本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域，具體地，涉及一種快速鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中重要的遺傳育種技術(shù)之一，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中，若外源基因隨機(jī)插入動(dòng)物基因組中，插入拷貝數(shù)和位點(diǎn)都不確定，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后代育種時(shí)，后代會(huì)出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因遺傳不穩(wěn)定或表達(dá)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自交群體由雜合子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、純合子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、同胞非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組成，只有純合子轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物才能穩(wěn)定遺傳，而不會(huì)出現(xiàn)性狀分離現(xiàn)象，也只有純合子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物才能作為侯選的優(yōu)良育種材料。因此，如何快速、準(zhǔn)確地鑒定和篩選出純合子轉(zhuǎn)基因羊是轉(zhuǎn)基因羊育種的關(guān)鍵之一。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物純合子鑒定方法常為southern雜交法，southern雜交法是分子生物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，cgh、fish等方法也常用于轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)及純合子的分析(larramendymletal,1998；kallioniemiaetal,1996；armourjaetal,2000)。但上述方法存在一定缺陷，工作量大、周期長、步驟繁多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。southern方法在基因組酶切消化不徹底的情況下會(huì)對插入基因拷貝數(shù)產(chǎn)生誤判，同時(shí)在該實(shí)驗(yàn)過程中涉及放射性同位素等具有潛在危險(xiǎn)性的藥品，對發(fā)生重排的外源基因檢測的精度不夠等(wenghbetal,2004)。近年來，利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法來進(jìn)行外源基因定量檢測的方法迅速發(fā)展起來，而實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測結(jié)果和southern雜交法的檢測結(jié)果接近(inghamdjetal，2001；songpetal,2002)操作更簡單易行。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr在實(shí)際應(yīng)用中該方法主要體現(xiàn)在兩種方式上:一種是利用已知外源基因拷貝數(shù)的基因組作為標(biāo)準(zhǔn)品,通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行絕對定量；另一種則是以基因組上已知拷貝數(shù)的內(nèi)源基因作為內(nèi)參,通過相對定量法來確定外源基因的拷貝數(shù)。在應(yīng)用絕對定量法來檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)時(shí)，基因組 dna與標(biāo)準(zhǔn)品的絕對定量的誤差等可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定與較大的誤差。而目前的相對定量法在構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)多為將內(nèi)參基因與目的基因分別構(gòu)建陽性質(zhì)粒，這種方法造成陽性質(zhì)粒中基因的拷貝數(shù)無法精確定量，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確并大大增加了工作量。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種能夠克服上述已有技術(shù)缺陷，并且能夠快速鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的鑒定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的鑒定方法。

本發(fā)明的另一目的是在于提供了一種純合子轉(zhuǎn)基因羊在轉(zhuǎn)基因羊純系建立和轉(zhuǎn)基因羊新品種培育中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面提供了一種用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的特異性引物對，所述引物對包括擴(kuò)增prp基因的第一引物對，所述第一引物對包括上游引物和下游引物：

上游引物prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；

下游引物prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)。

在另一優(yōu)選例中，所述prp基因?yàn)閮?nèi)參基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一引物對的上游引物的長度為15-30個(gè)堿基，較佳地為17-25個(gè)堿基。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一引物對的下游引物的長度為15-30個(gè)堿基，較佳地為17-25個(gè)堿基。

在另一優(yōu)選例中，所述引物對還包括擴(kuò)增hlz(人溶菌酶)基因的第二引物對，所述第二引物對包括上游引物和下游引物：

上游引物hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

下游引物hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二引物對的上游引物的長度為15-30個(gè)堿基，較佳地為17-25個(gè)堿基。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二引物對下游引物的長度為15-30個(gè)堿基，較佳地為17-25個(gè)堿基。

在另一優(yōu)選例中，所述第一引物對和所述第二引物對帶有可檢測標(biāo)記。

本發(fā)明第二方面提供了一種用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的特異性引物對組 合，包括擴(kuò)增prp基因的第一引物對，所述第一引物對包括上游引物和下游引物：

(i)prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)；和

擴(kuò)增hlz基因的第二引物對，所述第二引物對包括上游引物和下游引物：

(ii)hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

本發(fā)明第三方面提供了一種用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的第一引物對，所述引物對包括擴(kuò)增prp基因的特異性引物對：

prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；和

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)；

以及使用說明書。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括(b)第二容器，以及位于所述容器內(nèi)的用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的第二引物對，所述引物對包括擴(kuò)增hlz基因的特異性引物對：

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；和

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包含以下組分：dna聚合酶、pcr緩沖液、mg²⁺、dntp、和蒸餾水。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括a盒和b盒，其中，

a盒為標(biāo)本處理單元，包括所述dna抽提試劑盒；

b盒為核酸擴(kuò)增檢測單元，包括dna聚合酶、pcr緩沖液、mg²⁺、dntp、蒸餾水等。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有任選的pcr檢測相關(guān)試劑，如premixextaq、roxreferencedyeⅱ、蒸餾水。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr檢測相關(guān)試劑為premixextaq。

本發(fā)明第四方面提供了一種本發(fā)明第一方面所述引物對或本發(fā)明第二方面所述引物對組合的用途，用于制備試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒用于(i)鑒定和篩選純合子的轉(zhuǎn)基因羊；和/或(ii)檢測hlz基因在純合子轉(zhuǎn)基因羊基 因組中的拷貝數(shù)。

在另一優(yōu)選例中，所述檢測為實(shí)時(shí)定量pcr雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測。

本發(fā)明第五方面提供了一種鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的方法，包括步驟：

(a)提供一待測樣本，所述待測樣本含有轉(zhuǎn)基因羊的基因組dna；

(b)在第一反應(yīng)體系中，以所述待測樣本為模板，用所述第一引物對擴(kuò)增所述待測樣本中的內(nèi)參基因，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；并在第二反應(yīng)體系中，以所述待測樣本為模板，用所述第二引物對擴(kuò)增所述待測樣本中的外源目的基因，獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物；

(c)比較所述外源目的基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物和所述內(nèi)參基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)值，從而判斷所述待測樣本是否為純合子的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，所述第一引物對包括上游引物和下游引物：

上游引物prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；

下游引物prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)。

在另一優(yōu)選例中，所述第二引物對包括上游引物和下游引物：

上游引物hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

下游引物hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

在另一優(yōu)選例中，所述內(nèi)參基因包括prp基因。

在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括人溶菌酶(hlz)基因。

在另一優(yōu)選例中，所述第一反應(yīng)體系和第二反應(yīng)體系中，引物不同，其他反應(yīng)條件相同或基本相同。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一引物對的濃度為0.2μm-1.0μm，較佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，最佳地，0.4μm。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二引物對的濃度為0.2μm-1.0μm，較佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，最佳地，0.4μm。

在另一優(yōu)選例中，所述比較是計(jì)算所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物和所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)值的比值。

在另一優(yōu)選例中，在所述步驟(c)中，比較所述外源目的基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物和所述內(nèi)參基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量或ct值，從而判斷所述待測樣本中所述外源目的基因和所述內(nèi)參基因的相對拷貝數(shù)，和/或判斷所述待測樣本是否為純合子的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，在所述步驟(c)中，分別測定hlz基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物和 prp基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量或ct值，從而判斷所述待測樣本中hlz基因和prp基因的相對拷貝數(shù)，和/或判斷所述待測樣本是否為純合子的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃30秒；95℃5秒，60℃34秒。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

在另一優(yōu)選例中，在所述擴(kuò)增步驟之前，還包括步驟(i’)：對待測樣本進(jìn)行處理，從而提取樣本中的核酸模板。

在另一優(yōu)選例中，在所述擴(kuò)增步驟之前，還包括步驟(i”)：分別以提取的核酸模板和正常山羊基因組dna為模板，構(gòu)建含有hlz基因和prp基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述外源目的基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct1)與所述內(nèi)參基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)為1.5-2.5(較佳地，1.7-2.3，更佳地，1.9-2.1)時(shí)，則表明待測樣本為純合子的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述外源目的基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct1)與所述內(nèi)參基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)為0.8-1.2(較佳地，0.9-1.1)時(shí)，則表明待測樣本為單倍體的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述外源目的基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct1)與所述內(nèi)參基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)為0時(shí)，則表明待測樣本為非轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)hlz基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct1)與prp基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)為1.5-2.5(較佳地，1.7-2.3，更佳地，1.9-2.1)時(shí)，則表明待測樣本為純合子的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)hlz基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct1)與prp基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)為0.8-1.2(較佳地，0.9-1.1)時(shí)，則表明待測樣本為單倍體的轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)hlz基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct1)與prp基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)為0時(shí)，則表明待測樣本為非轉(zhuǎn)基因羊。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對所述轉(zhuǎn)基因羊純合程度的鑒定步驟(d)：將步驟(c)鑒定得到的純合子轉(zhuǎn)基因羊與正常山羊雜交，從而鑒定所述轉(zhuǎn)基因羊的純合程度。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述純合子轉(zhuǎn)基因羊與正常山羊雜交后代的陽性率為100％時(shí)，則表明所述轉(zhuǎn)基因羊的純合程度較高。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣本包括血液樣本、細(xì)胞樣本、組織樣本。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測方法是非診斷且非治療性的。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了g0代與正常羊配種后轉(zhuǎn)基因羊后代整合檢測鑒定圖；其中，m：dl2000dnamarker；1-22：雜合子轉(zhuǎn)hlz基因山羊與正常羊雜交后代；+：pcr陽性對照(模板為陽性質(zhì)粒)；-：pcr陰性對照(模板為正常羊基因組dna)。

圖2顯示了熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品載體示意圖。

圖3顯示了熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率圖。

圖4顯示了以prp為內(nèi)參基因，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測轉(zhuǎn)基因羊后代中hlz的相對定量結(jié)果圖。

圖5顯示了以actin為內(nèi)參基因，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測轉(zhuǎn)基因羊后代中hlz的相對定量結(jié)果圖。

圖6顯示了雜合子羊與雜合子羊配種后代整合檢測鑒定圖；其中，m：dl2000dnamarker；1-22：轉(zhuǎn)hlz基因雜合子羊與雜合子羊雜交后代；+：pcr陽性對照(模板為陽性質(zhì)粒)；-：pcr陰性對照(模板為正常羊基因組dna)。

圖7顯示了純合子羊與正常羊配種后代整合檢測鑒定圖，其中，m：dl2000dnamarker；1-22：純合子轉(zhuǎn)hlz基因山羊與正常羊雜交后代；+：pcr陽性對照(模板為陽性質(zhì)粒)；-：pcr陰性對照(模板為正常羊基因組dna)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過篩選了大量樣本，意外篩選出2對能夠高效擴(kuò)增鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的引物對，分別為hlz基因和prp基因的引物對。具體地，本發(fā)明采用了羊朊蛋白內(nèi)源性基因(prp基因)為內(nèi)參基因，利用real-timepcr雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過構(gòu)建含有hlz基因和prp基因的標(biāo)準(zhǔn) 質(zhì)粒，比較hlz和prp基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值，從而鑒定和篩選純合子的轉(zhuǎn)基因羊。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。

內(nèi)參基因(prp基因)

羊朊蛋白(prionprotein，prp)基因位于13號染色體上，編碼約250個(gè)氨基酸的朊蛋白，該基因在羊的基因組內(nèi)以高度保守、單拷貝形式存在，在羊各組織器官中穩(wěn)定表達(dá)。

引物

如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)增外源目的基因和內(nèi)參基因的引物”、“擴(kuò)增hlz基因和prp基因的引物”、“本發(fā)明的引物”是指這樣的引物(對)，其擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有hlz基因和prp基因的互補(bǔ)鏈序列。

經(jīng)過大量引物(對)的篩選，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如seqidno.:1和seqidno.:2所示的引物對，以及seqidno.:3和seqidno.:4所示的引物對能夠高效地?cái)U(kuò)增出hlz基因和prp基因的基因序列，且所擴(kuò)增出的產(chǎn)物條帶清晰無彌散。

本發(fā)明中，所使用的hlz基因和prp基因的擴(kuò)增特異性引物對所針對的目標(biāo)序列為轉(zhuǎn)基因羊。

將seqidno.:1-2所示的引物對單獨(dú)或與seqidno.:3-4所示的引物對組合對純合子的轉(zhuǎn)基因羊進(jìn)行鑒定，可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的引物對可高靈敏地、高特異性地檢測出純合子的轉(zhuǎn)基因羊

試劑盒

本發(fā)明還提供了一種用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的第一引物對，所述引物對包括擴(kuò)增prp基因的特異性引物對：

prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；和

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)；

以及使用說明書。

在一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括(b)第二容器，以及位于所述容器內(nèi)的用于鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的第二引物對，所述引物對包括擴(kuò)增hlz基因的特異性引物 對：

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；和

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

所述的試劑盒中還可以含有其他組分，例如進(jìn)行樣本處理、dna模板提取的試劑組合。

在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒包含以下組分：dna聚合酶、pcr緩沖液、mg2+、dntp、和蒸餾水。

所述的試劑盒還含有dna抽提試劑盒，購于天根生化科技有限公司。

所述試劑盒還含有任選的pcr檢測相關(guān)試劑，如dna聚合酶、pcr緩沖液、mg²⁺、dntp、蒸餾水等。

所述的pcr檢測相關(guān)試劑可自商業(yè)購買來源獲得，如premixextaq。

本發(fā)明試劑盒中引物的濃度沒有特別限制，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所需的擴(kuò)增效率進(jìn)行決定。優(yōu)選地，本發(fā)明擴(kuò)增hlz基因的特異性引物的濃度為0.2μm-1.0μm，較佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，優(yōu)選0.40μm，本發(fā)明擴(kuò)增prp基因的特異性引物的濃度為0.2μm-1.0μm，較佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，優(yōu)選0.40μm。

鑒定方法、轉(zhuǎn)基因羊純系的建立以及轉(zhuǎn)基因羊新品種的培育

本發(fā)明還提供了一種鑒定純合子轉(zhuǎn)基因羊的方法，包括步驟：

(a)提供一待測樣本，所述待測樣本含有轉(zhuǎn)基因羊的基因組dna；

(b)在第一反應(yīng)體系中，以所述待測樣本為模板，用所述第一引物對擴(kuò)增所述待測樣本中的內(nèi)參基因，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；并在第二反應(yīng)體系中，以所述待測樣本為模板，用所述第二引物對擴(kuò)增所述待測樣本中的外源目的基因，獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物；

(c)比較反應(yīng)體系中所述外源目的基因的第二擴(kuò)增產(chǎn)物和所述內(nèi)參基因的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)值，從而判斷所述待測樣本是否為純合子的轉(zhuǎn)基因羊。

在本發(fā)明中，本發(fā)明還提供了純合子轉(zhuǎn)基因羊在轉(zhuǎn)基因羊純系建立和轉(zhuǎn)基因羊新品種中培育中的應(yīng)用。

具體步驟為：將鑒定的純合子轉(zhuǎn)基因公羊與純合子轉(zhuǎn)基因母羊按常規(guī)方法在實(shí)驗(yàn)羊牧場種養(yǎng)殖，待其發(fā)育到性成熟后，按常規(guī)方法進(jìn)行親緣選配；得到的后代即為遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因羊純合子家系，將獲得的轉(zhuǎn)基因羊純合子家系按常規(guī)方 法在實(shí)驗(yàn)羊牧場養(yǎng)殖和培育，從而培育出優(yōu)良羊類新品種。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

1.本發(fā)明以山羊內(nèi)源性朊蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因，結(jié)合real-timepcr和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法鑒定純合子，不需要樣品濃度完全一致，同時(shí)也可以避免加樣誤差帶來的結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)象，也不需要復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，操作簡單、快速、準(zhǔn)確，需要的dna量少、而且可以高通量分析待測轉(zhuǎn)基因羊樣品。

2.用本發(fā)明的鑒定方法鑒定出來的純合子轉(zhuǎn)基因羊可以作為親本用于建立轉(zhuǎn)基因羊純系，從而培育出養(yǎng)殖性狀優(yōu)良，遺傳性狀穩(wěn)定的養(yǎng)殖羊類新品種，加快遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因羊新品種的培育進(jìn)程。

3.本發(fā)明的鑒定方法簡便易行，操作簡便，可以對轉(zhuǎn)hlz基因羊雜交群體中的純合子和雜合子轉(zhuǎn)基因羊進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和高通量篩選。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

實(shí)施例1以朊蛋白為內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)基因羊純合子的鑒定方法

實(shí)驗(yàn)方法

1.dna提取

取200μl轉(zhuǎn)hlz基因羊血液，按“血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒”操作指南(北京天根生物技術(shù)公司產(chǎn)品)，提取轉(zhuǎn)hlz基因羊基因組dna。

2.陽性轉(zhuǎn)hlz基因羊鑒定

采用常規(guī)pcr技術(shù)鑒定陽性hlz轉(zhuǎn)基因羊。檢測所需上下游引物序列分別為：hlz-f(5’-gagtgcagtggcatgatctcag-3’)(seqidno.:5)和hlz-r(5’-gtaagcaggagcaatggcat-3’)(seqidno.:6)；引物由invitrogen公司合成。

pcr檢測體系總體積為20μl，包括2μl10×labuffer(mg²⁺plus)，3.2μldntp(10mm)，上下游引物各0.8μl；1μlgdna；0.2μllataq聚合酶。pcr 反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,30cycles；72℃再延伸10min。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，預(yù)期擴(kuò)增的轉(zhuǎn)基因片段大小為1510bp。

3.純合子鑒定與篩選

轉(zhuǎn)入基因hlz在純合子轉(zhuǎn)基因羊基因組中的拷貝數(shù)是其在雜合子轉(zhuǎn)基因羊基因組中拷貝數(shù)的2倍，通過real-timepcr分析轉(zhuǎn)基因羊中轉(zhuǎn)植基因hlz的基因型來鑒別轉(zhuǎn)基因羊純合子和雜合子：以山羊基因組中拷貝數(shù)恒定不變的prnp基因?yàn)閮?nèi)參基因，以轉(zhuǎn)入基因hlz為目標(biāo)基因，進(jìn)行real-timepcr分析。

3.1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

以hlz轉(zhuǎn)基因的羊基因組dna為模板，分別用hlz-f1和hlz-r1擴(kuò)增245bp的人溶菌酶序列；以正常山羊基因組dna為模板，分別用prp-f1和prp-r1擴(kuò)增209bp的朊蛋白基因序列，pcr擴(kuò)增體系為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；72℃再延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。并將hlz序列克隆至pbluscriprⅱ載體的xbaⅰ和sacⅰ之間，得中間載體pbsk-hlz；將prp串聯(lián)克隆至中間載體pbsk-hlz的kpnⅰ和bamhi之間，得標(biāo)準(zhǔn)pbsk-prp-hlz(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒示意圖見圖2)。

所述各引物為：

hlz-f1：5’-gctctagaagttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:7)；

hlz-r1：5’-cgagctctcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:8)；

prp-f1：5’-ggggtaccacccagattttaacatagag-3’(seqidno.:9)；

prp-r1：5’-cgggatccttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:10)

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pbsk-prp-hlz用ddh2o分別稀釋至1.5×10⁸、1.5×10⁷、1.5×10⁶、1.5×10⁵、1.5×10⁴、1.5×10³拷貝/μl6個(gè)梯度，分別用作prp基因及插入序列hlz的定量模板。

定量反應(yīng)體系:premixextaq^tmⅱ(2×)10μl，上下游引物各0.8μl(10μmol/l),模板2μl,roxreferencedyeⅱ(50×)0.4μl,ddh2o定容到20μl體系。定量反應(yīng)條件為:95℃30s；95℃5s,60℃34s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)平行。以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),以ct值為縱坐標(biāo)分別繪制hlz和prp的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

hlz基因上下游引物分別為

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

prp基因上下游引物分別為：

prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)。

3.2轉(zhuǎn)hlz基因山羊拷貝數(shù)分析

分別提取轉(zhuǎn)人溶菌酶基因山羊的基因組dna，通過紫外分光光度計(jì)測定其濃度。參照山羊基因組全序列長度,計(jì)算其分子量,將基因組dna稀釋到10⁴～10⁷拷貝數(shù)/μl的濃度范圍。

分別測定轉(zhuǎn)人溶菌酶基因山羊的hlz和prp的ct值,按照構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)計(jì)算其拷貝數(shù)。由于山羊的prp基因?yàn)?個(gè)拷貝,所以依照公式:hlz拷貝數(shù)/基因組＝(hlz拷貝/prp拷貝數(shù))×2可以計(jì)算出每個(gè)山羊基因組中的插入序列hlz的拷貝數(shù)，結(jié)果見圖4，可見t6轉(zhuǎn)基因羊中hlz拷貝數(shù)顯著高于原代轉(zhuǎn)基因羊t1，約為t1的兩倍，判定為純合子轉(zhuǎn)基因羊。從圖4中可以看出，用prp基因作為內(nèi)參基因時(shí)，波動(dòng)性很小，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好。

4.純合子驗(yàn)證

將步驟3篩選出的純合子轉(zhuǎn)基因羊與正常奶山羊雜交后按照步驟1和2所示方法鑒定雜交后代的陽性率。根據(jù)孟德爾遺傳定律，純合子轉(zhuǎn)基因羊與正常羊雜交后代的陽性率為100％(圖7)，純合子與雜合子轉(zhuǎn)基因羊雜交后代的陽性率約為75％(圖6)，雜合子轉(zhuǎn)基因羊與正常羊雜交后代的陽性率為50％(圖1)。

實(shí)施例2用實(shí)施例1的鑒定方法鑒定的純合子轉(zhuǎn)基因羊的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)方法

1.將鑒定的純合子轉(zhuǎn)基因公羊與純合子轉(zhuǎn)基因母羊按常規(guī)方法在實(shí)驗(yàn)羊牧場種養(yǎng)殖，待其發(fā)育到性成熟后，按常規(guī)方法進(jìn)行親緣選配；

2.得到的后代即為遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因羊純合子家系，將獲得的轉(zhuǎn)基因羊純合子家系按常規(guī)方法在實(shí)驗(yàn)羊牧場養(yǎng)殖和培育，從而培育出優(yōu)良羊類新品種。

結(jié)果表明，本發(fā)明的方法得到的純合子轉(zhuǎn)基因羊遺傳性狀穩(wěn)定，可用于轉(zhuǎn) 基因優(yōu)良新品種的培育。

對比例

以如下引物擴(kuò)增actin序列，采用實(shí)施例1的3.1的方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pbsk-actin-hlz。并以此為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量pcr擴(kuò)增。

hlz-f1：5’-gctctagaagttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:7)；

hlz-r1：5’-cgagctctcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:8)；

actin-f1：5′-cccaagcttcacacggtgcccatctacga-3′(seqidno.:11)；

actin-r1：5′-ggggtaccatgtcacggacgatttcccgct-3′(seqidno.:12)。

采用如下引物進(jìn)行定量擴(kuò)增，反應(yīng)體系:premixextaq^tmⅱ(2×)10μl，上下游引物各0.8μl(10μmol/l),模板2μl,roxreferencedyeⅱ(50×)0.4μl,ddh2o定容到20μl體系。定量反應(yīng)條件為:95℃30s；95℃5s,60℃34s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)平行。以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),以ct值為縱坐標(biāo)分別繪制hlz和actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)；

actin-f2：5’-cacacggtgcccatctacga-3’(seqidno.:13)；

actin-r2：5’-atgtcacggacgatttcccgct-3’(seqidno.:14)。

分別測定轉(zhuǎn)基因羊的actin和prp的ct值,按照構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其拷貝數(shù)。由于山羊的actin基因?yàn)?個(gè)拷貝,所以依照公式:hlz拷貝數(shù)/基因組＝(hlz拷貝/actin拷貝數(shù))×2可以計(jì)算出每個(gè)山羊基因組中的插入序列hlz的拷貝數(shù)。結(jié)果如圖5所示，t6轉(zhuǎn)基因羊中hlz拷貝數(shù)顯著高于其它羊，約為原代轉(zhuǎn)基因羊t1兩倍，故判定為純合子轉(zhuǎn)基因羊。然而，actin作為內(nèi)參基因時(shí)，波動(dòng)性較大，穩(wěn)定性差，準(zhǔn)確度低。

結(jié)果表明，分別以prp及actin為內(nèi)參基因，用于轉(zhuǎn)基因羊中hlz拷貝數(shù)檢測時(shí)結(jié)果雖然相似，但prp為內(nèi)參檢測時(shí)的結(jié)果更為穩(wěn)定，準(zhǔn)確度更高，重復(fù)性更好。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。