括a1、a2、a3、b、c、d、e多種分型的β-cn，從而為比較不同地區(qū)奶牛的差異和牛乳的加工選擇提供科學依據(jù)。在分子水平檢測方面，中國發(fā)明專利cn105219839a和cn105018582a均公開了一種檢測β-酪蛋白基因型的方法，是利用特異性引物進行pcr，擴增片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的條帶結(jié)果進行a1和a2型的β-酪蛋白分型，發(fā)明人前期也研究過該類方法(cn105925717a)，發(fā)現(xiàn)該方法成本較高、假陽性率高(后期仍需要進行測序確認)、檢測通量小，只能區(qū)分a1和a2兩種β-酪蛋白型；而cn105018581a公布的一種基于測序法檢測β-酪蛋白基因型的方法，該方法通過pcr擴增基因部分序列片段，仍只能區(qū)分有限的幾種β-酪蛋白基因型，dna直接測序的方法雖然準確性好但其應(yīng)用成本較高；中國發(fā)明專利cn105861671a公開的方法也只是針對a1和a2兩種β-酪蛋白型進行檢測，同時需要利用質(zhì)譜儀進行檢測，檢測過程復(fù)雜、成本較高。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)明人為了更準確、高效的評估奶牛的β-酪蛋白不同變體型，經(jīng)過仔細的甄別篩選和大量的試驗，得到了能夠用于同時檢測β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)的一組專用高效引物及其試劑盒。所述檢測方法及其試劑盒的特異性強、靈敏度高，能夠快速、準確的檢測不同β-酪蛋白變體型奶牛，而且可以一次實驗同時檢測幾百份奶牛樣品，通量高。具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：首先，本發(fā)明的目的之一在于提供同時檢測奶牛β-酪蛋白不同變體型的一組專用引物，包括多重pcr擴增引物和多重連接酶檢測反應(yīng)探針，所述多重pcr擴增引物的序列如seqidno:1-seqidno:4所示；多重連接酶檢測反應(yīng)探針的序列seqidno:5-seqidno:28所示。其次，本發(fā)明的目的之二在于提供同時檢測奶牛β-酪蛋白不同變體型的專用試劑盒，所述試劑盒包括多重pcr擴增體系和多重連接酶檢測反應(yīng)體系，多重pcr擴增體系包括上述多重pcr擴增引物混合溶液(primermix)；多重連接酶檢測反應(yīng)體系包括上述多重連接酶檢測反應(yīng)探針混合溶液(probemix)。具體的，多重pcr擴增體系包括上述多重pcr擴增引物混合溶液(primermix)、dntp、taq酶、mg2+、pcrbuffer、ddh2o；多重連接酶檢測反應(yīng)體系包括上述多重連接酶檢測反應(yīng)探針混合溶液(probemix)，taqdnaligase、ddh2o、連接酶檢測反應(yīng)buffer。優(yōu)選的，多重pcr擴增體系采用20μl反應(yīng)體系，組成為：2μlprimermix(0.5pm)、2μldntp(2mm/each)、0.2μltaq酶(1μ)、0.6μlmg2+(3mm)、2μlbuffer(1×)、12.2μlddh2o；多重連接酶檢測反應(yīng)體系采用10μl反應(yīng)體系，組成為：1μlbuffer(1×)、1μlprobemix(each)(2pmol/μl)、0.05μltaqdnaligase(2μ)、4μlddh2o。優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包括dna提取試劑和/pcr產(chǎn)物純化試劑。進一步的，本發(fā)明的目的之三在于提供一種檢測β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)奶牛的方法，包括如下步驟：(1)采用上述多重pcr擴增引物，對奶牛dna進行多重pcr擴增；(2)以多重pcr擴增產(chǎn)物為模板，利用上述多重連接酶檢測反應(yīng)探針，進行多重連接酶檢測反應(yīng)；(3)檢測不同snp位點，獲得β-酪蛋白變體型。優(yōu)選的，所述奶牛dna可以從含有有核細胞的任何組織中得到，該組織優(yōu)選為該奶牛的血液、精液、毛發(fā)或奶。優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)中，利用特異性引物進行多重pcr擴增的步驟，如下：所述多重pcr擴增采用20μl反應(yīng)體系，組成為：1μldna(50ng/μl)、2μlprimermix(0.5pm)、2μldntp(2mm/each)、0.2μltaq酶(1μ)、0.6μlmg2+(3mm)、2μlbuffer(1×)、12.2μlddh2o。所述多重pcr擴增條件為：先95℃2min；接著94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40個循環(huán)；最后65℃10min。步驟(2)中，以多重pcr擴增產(chǎn)物為模板，熒光探針引物進行多重連接酶檢測反應(yīng)，對snp位點分型的步驟，如下：所述多重連接酶檢測反應(yīng)擴增采用10μl反應(yīng)體系，組成為：1μlbuffer(1×)、1μlprobemix(each)(2pmol/μl)、0.05μltaqdnaligase(2μ)、4μlddh2o、4μl多重pcr產(chǎn)物。所述多重連接酶檢測反應(yīng)的條件為：先95℃2min；接著94℃15s，50℃25s，此步40個循環(huán)。步驟(3)中，通過測序儀(如abi3730測序儀)，掃描鏈接反應(yīng)所產(chǎn)生的片段長度(電泳時存在少許的位移，最終snp位點的大小與設(shè)計長度會有少許差異，根據(jù)軟件提示進行調(diào)整)，應(yīng)用genemapper軟件實現(xiàn)對snp位點不同基因型檢測的目的。此外，本發(fā)明的目的之四在于提供一種生產(chǎn)β-酪蛋白a2牛奶的方法，步驟包括：(1)根據(jù)前述檢測方法，確定奶牛的β-酪蛋白變體型；(2)選擇只具有編碼β-酪蛋白a2基因的奶牛；(3)對篩選的奶牛進行擠奶。優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)可以是針對奶牛胚胎、幼體或成體。在一個具體實施方案中，步驟(3)的擠奶之前還包括對奶牛進行繁育直至生產(chǎn)或/及形成所需要的生產(chǎn)種群的步驟。優(yōu)選的，在另一實施方案中，還包括步驟(4)的對奶進行加工制成奶制品。在上述所有實施方案中，所述奶牛優(yōu)選為中國荷斯坦奶牛。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的檢測方法可同時檢測β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)，并且可同時檢測樣品通量高、準確性高、費用低。而且開發(fā)出檢測試劑盒，使操作更加簡便、快捷，這一發(fā)明可以早期檢測不同β-酪蛋白不同變體型的荷斯坦奶牛，消除a1、b和c等變體型奶牛導(dǎo)致的養(yǎng)牛業(yè)損失，篩選出a2型荷斯坦種公牛和種子母牛。這一發(fā)明是奶牛分子遺傳育種在生產(chǎn)實踐上的一次很好應(yīng)用，能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟和社會效益。附圖說明圖1：多重pcr擴增產(chǎn)物的3％瓊脂糖凝膠電泳圖圖2：利用3730xl與genemapper檢測不同snp位點圖具體實施方式結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明，以下實例僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。如果實施例中未注明的實驗具體條件，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑公司所推薦的條件；下述實施例中所用的試劑、耗材等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明公開了同時檢測奶牛β-酪蛋白不同變體型的一組專用引物，包括多重pcr擴增引物和多重連接酶檢測反應(yīng)探針，所述多重pcr擴增引物的序列如下表1所示：表1引物序列(5’-3’)序列編號ggaatctattacacgcatcaaseqidno.1ttgcactgacatttatattaccaseqidno.2gcccagacacagtctctagtcseqidno.3tgaatgggcatatctctctgseqidno.4多重連接酶檢測反應(yīng)探針的序列如下表2所示：表2引物序列(5’-3’)序列編號ttttttttttttttttttttttttttgaaaattgagaagtttcagagtgseqidno.5ttttttttttttttttttttttttttttgaaaattgagaagtttcagagtaseqidno.6p-aggaacagcagcaaacagagtttttttttttttttttttttttttttt-famseqidno.7ttttttttttttttttattacctctgtttgctgctgtttseqidno.8ttttttttttttttttttattacctctgtttgctgctgttcseqidno.9p-ctcactctgaaacttctcaatttttttttttttttttt-famseqidno.10ttttttttttttttttttttttttttttttgatgttttgtgggaggctgttatseqidno.11ttttttttttttttttttttttttttttttttgatgttttgtgggaggctgttagseqidno.12p-ggatgggtccagggaagggatttttttttttttttttttttttttttttttt-famseqidno.13ttttttttttttttttttttactcccattacttcaggctgaatseqidno.14ttttttttttttttttttttttactcccattacttcaggctgaagseqidno.15p-gaaaggcggcaccaccacagtttttttttttttttttttttt-famseqidno.16tttttttttttttttttttccttcactttggagactcccatseqidno.17tttttttttttttttttttttccttcactttggagactcccagseqidno.18p-tacttcaggctgaaggaaagtttttttttttttttttttt-famseqidno.19ttttttttttttttttttttttaggaggctatggctcctaagcacseqidno.20ttttttttttttttttttttttttaggaggctatggctcctaagcaaseqidno.21p-aaagaaatgcccttccctaatttttttttttttttttttttttt-famseqidno.22ttttttttttttttttttttttttcatcagtgagagtcaggctctggseqidno.23ttttttttttttttttttttttttttcatcagtgagagtcaggctctgcseqidno.24p-ctttcagtaaagggctcaactttttttttttttttttttttttttt-famseqidno.25ttttttttttttttttttttttttttttaggaggaaacatgacagttggaaseqidno.26ttttttttttttttttttttttttttttttaggaggaaacatgacagttggagseqidno.27p-gaagaggctggtgaggctggtttttttttttttttttttttttttttttt-famseqidno.28本發(fā)明還公開了同時檢測奶牛β-酪蛋白不同變體型的專用試劑盒，所述試劑盒包括多重pcr擴增體系和多重連接酶檢測反應(yīng)體系，多重pcr擴增體系包括上述多重pcr擴增引物混合溶液(primermix)；多重連接酶檢測反應(yīng)體系包括上述多重連接酶檢測反應(yīng)探針混合溶液(probemix)。具體的，多重pcr擴增體系包括上述多重pcr擴增引物混合溶液(primermix)、dntp、taq酶、mg2+、pcrbuffer、ddh2o；多重連接酶檢測反應(yīng)體系包括上述多重連接酶檢測反應(yīng)探針混合溶液(probemix)，taqdnaligase、ddh2o、連接酶檢測反應(yīng)buffer。優(yōu)選的，多重pcr擴增體系采用20μl反應(yīng)體系，組成為：2μlprimermix(0.5pm)、2μldntp(2mm/each)、0.2μltaq酶(1μ)、0.6μlmg2+(3mm)、2μlbuffer(1×)、12.2μlddh2o；多重連接酶檢測反應(yīng)體系采用10μl反應(yīng)體系，組成為：1μlbuffer(1×)、1μlprobemix(each)(2pmol/μl)、0.05μltaqdnaligase(2μ)、4μlddh2o。優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包括dna提取試劑和/pcr產(chǎn)物純化試劑。本發(fā)明建立了多重pcr聯(lián)合多重連接酶檢測反應(yīng)來同時檢測β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)的方法，奶牛β-酪蛋白不同變體型不僅僅為a1/a2型，現(xiàn)有的檢測方式也多把a3/h1/i突變型誤歸為a2型，把b/c/f誤歸為a1型，實際應(yīng)用過程中對于定向培育具有a2型的荷斯坦優(yōu)質(zhì)種子母牛和種公牛造成了諸多干擾。發(fā)明人針對現(xiàn)有的檢測方式，考慮β-酪蛋白不同變體型同一檢測的可行性進行分析，提出了本發(fā)明。本發(fā)明的引物序列設(shè)計思路為：基于奶牛β-酪蛋白基因序列(參考序列：ensbtat00000003409)，結(jié)合β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)共發(fā)生的8個snp位點(c.151g>a、c.154g>a、c.245c>a、c.307c>a、c.322a>c、c.363c>a、c.411c>g、c.500c>t)(不同snp位點和β-酪蛋白不同變體型的關(guān)系，見下表3)，設(shè)計兩對特異性引物(primermix)進行多重pcr擴增出8個snp位點所在的目的dna片段，再對每個snp位點設(shè)計3條探針引物(probemix)，其中在snp位點一側(cè)設(shè)計2條特異性檢測探針(每條探針的3’端與突變位點的一種基因型互補)，在另一側(cè)設(shè)計一條與模板完全匹配的熒光標記探針，然后在連接酶的作用下，以擴增的多重pcr產(chǎn)物為模板，當兩側(cè)的探針與目的dna序列完全互補時鏈接反應(yīng)才能進行，最后通過abi3730xl測序儀，掃描鏈接反應(yīng)所產(chǎn)生的片段長度，實現(xiàn)對不同snp位點檢測的目的。多重pcr雖然現(xiàn)有存在多種snp的檢測技術(shù)，但引物設(shè)計仍是基因分型成功的關(guān)鍵因素。本發(fā)明中，多重pcr擴增的特異性、準確性和擴增效率是本發(fā)明面臨的第一個難題。β-酪蛋白基因含有九個內(nèi)含子，發(fā)明人設(shè)計擴增β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)，首先需要滿足擴增的覆蓋度，在考慮常規(guī)引物設(shè)計原則(包括引物長度、引物的熔解溫度、引物退火溫度、gc含量、二級結(jié)構(gòu)、3’末端穩(wěn)定性)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人著重考慮兩點指標要求：一是高靈敏度和特異性，二是擴增效率。發(fā)明人借助引物設(shè)計工具(如primer3)來輔助完成引物設(shè)計，對引物設(shè)計工具給出的前20對引物進行篩選(分兩段序列分別設(shè)計引物，各取前10對引物序列)，并結(jié)合引物二聚體和發(fā)夾分析軟件，分析該20對引物的二級結(jié)構(gòu)情況，篩選獲得4對引物(β-酪蛋白外顯子5-6的擴增引物2對，外顯子7的擴增引物2對)，然后進行2×2交叉進行驗證，僅有2對引物(如序列表1)可以同時擴增獲得β-酪蛋白外顯子5-6和外顯子7(即覆蓋β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)區(qū)域)，發(fā)明人后續(xù)分析，造成多重pcr高靈敏度引物篩選的一個主要障礙，采用pcr擴增一直是潛在的錯誤擴增和引物二聚體的指數(shù)增長，在相同的反應(yīng)混合物中通常使用較多的pcr引物，本發(fā)明引物配對，尤其是seqidno:2位于內(nèi)含子6具有極佳的特異性，使得其限制引物二聚體和短期異常擴增。此外，由于多重pcr要求在同一反應(yīng)體系中進行多個位點的特異性擴增，其并非單一pcr的簡單混合，本發(fā)明除了對引物設(shè)計序列進行優(yōu)化和篩選(減少引物互補和配對幾率，降低錯誤擴增和引物二聚體增長)外，還對引物的濃度比例條件進行了摸索實驗和優(yōu)化，以達到各位點平衡和擴增效率的提升，試驗中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將序列表1所示引物等量加入進行擴增，相對來說seqidno:1-2引物對擴增明顯占優(yōu)勢，當其相對于seqidno:3-4引物對濃度比達到3:1時，419bp片段(seqidno:3-4引物對擴增產(chǎn)物)丟失了，無法擴增獲得；可有效擴增時，seqidno:1-2引物對與seqidno:3-4引物對濃度比范圍1:2-1:1。表3多重連接酶檢測反應(yīng)本發(fā)明對每個snp位點在一側(cè)設(shè)計2條特異性檢測探針(每條探針的3’端與突變位點的一種基因型互補)，另一側(cè)設(shè)計一條與模板完全匹配的熒光標記探針，以多重pcr擴增產(chǎn)物為模板，進行多重連接酶檢測反應(yīng)，然而由于本發(fā)明β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)位點距離近，尤其是c.151g>a和c.154g>a、c.307c>a和c.322a>c，這對本發(fā)明一管同時檢測8個β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)位點造成了極大困難。發(fā)明人除了對熒光探針增加磷酸化位點增強其特異性、對檢測探針與模板的配對堿基進行數(shù)量優(yōu)化外，還引入了基因模板正義鏈和反義鏈交叉反向設(shè)計檢測探針的策略。發(fā)明人進行分析發(fā)現(xiàn)，8個β-酪蛋白不同變體型(a1，a2，a3，b，c，e，f，h1，i)覆蓋區(qū)域模板的正義鏈設(shè)計連接酶檢測反應(yīng)探針，其幾個位點均極易形成不同引物聚合，影響一管同時檢測的特異性，而根據(jù)反義鏈設(shè)計連接酶檢測反應(yīng)探針，其引物聚合度更低，進一步的，針對距離近位點(c.151g>a和c.154g>a、c.363c>a)的探針設(shè)計額外進行調(diào)整，最終形成了針對正義鏈設(shè)計c.151g>a、c.363c>a連接酶檢測反應(yīng)探針，針對反義鏈設(shè)計c.154g>a、c.245c>a、c.307c>a、c.322a>c、c.411c>g、c.500c>t連接酶檢測反應(yīng)探針，并最終通過實驗驗證確認，該策略特異性和擴增效率極好。實施例1：檢測不同變體型β-酪蛋白奶牛的方法構(gòu)建1.多重pcr擴增引物設(shè)計與條件優(yōu)化根據(jù)ensembl數(shù)據(jù)庫中β-酪蛋白基因序列(參考序列：ensbtat00000003409)，并結(jié)合β-酪蛋白不同變體型所含的snp突變序列信息(c.151g>a、c.154g>a、c.245c>a、c.307c>a、c.322a>c、c.363c>a、c.411c>g、c.500c>t)，設(shè)計兩對多重pcr擴增引物擴增snp位點所在片段。具體如下：(1)從荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取牛的dna；(2)采用兩對引物對目的基因進行多重pcr擴增；經(jīng)試驗優(yōu)化篩選確定以下序列(表4)作為檢測β-酪蛋白不同變體型奶牛的多重pcr擴增引物：表4對影響多重pcr擴增反應(yīng)的幾個條件進行優(yōu)化，包括體系組成、試劑濃度、引物退火溫度、反應(yīng)時間、循環(huán)數(shù)等，觀察其對檢測結(jié)果的影響，確定最佳擴增反應(yīng)體系和擴增條件。以下所述的多重pcr反應(yīng)體系和條件進行反應(yīng)的擴增效率和引物特異性最高。結(jié)果表明最優(yōu)的多重pcr擴增20μl反應(yīng)體系為：1μldna(50ng/μl)、2μlprimermix(0.5pm)、2μldntp(2mm/each)、0.2μltaq酶(1μ)、0.6μlmg2+(3mm)、2μlbuffer(1×)、12.2μlddh2o。結(jié)果表明最優(yōu)的多重pcr反應(yīng)條件為：先95℃2min；接著94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40個循環(huán)；最后65℃10min。2.多重連接酶檢測反應(yīng)探針引物設(shè)計與條件優(yōu)化經(jīng)多重連接酶檢測反應(yīng)探針引物組合對目的基因進行擴增后，再針對每個snp位點(c.151g>a、c.154g>a、c.245c>a、c.307c>a、c.322a>c、c.363c>a、c.411c>g、c.500c>t)設(shè)計3條引物，包括在snp位點一側(cè)設(shè)計2條特異性檢測探針(每條探針的3’端與突變位點的一種基因型互補)，在snp的另一側(cè)設(shè)計1條與模板完全匹配的熒光標記探針，探針序列的5端堿基磷酸化(p)，且3端帶有6-羧基熒光素(fam)報告基團，所述熒光標記探針引物的序列如下表5所示：表53.對影響多重連接酶檢測反應(yīng)的條件進行優(yōu)化，包括體系組成、試劑濃度、溫度、時間、循環(huán)數(shù)等，觀察其對檢測結(jié)果的影響，確定最佳擴增反應(yīng)體系和擴增條件。優(yōu)化多重連接酶檢測反應(yīng)擴增體系和擴增條件后，然后在連接酶的作用下，當兩側(cè)的探針與目的dna序列完全互補時鏈接反應(yīng)才能進行，取1μl多重連接酶檢測反應(yīng)產(chǎn)物與0.6μlabigs-500rox熒光標記分子量標準和10μlhidi上樣液混合，95℃加熱變性2分鐘，冰中驟冷通過abi3730測序儀，掃描鏈接反應(yīng)所產(chǎn)生的片段長度，應(yīng)用genemapper軟件實現(xiàn)對snp位點不同基因型檢測的目的。優(yōu)化的多重連接酶檢測反應(yīng)擴增體系和擴增條件，如下：優(yōu)化的多重連接酶檢測反應(yīng)擴增采用10μl反應(yīng)體系，組成為：1μlbuffer(1×)、1μlprobemix(each)(2pmol/μl)、0.05μltaqdnaligase(2μ)、4μlddh2o、4μl多重pcr產(chǎn)物。優(yōu)化的多重連接酶檢測反應(yīng)的條件為：先95℃2min；接著94℃15s，50℃25s，此步40個循環(huán)。實施例2：用于檢測不同變體型β-酪蛋白奶牛的試劑盒試劑盒的組成包括：primermix、probemix(each)、taq酶、taqdnaligase、dntp、mg2+、buffer、ddh2o。多重pcr引物組為實施例1中篩選優(yōu)化得到的，其序列為表1所示；多重連接酶檢測反應(yīng)探針引物組為實施例1中篩選優(yōu)化得到的，其序列為表2所示；采用該試劑盒進行臨床檢測的檢測方法為：(1)從荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取牛的dna；(2)采用兩對引物對目的基因進行多重pcr擴增；多重pcr擴增采用20μl反應(yīng)體系，組成為：1μldna(50ng/μl)、2μlprimermix(0.5pm)、2μldntp(2mm/each)、0.2μltaq酶(1μ)、0.6μlmg2+(3mm)、2μlbuffer(1×)、12.2μlddh2o。多重pcr擴增的條件為：先95℃2min；接著94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40個循環(huán)；最后65℃10min。(3)對pcr擴增產(chǎn)物進行多重連接酶檢測反應(yīng)；多重連接酶檢測反應(yīng)擴增采用10μl反應(yīng)體系，組成為：1μlbuffer(1×)、1μlprobemix(each)(2pmol/μl)、0.05μltaqdnaligase(2μ)、4μlddh2o、4μl多重pcr產(chǎn)物。多重連接酶檢測反應(yīng)條件為：先95℃2min；接著94℃15s，50℃25s，此步40個循環(huán)。(4)檢測反應(yīng)在taqdnaligase作用下，當兩側(cè)的探針與目的dna序列完全互補時鏈接反應(yīng)才能進行，否則連接反應(yīng)不能進行，通過abi3730xl測序儀，掃描鏈接反應(yīng)所產(chǎn)生的片段長度，應(yīng)用genemapper軟件實現(xiàn)對snp位點不同基因型檢測的目的。實施例3：試劑盒的特異性和重復(fù)性檢測以經(jīng)過直接測序鑒定的β-酪蛋白不同變體型奶牛為檢測對象，采用實施例2的試劑盒進行檢測，都能夠特異性檢出不同變體型，進一步通過測序確認，其準確率達100％。表明本發(fā)明試劑盒中的引物、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及檢測方法準確、有效、特異性強。以已知不同變體型β-酪蛋白奶牛為檢測對象，采用本發(fā)明的試劑盒進行多次重復(fù)試驗，重復(fù)性檢測的結(jié)果均一致，表明本發(fā)明的試劑盒具有穩(wěn)定性。為驗證試劑盒檢測靈敏度，本發(fā)明將β-酪蛋白基因5-6號外顯子和內(nèi)含子、7號外顯子(共約1.9kb)構(gòu)建到t載體上，利用本發(fā)明試劑盒進行檢測，當dna大于104拷貝數(shù)/ml時，均可以檢測到突變，這說明本發(fā)明的引物和探針的特異性和靈敏度極高。實施例4：奶牛臨床樣本的檢測采用本發(fā)明實施例2的試劑盒檢測104頭荷斯坦奶牛。根據(jù)上述發(fā)明的試劑盒，利用如下步驟檢測不同變體型β-酪蛋白奶牛。(1)提取104頭牛的荷斯坦牛血液dna；(2)多重pcr反應(yīng)體系：1μldna(50ng/μl)、2μlprimermix(0.5pm)、2μldntp(2mm/each)、0.2μltaq酶(1μ)、0.6μlmg2+(3mm)、2μlbuffer(1×)、12.2μlddh2o。多重pcr擴增條件為：先95℃2min；接著94℃30s，59℃90s，65℃1min，此步40個循環(huán)；最后65℃10min。(3)多重連接酶檢測反應(yīng)體系：1μlbuffer(1×)、1μlprobemix(each)(2pmol/μl)、0.05μltaqdnaligase(2μ)、4μlddh2o、4μl多重pcr產(chǎn)物。多重連接酶檢測反應(yīng)條件為：先95℃2min；接著94℃15s，50℃25s，此步40個循環(huán)。(4)檢測反應(yīng)完成后，通過abi3730xl測序儀，掃描鏈接反應(yīng)所產(chǎn)生的片段長度，檢測β-酪蛋白的不同變體型?；蚍中团c結(jié)果分析：不同變體型β-酪蛋白奶牛的分型結(jié)果，結(jié)果如下表6和圖2所示?？偣矊?04頭荷斯坦奶牛進行了檢測，其中27頭a2/a2型、45頭a2/a1型、1頭a2/a3、4頭a2/b、1頭a2/f、8頭a2/i、10頭a1/a1、1頭a1/a3、2頭a1/b、5頭a1/i。表6牛β-酪蛋白分型結(jié)果。sequencelisting<110>山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心<120>同時檢測奶牛β-酪蛋白不同變體型的一組專用引物及其試劑盒<130>2017<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1ggaatctattacacgcatcaa21<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2ttgcactgacatttatattacca23<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3gcccagacacagtctctagtc21<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tgaatgggcatatctctctg20<210>5<211>49<212>dna<213>人工序列<400>5ttttttttttttttttttttttttttgaaaattgagaagtttcagagtg49<210>6<211>51<212>dna<213>人工序列<400>6ttttttttttttttttttttttttttttgaaaattgagaagtttcagagta51<210>7<211>48<212>dna<213>人工序列<400>7p-aggaacagcagcaaacagagtttttttttttttttttttttttttttt-fam48<210>8<211>39<212>dna<213>人工序列<400>8ttttttttttttttttattacctctgtttgctgctgttt39<210>9<211>41<212>dna<213>人工序列<400>9ttttttttttttttttttattacctctgtttgctgctgttc41<210>10<211>38<212>dna<213>人工序列<400>10p-ctcactctgaaacttctcaatttttttttttttttttt-fam38<210>11<211>53<212>dna<213>人工序列<400>11ttttttttttttttttttttttttttttttgatgttttgtgggaggctgttat53<210>12<211>55<212>dna<213>人工序列<400>12ttttttttttttttttttttttttttttttttgatgttttgtgggaggctgttag55<210>13<211>52<212>dna<213>人工序列<400>13p-ggatgggtccagggaagggatttttttttttttttttttttttttttttttt-fam52<210>14<211>43<212>dna<213>人工序列<400>14ttttttttttttttttttttactcccattacttcaggctgaat43<210>15<211>45<212>dna<213>人工序列<400>15ttttttttttttttttttttttactcccattacttcaggctgaag45<210>16<211>42<212>dna<213>人工序列<400>16p-gaaaggcggcaccaccacagtttttttttttttttttttttt-fam42<210>17<211>41<212>dna<213>人工序列<400>17tttttttttttttttttttccttcactttggagactcccat41<210>18<211>43<212>dna<213>人工序列<400>18tttttttttttttttttttttccttcactttggagactcccag43<210>19<211>40<212>dna<213>人工序列<400>19p-tacttcaggctgaaggaaagtttttttttttttttttttt-fam40<210>20<211>45<212>dna<213>人工序列<400>20ttttttttttttttttttttttaggaggctatggctcctaagcac45<210>21<211>47<212>dna<213>人工序列<400>21ttttttttttttttttttttttttaggaggctatggctcctaagcaa47<210>22<211>44<212>dna<213>人工序列<400>22p-aaagaaatgcccttccctaatttttttttttttttttttttttt-fam44<210>23<211>47<212>dna<213>人工序列<400>23ttttttttttttttttttttttttcatcagtgagagtcaggctctgg47<210>24<211>49<212>dna<213>人工序列<400>24ttttttttttttttttttttttttttcatcagtgagagtcaggctctgc49<210>25<211>46<212>dna<213>人工序列<400>25p-ctttcagtaaagggctcaactttttttttttttttttttttttttt-fam46<210>26<211>51<212>dna<213>人工序列<400>26ttttttttttttttttttttttttttttaggaggaaacatgacagttggaa51<210>27<211>53<212>dna<213>人工序列<400>27ttttttttttttttttttttttttttttttaggaggaaacatgacagttggag53<210>28<211>50<212>dna<213>人工序列<400>28p-gaagaggctggtgaggctggtttttttttttttttttttttttttttttt-fam50當前第1頁12