一種快速鑒定轉(zhuǎn)基因水稻純合子的定量pcr法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定轉(zhuǎn)基因水稻純合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水稻RBE4基因作為內(nèi)參基因，以轉(zhuǎn)入水稻基因組的外源基因作為目的基因，分別在相同的反應(yīng)體系中進行定量PCR反應(yīng)；并根據(jù)比較Ct值2-△△Ct法計算鑒別純合子或雜合子。
【專利說明】一種快速鑒定轉(zhuǎn)基因水稻純合子的定量PCR法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可靠的可快速鑒定轉(zhuǎn)基因水稻純合子并 用于基因疊加的定量PCR法。

【背景技術(shù)】
[0002] 通過遺傳轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生基因改變的植株在基礎(chǔ)應(yīng)用研究中被廣泛應(yīng)用，這也促進了 具有優(yōu)良性狀的經(jīng)濟作物的發(fā)展。快速篩選出純合子植株可減少轉(zhuǎn)基因作物的育種時間， 尤其是之后還需要進行多個基因的疊加。篩選純合子和確定轉(zhuǎn)基因水稻的拷貝數(shù)在選擇和 培育轉(zhuǎn)基因品種中至關(guān)重要，是研究中不可或缺的步驟。特別是對于需要大量空間來繁殖 下一代的作物，更需要快速準確地鑒定出轉(zhuǎn)基因水稻純合子。因此，一個可以在早期準確篩 選出純合子植株并確定轉(zhuǎn)基因水稻拷貝數(shù)的方法在分子標記輔助育種中就顯得格外重要。 從傳統(tǒng)來說，我們通常使用目的基因常規(guī)PCR和southern雜交分析來確定轉(zhuǎn)基因水稻的純 合子和拷貝數(shù)。但是很遺憾，這些方法都費時費力，不僅需要大量新鮮或冷凍的樣品來提取 DNA，更有可能有放射性污染。
[0003] 為了解決這些問題，有人使用定量PCR來分析基因的整合。定量PCR在整個定量 PCR過程中收集數(shù)據(jù)，因此把擴增和檢測合為一步。檢測通過一系列的熒光分子完成，即定 量PCR產(chǎn)物的濃度與熒光強度相關(guān)。定量PCR的終點是閾值循環(huán)數(shù)，即報告染料的熒光信 號超過我們所定義的閾值時定量PCR的循環(huán)數(shù)。以Ct值來顯示數(shù)據(jù)是為了確保定量發(fā)生 在擴增的延伸階段。在反應(yīng)中Ct值與復(fù)制子的數(shù)量高度相關(guān)。在起始樣品材料中目的DNA 的數(shù)量越多，熒光信號的顯著性增長出現(xiàn)得越快，Ct值就越低。
[0004] 在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種鑒定純合子的定量PCR方法，且在轉(zhuǎn)基 因疊加中進行準確、可靠的鑒定，并將此應(yīng)用于分子育種。本方法可以成功應(yīng)用于3個轉(zhuǎn)基 因的疊加，與southern雜交分析和其他現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因水稻研究方法相比具有快速，準確， 省時省力等優(yōu)點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種鑒定轉(zhuǎn)基因水稻純合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定 量PCR方法以水稻RBE4基因（基因號EF055878. 1)作為內(nèi)參基因，以轉(zhuǎn)入水稻基因組的 外源基因作為目的基因，分別在相同的反應(yīng)體系中進行定量PCR反應(yīng)，并根據(jù)比較Ct值 法計算鑒別純合子或雜合子。
[0006] 具體地，所述內(nèi)參基因引物的核苷酸序列為：
[0007] 正向：GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT ;
[0008] 反向：CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA。
[0009] 本發(fā)明所述定量PCR的反應(yīng)體系為：
[0010] 10 μ 1的反應(yīng)體系，包括：
[0011] Ξ： PCR builer mix 5 μ? DNA 稅板（30ng) 1 μ! .il i陶引物（5 pmol μΓ1) 1 μ? 反丨引物（5 pmol μΓ1) 1 μ? Π,ο 2μ1
[0012] 定量PCR反應(yīng)過程包括：95°C lOmin，1個循環(huán)；95°C 10s，60°C 20s，40個循環(huán)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明所使用的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0014] 分別為 p0sPMP122、p0sPMP132、p0sPMP515、p0sPMP516。
[0015] 圖2是RBE4的擴增曲線，標準曲線和溶解曲線。
[0016] 其中，（a)擴增曲線；(b)標準曲線；(c)溶解曲線；Ct表示閾值循環(huán)數(shù)，ARn表示 熒光信號強度-熒光基線強度。
[0017] 圖3是轉(zhuǎn)基因疊加和常規(guī)PCR擴增方案圖。
[0018] (a)轉(zhuǎn)基因疊加的縮略圖；(b)4個質(zhì)粒圖譜和本方法所鑒定出的純合子F2代基因 特異性引物常規(guī)PCR驗證示例。常規(guī)PCR產(chǎn)物大小以及Hindlll和EcoRI之間的完整表達 元件如圖所示。A代表FUT8基因，B代表GalT基因，C代表AAT基因。大小寫字母分別代 表顯性位點和隱性位點。
[0019] 圖4是轉(zhuǎn)基因水稻品系515-2和515-1的Southern雜交分析。
[0020] 基因組DNA經(jīng)Hindlll，EcoRI或者Hindlll/EcoRI酶切后，用FUT8基因標記的 探針雜交。經(jīng)HindIII，EcoRI和Hindlll/EcoRI酶切后的雙元載體p0sPMP515用作陽性對 照。]?代表出11(111酶切后的入〇嫩 ；第2-4和8-10孔是分別經(jīng)把11(1111〇13)4(3〇1?1〇?1)和 HindllΙ/EcoRI (H3/R1)酶切后的質(zhì)粒 DNA ;第 5-7 孔是分別經(jīng) HindllI (H3)，EcoRI (R1)和 Hindlll/EcoRI (H3/R1)酶切后的轉(zhuǎn)基因水稻品系515-2的基因組DNA ;第11-13是分別經(jīng) HindIII(H3)，EcoRI(Rl)和 HindIII/EcoRI(H3/Rl)酶切后的轉(zhuǎn)基因水稻品系 515-2 的基 因組DNA。

【具體實施方式】
[0021] 以下實施例中所使用的材料和試劑，除特別說明外，均為普通市售。
[0022] 材料與方法
[0023] 質(zhì)粒構(gòu)建和培育轉(zhuǎn)基因水稻植株
[0024] FUT8 基因（α-1，6-fucosyltransferase ;基因號 D89289. 1)和 GalT 基因 (β-1，4-galactosyltransferase ;基因號 M22921. 1)按照水稻密碼子偏好，由 GenScript 公司（美國）合成（優(yōu)化后的基因序列如SEQ ID Ν0· 1和SEQ ID Ν0· 2所示）。本發(fā)明用 具有胚乳特異性表達啟動子Glb(globulin)的p0sPMP512質(zhì)粒作為中間載體。合成的基 因經(jīng)Schl和Xhol分步酶切后，插入由Nael和Xhol酶切后的p0sPMP512載體，由此得到 p0sPMP513(FUT8)和 p0sPMP514(GalT)。p0sPMP513 和 p0sPMP514 經(jīng) Hindlll 和 EcoRI 酶 切后插入同樣經(jīng)過Hindlll和EcoRI酶切后的JH2600載體，得到雙元載體p0sPMP515和 pOsPMP516(如圖1所示）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105。含有CP啟動子和潮霉素（HPT) 基因的質(zhì)粒p〇sPMP122作為篩選標記（如圖1所示）。含有目的基因的質(zhì)粒和篩選標記質(zhì) 粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法共同侵染水稻TP309的愈傷組織。
[0025] 抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子通過基因特異性引物HPT-F/HPT-R的常規(guī)PCR反應(yīng)來鑒 定（表1)。本發(fā)明用到一個表達人α抗胰蛋白酶（AAT)的轉(zhuǎn)基因水稻品系（132-17) (Zhang L, Shi J, Jiang D, Stupak J, Ou J, Qiu Q, An N, Li J, Yang D, Expression and characterization of recombinant human alpha-antitrypsin in transgenic rice seed. Journal of biotechnology, 2013)。包含 HPT 基因和 FUT8 或 GalT 基因的共轉(zhuǎn)化子 由目的基因引物FUT8-F2/FUT8-R2或GalT-F2/GalT-R2 (表1)的常規(guī)PCR反應(yīng)鑒定。純合 子轉(zhuǎn)基因水稻品系515首先與純合子轉(zhuǎn)基因水稻品系516雜交，得到的F1代再與132-17 雜交。（515X516) X132-17雜交后的F2代植株用于接下來通過本方法鑒定純合子和雜合 子的研究。
[0026] 表1.定量PCR和常規(guī)PCR分析的引物
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定轉(zhuǎn)基因水稻純合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水 稻RBE4基因作為內(nèi)參基因，以水稻基因組外源基因或內(nèi)源基因作為目的基因，分別在相同 的反應(yīng)體系中進行定量PCR反應(yīng)；并根據(jù)比較Ct值 AAet法計算鑒別純合子或雜合子和 基因拷貝數(shù)。
2. 如權(quán)利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，所述內(nèi)參基因的引物的核苷酸序列 為： 正向：GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT ; 反向：CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA。
3. 如權(quán)利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR的反應(yīng)體系為10 μ 1 的反應(yīng)體系，包括： 定 SPCR buffer mk 5 μ? DNA 模板 30 ng 1 μ? 止向引物5pmo丨μΓ1 1 μ? 反向引物5 pmol μΓ1 1 μ? Η20 2 μ? 定量？〇?反應(yīng)過程包括：951：1〇1^11，1個循環(huán)；951：1〇8,6〇1：2〇8,40個循環(huán)。
4. 如權(quán)利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，當(dāng)接近于2時判斷為純合 子；當(dāng)接近于1時判斷為雜合子。
5. 如權(quán)利要求4所述的定量PCR方法，其特征在于，當(dāng)鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因水稻的純合子 時，其純合子和雜合子的鑒定準確率為100%。
6. 如權(quán)利要求4所述的定量PCR方法，其特征在于，當(dāng)鑒定雙拷貝轉(zhuǎn)基因水稻的純合子 時，其純合子和雜合子的鑒定準確率為92. 31%。
7. 如權(quán)利要求1所述的定量PCR方法，在鑒別多基因疊加的轉(zhuǎn)基因水稻純合子中的應(yīng) 用。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，對至少含有三種以上外源基因的轉(zhuǎn)基因水 稻進行基因疊加分析。
9. 如權(quán)利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，在鑒定轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因拷貝 數(shù)的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述拷貝數(shù)鑒定的準確率100%。
11. 如權(quán)利要求3所述的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR buffer mix包含熒 光染料 SYBR Green。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195225SQ201410317881
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】楊代常, 汪相宏 申請人:武漢大學(xué)