專利名稱：SAA1β/β純合子基因型在肝硬化預后診斷及肝硬化診斷中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝硬化預后診斷及肝硬化診斷，具體地涉及了血清淀粉樣蛋白Al (SAAl) SAAl β / β純合子基因型作為肝硬化的危險因子在肝硬化預后診斷中的應用和作為肝硬化的生物標記物在肝硬化診斷中的應用。
背景技術(shù)：
肝硬化(Cirrhosis)是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復而作用形成的彌漫性肝損害。肝硬化是肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程；過度纖維化使肝臟萎縮變硬，最終引起肝硬化失代償或肝功能衰竭而導致患者死亡。早在2002年，WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)即顯示全球每年死于肝硬化的人數(shù)近8萬例。至2010年，肝硬化已經(jīng)是公認的導致人類死亡的前10大疾病。因此，肝硬化已成為全球性的公共健康問題，發(fā)病率之高，危害之重，不容忽視。由于導致肝硬化最常見的病因為乙肝(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染，世界人口總數(shù)的約1/3 (20億)感染過或正在感染乙肝病毒，其中有3.5億人為終身感染者。而我國的HBV感染率已經(jīng)高達10%。因此，由HBV和HCV感染導致的肝硬化在我國的發(fā)病逐年增加。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國慢性乙型肝炎病人約為2000萬人，其中近25 30萬慢性乙肝病人可發(fā)展為肝硬化，其中5 20萬可能發(fā)展為肝癌。而我國每年死于肝硬 化的人數(shù)高達20萬。因此，如果能夠發(fā)現(xiàn)易感人群并進行早期診斷和干預，則會大大降低肝硬化乃至肝癌的發(fā)病率，降低患者死亡率、減少醫(yī)療費用并提高患者的生活質(zhì)量；同時，肝硬化易感人群的發(fā)現(xiàn)對于了解其發(fā)病機理并尋找干預手段也有重要科學意義和臨床應用價值，這將對人類最終攻克這一頑疾有重要意義。人類血清淀粉樣蛋白Al (Serum Amyloid Al, SAA1)是一種由104個氨基酸組成的急性期反應蛋白。其在天然狀態(tài)時的分子量大約為12-14kDa，其編碼基因位于人類第11號染色體。早期的研究認為SAAl是一種急性炎性蛋白，因為在急性炎癥中，SAAl可由肝臟活化的巨噬細胞和纖維母細胞合成，濃度達正常水平的100-1000倍(正常值一般為910±270微克/升)。此外，SAAl在生理狀態(tài)下可與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合，在炎癥期間通過調(diào)節(jié)高密度脂蛋白代謝而使其水平升高。但是，近年來大量研究表明=SAAl已經(jīng)不僅是傳統(tǒng)意義上的急性期炎癥蛋白，而是作為天然固有免疫的調(diào)理素，SAAl可與IL-6、TNF-a等炎癥性細胞因子相互作用，參與調(diào)節(jié)機體的固有免疫和獲得性免疫。如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SAAl在糖尿病、冠心病、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等慢性炎癥疾病和自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色。在肝臟疾病發(fā)生中，香港大學He博士等發(fā)現(xiàn)，在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝組織中，SAAl蛋白明顯增高。眾所周知，乙肝病毒感染后有著“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表現(xiàn)，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝臟后導致肝細胞長期慢性炎癥、肝細胞死亡并由肝臟纖維組織增生發(fā)展而來。其中，SAAl是否參與上述病變至今未見報道。但是法國巴斯德研究所的研究表明=SAAl蛋白與肝炎病毒的感染有著密切的關(guān)系，乙肝病毒X基因(該基因與肝硬化及肝癌形成有關(guān))轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織中SAAl蛋白表達明顯受抑，提示SAAl可能與HBV感染和后續(xù)病變有關(guān)。因此，本發(fā)明提出SAAl蛋白與乙肝引起的肝硬化相關(guān)、通過SAAl蛋白變化檢測或判斷肝硬化發(fā)病、診斷和干預的新的應用方法。基因多態(tài)性(Polymorphism)是指在一個生物群體中，同時存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性(Genetic Polymorphism)或基因多態(tài)性?；騿魏塑账岫鄳B(tài)性(Single Nuclear Ploymorphism, SNP)是指基因序列內(nèi)的單個堿基的不同，包括單個堿基的缺失，插入和置換。人類基因多態(tài)性與疾病發(fā)生和診斷與治療有密切的關(guān)系，多態(tài)性的變化不僅在闡明機體對疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現(xiàn)的多樣性，以及對藥物治療的反應性和預測轉(zhuǎn)歸上都起著重要的作用。通過基因多態(tài)性的研究，可從基因水平揭示個體間生物活性物質(zhì)的功能及效應存在著差異的本質(zhì)。因此，基因多態(tài)性研究已經(jīng)成為臨床醫(yī)學及預防醫(yī)學研究的新領(lǐng)域。由于基因多態(tài)性有明顯的種族差異，在不同種族之間可能表現(xiàn)出很大差異。所以，開展我國人群中與肝硬化相關(guān)的基因多態(tài)性研究具有重要的意義。通過對于肝硬化易感基因多態(tài)性研究，建立對易感性生物標志物的分析方法，將某些攜帶敏感基因型的人甄別開來，便于采取針對性預防、在HBV感染人群中早期診斷肝硬化、對于接受治療的肝硬化患者通過多態(tài)性分析預測其治療效果和預后轉(zhuǎn)歸等都有重要價值。目前已知SAAl有SAAl α、β、γ三種等位基因,可分為α/α，α/β，a / γ , β /β，β/Y , Υ/Υ6種 基因型(表I)。已有研究表明不同的SAAl基因型在人群中所占的比例存在差異性。近年來，越來越多的研究聚焦在了 SAAl基因型與疾病的關(guān)系上。眾多的研究表明，SAAl基因型和疾病有相關(guān)性。例如，Yamada等對321名日本人SAAl基因型的研究發(fā)現(xiàn)，α(1.1)、β (1.5), Y (1.3)這3個等位基因在日本人中的分布頻率分別為0.310，0.347，0.330。Ishii等發(fā)現(xiàn)，在127例RA患者中，發(fā)生淀粉樣變者最常見的基因型是SAAl y/y (1.3/1.3)。淀粉樣沉積物的出現(xiàn)和SAAl y的基因頻率高度相關(guān)。且在Y /Y純合子基因型中，血清中SAAl蛋白的濃度水平，以及SAAl與同為急性期反應蛋白CRP的比值高于其他基因型。而在高加索人中，淀粉樣變與SAAla等位基因的頻率呈正相關(guān)。在地中海出血熱的研究中，有文獻報道，SAAl a型的發(fā)病率是其他型別的7倍。而在SAAl的SNP分析研究中，也有報道表明不同的基因型在HDL-C的水平上存在顯著差異。但是，有關(guān)SAAl基因型與肝硬化的相關(guān)性研究至今未見報道。基因多態(tài)性研究中目前普遍使用的是“限制性內(nèi)切酶片段長度檢測(RFLP) ”。該方法步驟極為繁瑣、重復性差，不易進行大規(guī)模SNP分析。因此，開發(fā)一種簡便、快速、準確又經(jīng)濟的SAAl基因多態(tài)性檢測方法，對于疾病的診斷有重要意義.。本發(fā)明通過設(shè)計SAAl等位基因的SNP位點位于下游引物3’端的末端并對其進行硫代磷酸化修飾，采用改進的實時熒光定量等位基因特異性PCR (Real-time andAllele-specific PCR)技術(shù)，對SAAl基因型進行分析，并研究SAAl基因型與肝硬化發(fā)病的關(guān)系。本發(fā)明研究結(jié)果表明=SAAl基因型在中國人群中的分布與其它人種有很大的差異，而且其基因型的確與肝硬化的發(fā)生率有關(guān)并可作為生物標記物應用于肝硬化診斷/預后診斷。本發(fā)明首次提出SAAl β/β純合子基因型與肝炎和肝硬化有正相關(guān)性、SAAl β/β純合子基因型作為肝硬化生物標志物和肝硬化高危因子，可用于肝硬化診斷與乙肝型肝硬化預后診斷。因此，本發(fā)明還對SAAl β/β純合子基因型發(fā)展為肝硬化診斷指標進行了評估。本發(fā)明通過改良的實時檢測PCR技術(shù)，在進行了較大乙肝、肝硬化患者及正常對照人群的臨床樣本中SAAl基因型檢測分析后，首次發(fā)現(xiàn)并提出SAAl β / β純合子基因型與肝硬化的顯著相關(guān)性；提出了 SAAl β/β純合子基因型是肝硬化的危險因子，具有很高的肝硬化預后診斷價值；首次鑒定了 SAAli3/i3純合子基因型作為肝硬化的生物標志物，對于非侵入性肝硬化診斷試劑的開發(fā)具有重大的意義；并且，本發(fā)明所設(shè)計的特定引物適用于采用實時熒光定量PCR檢測人SAA1SNP，本發(fā)明方法能夠簡便、準確、快速地實現(xiàn)對肝硬化易感人群的檢測；并且適用于SAA1SNP與其他相關(guān)疾病的研究。表1:SAA1基因型相對應的氨基酸變異及位點
權(quán)利要求
1.SAAl β/β純合子基因型在肝硬化診斷和/或乙型肝炎后肝硬化預后診斷中的應用。
2.SAAl β/β純合子基因型在制備肝硬化預后診斷試劑和/或肝硬化診斷試劑中的應用。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于，依據(jù)SAAlα、β、Y三個等位基因的基因序列上的編碼構(gòu)建合成引物，通過實時熒光定量等位基因特異性PCR對待測樣品進行擴增，依據(jù)CT值及溶解曲線判斷PCR擴增產(chǎn)物的基因型，當所述PCR擴增產(chǎn)物判斷為SAAl β /β純合子基因型時，所述待測樣品判斷為屬于肝硬化的易感人群。
4.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述引物包括: 1)A3套引物 所述上游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.1)為:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.2)為:TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGG ； 2)Α2套引物 所述上游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.1)為:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.3)為:TTACGTGATCGCTTCTGCAGCCCAGA ； 3)B3套引物 所述上游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.1)為:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5’ -3’ 序列(Seq ID N0.4)為:TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCG ； 4)B2套引物 所述上游引物 5，-3，序列(Seq ID N0.1)為:TCCCTTCTGCCTTTCCTTTCCTTTCC ； 所述下游引物 5’ -3’ 序列(Seq ID N0.5)為:TCCCAGGAGCTCCAGTTACGTGATCA。
5.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述引物3’端末端進行硫代磷酸化修飾。
6.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述實時熒光定量等位基因特異性PCR的反應體系包括如權(quán)利要求4所述的引物、待測人SAAla，β，y等位基因基因組DNA、pfu DAN聚合酶、反應緩沖液以及熒光染料。
7.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述實時熒光定量等位基因特異性PCR中，以含SAAl等位基因a、β、Y基因組DNA片段的質(zhì)粒作為陽性對照，以空質(zhì)粒作為陰性對照。
8.如權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述SAAlβ/β純合子基因型在肝硬化預后診斷中作為肝硬 化的危險因子。
9.如權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述SAAlβ/β純合子基因型在肝硬化診斷中作為肝硬化的生物標記物。
全文摘要
本發(fā)明公開了SAA1 β/β(1.5/1.5)純合子基因型在肝硬化預后診斷和/或肝硬化診斷中的應用，以及其在制備肝硬化預后診斷和/或肝硬化診斷試劑中的應用。本發(fā)明通過實時熒光定量等位基因特異性PCR檢測人SAA1 β/β純合子基因型和非SAA1 β/β純合子基因型，從而實現(xiàn)對肝硬化易感人群的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103160575SQ20111041888
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者王榮芳, 吳峻, 張艷, 錢震斌 申請人:王榮芳, 吳峻, 張艷, 錢震斌