一種與雞優(yōu)良屠宰性狀相關(guān)的雞fabp4基因分子遺傳標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與肉食雞優(yōu)良屠宰性狀相關(guān)的雞 FABP4基因分子遺傳標記及其在輔助篩選或預(yù)測具備優(yōu)良屠宰性狀的肉食雞品種中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子遺傳標記是以物種突變造成DNA片段長度多態(tài)性為基礎(chǔ)的，具有許多優(yōu) 點；（1)直接探測DNA水平的差異，不受時間空間的限制；（2)標記數(shù)量豐富、多態(tài)性高； (3) 共顯性標識，可以區(qū)分純合子與雜合子；(4)可以解釋家系內(nèi)某些個體的遺傳變異； (5)可以鑒定不同性別、不同年齡的個體。單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide polymorphism, SNP)是DNA遺傳標記中的一種類型，是同一物種不同個體基因組DNA等位序 列上單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象，其比較的是同序列長度里單個堿基的差別。在基因組中， SNPs既可存在于基因序列中，也可存在于基因以外的非編碼序列中。存在于編碼序列中的 SNPs雖然較少，但是在遺傳學(xué)研宄中卻具有重要意義。
[0003] SNPs自身的特性決定了它在生物學(xué)諸多領(lǐng)域的研宄中具有特殊的應(yīng)用價值，主要 在于：（I) SNPs數(shù)量多，分布廣泛，幾乎遍布于整個群體基因組中；（2) SNPs適于快速、規(guī)模 化篩查；（3) SNPs等位基因的頻率容易估計，同時也易于基因分型。目前SNPs的檢測和篩選 方法大致可以分為兩類：一類是直接查找法，即運用現(xiàn)代生物信息學(xué)手段，從已有的核苷酸 數(shù)據(jù)庫中尋找SNPs ;另一種是實驗法，又可分為四種類型，即直接測序法、DNA分子構(gòu)象法、 基因芯片技術(shù)以及限制性酶切法。其中使用限制性酶切檢測SNPs具備了簡便、快速、靈敏 和經(jīng)濟的特點，非常適用于大批量樣品的分析。該方法的核心在于選擇合適的內(nèi)切酶，使得 基因中的單堿基改變通過瓊脂糖凝膠電泳中的片段差異體現(xiàn)出來，就可以初步獲悉基因的 單核苷酸多態(tài)性特征。
[0004] 脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)廣泛存在于脊椎動物和 費脊椎動物的細胞質(zhì)中，屬于脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 9種類型的 FABP。各種不同類型的脂肪酸結(jié)合蛋白分布具有組織特異性，但都是對脂肪酸具有高親和 力的可溶性蛋白質(zhì)。FABP的基本功能是在細胞內(nèi)進行脂肪酸短暫的貯存與運輸，并廣泛 參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運代謝，可將脂肪酸從細胞膜運送到脂肪酸氧化、甘油三酯和磷脂合成的 位置，并在細胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，造成細胞內(nèi)外脂肪酸濃度差，從而促進細胞攝取脂肪酸。 FABP4指的是脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白，是哺乳動物甘油三酯的貯存庫，在脂肪細胞分化 過程中FABP4表達與活性顯著增強，在甘油三酯形成及脂解過程中，F(xiàn)ABP4除存貨釋放大量 脂肪酸，參與調(diào)控甘油三酯生成及溶解的生化循環(huán)。作為分子標記，F(xiàn)ABP4表現(xiàn)出高遺傳的 多態(tài)性。
[0005] 脂肪性狀是評價雞肉品質(zhì)的重要指標，特別是肌內(nèi)脂肪含量，此類性狀的發(fā)育會 直接影響其商品性能。因此，對于調(diào)控脂肪性狀發(fā)育基因的SNPs的表征對于通過肉雞的分 子育種和輔助選擇提高其生產(chǎn)性能具有十分重要的作用。在申請人相關(guān)實驗所涉及雞的群 體中，F(xiàn)ABP4單核苷酸未突變的個體其產(chǎn)肉率以及肉質(zhì)均優(yōu)于純合突變個體以及雜合突變 個體，從數(shù)據(jù)上直觀地體現(xiàn)了 FABP4基因 SNPs對雞生產(chǎn)性狀的影響。這一發(fā)現(xiàn)若應(yīng)用到優(yōu) 質(zhì)家禽的育種等研宄工作中，有望為培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉性狀的優(yōu)良品種提供幫助。經(jīng)檢索， 目前FABP4基因 SNPs作為遺傳標記，特別是作為肉食雞的優(yōu)良屠宰性狀分子遺傳標記應(yīng)用 于篩選或預(yù)測具備優(yōu)良屠宰性狀的肉食雞品種還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種與肉食雞優(yōu)良屠宰性狀相 關(guān)的雞FABP4基因分子遺傳標記及其在輔助篩選或預(yù)測具備優(yōu)良屠宰性狀的肉食雞品種 中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的與肉食雞優(yōu)良屠宰性狀相關(guān)的雞FABP4基因分子遺傳標記是雞 FABP4基因單核苷酸多態(tài)性序列上的多態(tài)性位點，其特征在于：所述雞FABP4基因單核苷酸 多態(tài)性序列的多態(tài)性位點是在FABP4基因序列第一外顯子的第51位為C或T的堿基多態(tài)性 位點，表現(xiàn)為CC、CT或TT三種基因型，其中CC型為肉食雞的優(yōu)良屠宰性狀分子遺傳標記。
[0008] 本發(fā)明所述與肉食雞優(yōu)良屠宰性狀相關(guān)的雞FABP4基因分子遺傳標記在輔助篩 選或預(yù)測具備優(yōu)良屠宰性狀的肉食雞品種中的應(yīng)用。
[0009] 上述應(yīng)用的具體方法是：以待檢測雞FABP4基因組DNA為模板，以引物對 FABP4E1F/E1R進行PCR擴增，擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用特定的限制性核 酸內(nèi)切酶對擴增出的目的片段進行酶切；之后對酶切產(chǎn)物再一次進行瓊脂糖凝膠電泳，來 檢測酶切產(chǎn)物的片段大小，分析確定雞FABP4基因的堿基多態(tài)性位點，當FABP4基因序列第 一外顯子的第51位為C或T，且基因型為CC型時，即可判定待檢測雞品種為具有優(yōu)良屠宰 性狀的品種雞；
[0010] 其中：
[0011] 所述引物對FABP4E1F/E1R的核苷酸序列為：
[0012] FABP4E1F ：CCCTCTTTATTGGTCATCCTA ；
[0013] FABP4E1R ：AGGAATGTGACAACGCTAATC ；
[0014] 所述PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性4-5min ;94°C變性30-35s，55-61°C退火 30-35s，72°C延伸lmin，28-35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，并置于4°C保存；
[0015] 所述特定的限制性核酸內(nèi)切酶為：PpaAII、TaqI、Tsp32I、Tsp32II或TthHB8I，其 酶切作用位點為擴增出目的基因中的以下序列：5'…T 1 CGA…3'或3'~Tt CGA…5'。
[0016] 上述方法優(yōu)選的實施方式是：對于FABP4E1F/E1R引物對來說，PCR擴增程序為： 95°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin，并置于4°C保存。所述特定的限制性核酸內(nèi)切酶為：TaqI。
[0017] 本發(fā)明利用限制性核酸內(nèi)酶切的方法快速篩查雞FABP4基因第一外顯子位點上 單核苷酸多態(tài)性進行檢測，通過對雞品種的SNP進行基因分型和基因頻率分析，同時對酶 切多態(tài)位點與雞生長性狀之間進行關(guān)聯(lián)分析，尋找與雞生長性狀相關(guān)的SNPs作為分子標 記，并以該功能SNPs作為肉食雞的優(yōu)良屠宰性狀分子遺傳標記，在輔助篩選或預(yù)測具備優(yōu) 良屠宰性狀的肉食雞品種中廣泛應(yīng)用，加快了良種雞的選育速度和提高種群品質(zhì)。
[0018] 本發(fā)明通過以SNP位點為酶切位點，選擇合適的特異性核酸內(nèi)切酶，然后根據(jù)SNP 突變后酶切出的DNA片段大小不同來確定雞FABP4基因單核苷酸多態(tài)性特征。
[0019] 根據(jù)雞FABP4基因單核苷酸多態(tài)性特征，本發(fā)明確定雞FABP4基因單核苷酸多態(tài) 性序列的多態(tài)性位點是在FABP4基因序列第一外顯子的第51位為C或T的堿基多態(tài)性位 點，表現(xiàn)為CC、CT或TT三種基因型，其中CC型為肉食雞的優(yōu)良屠宰性狀分子遺傳標記標 的。實驗發(fā)現(xiàn)：CC、CT或TT三種基因型的雞在產(chǎn)肉率以及肉質(zhì)優(yōu)化等方面都有很大差別，CC 型雞屠宰性狀（產(chǎn)肉率以及肉質(zhì)）明顯優(yōu)于TT、CT兩種類型，所以該基因型的雛雞可以作 為具備優(yōu)良屠宰性狀的種雞來培育，這也肯定了基因型為CC的雞可以作為種雞來培育具 有優(yōu)良屠宰性狀的品種雞的可實施性。本發(fā)明應(yīng)用方法簡單、快速、低成本、便于推廣應(yīng)用， 可廣泛應(yīng)用于雞的輔助選擇和分子育種中，將為培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉性狀的優(yōu)良品種提供支 持。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明所述肉食雞的優(yōu)良屠宰性狀分子遺傳標記的實際應(yīng)用流程示意圖。
[0021] 圖2為本發(fā)明擴增的雞的FABP4編碼基因結(jié)構(gòu)示意圖與第一外顯子序列。
[0022] 其中，第一外顯子的51位核苷酸用下劃線及黑體放大字母示意。在野生基因中， 第51位核苷酸為C，突變基因中為T。
[0023] 圖3為本發(fā)明中部分樣品PCR產(chǎn)物經(jīng)特異性酶切篩查到的雞FABP4基因序列瓊脂 糖凝膠電泳結(jié)果圖。其中，CC為未突變型，CT為雜合突變型，TT為純合突變型。
【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明首先根據(jù)雞FABP4基因的保守序列設(shè)計引物，以不同品種雞基因組DNA為 模板，進行PCR擴增，測序。然后，進行特異性酶切，并將酶切結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖和序 列比對篩查出不同品種雞FABP4基因 SNP位點。然后，根據(jù)在群體中檢測到的基因型，進行 群體遺傳統(tǒng)計分析和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與雞生長性狀密切相關(guān)的分子標記。最 后，利用獲得的分子遺傳標記在輔助篩選或預(yù)測具備優(yōu)良屠宰性狀的肉食雞品種中應(yīng)用， 將篩選到的擁有與雞優(yōu)異屠宰性狀相關(guān)分子標記的雞作為種雞進行培養(yǎng)，以期繁殖更多的 優(yōu)質(zhì)雞。下面對本發(fā)明做詳細說明，所述內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0025] 實施例1 :不同品種雞FABP4基因部分DNA序列的克隆
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