一種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹鼩的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹鼩的方法，屬于培育清潔級實(shí)驗動物技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括體外寄生蟲凈化、腸道蠕蟲凈化、沙門氏菌和志賀氏菌凈化、弓形蟲篩選、皰疹病毒篩選等步驟。本發(fā)明方法簡單，利用藥物凈化與和篩選法相結(jié)合，將實(shí)驗樹鼩的微生物和寄生蟲等級由普通級凈化為清潔級，效果明顯。本發(fā)明體外寄生蟲和腸道蠕蟲的凈化率達(dá)到100%，沙門氏菌和志賀氏菌凈化率達(dá)到97.5%，同時采用篩選法剔除了弓形蟲、皰疹病毒和皮膚病原真菌陽性的個體，建立了一種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹鼩的方法。在國內(nèi)實(shí)屬首創(chuàng)，填補(bǔ)了迄今為止國內(nèi)尚無培育清潔級實(shí)驗樹鼩的空白。
【專利說明】
一種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹齣的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于培育清潔級實(shí)驗動物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過藥物凈化和篩選法 培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 實(shí)驗動物的藥物凈化是指利用藥物的方式在保留該實(shí)驗動物遺傳性狀的前提下， 提尚該品種品系的微生物和寄生蟲質(zhì)量等級。
[0003] 現(xiàn)有的實(shí)驗動物按照微生物學(xué)質(zhì)量控制的程度或根據(jù)微生物凈化程度分類，可分 為四種等級。
[0004] (1)普通級動物，conventional (CV)animal，不攜帶所規(guī)定的人獸共患病病原和動 物烈性傳染病的病原。（2)清潔動物，clean(CL)animal，除普通動物應(yīng)排除的病原外，不攜 帶對動物危害大和對科學(xué)研究干擾大的病原。（3)無特定病原體動物，specific pathogen free(SPF)animal，除清潔動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學(xué) 實(shí)驗干擾大的病原。（4)無菌動物，germ free(GF)animal，無可檢出的一切生命體。
[0005] 根據(jù)GB14922.2-2011《實(shí)驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》與GB14922.1-2001《實(shí)驗動 物寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》劃分的實(shí)驗動物等級，將實(shí)驗小鼠和大鼠分為清潔級、無特定病原 體級和無菌級三個級別，普通級的實(shí)驗小鼠和大鼠原則上不再使用;豚鼠、地鼠和兔分為普 通級、清潔級、無特定病原體級和無菌級四個級別。犬和猴分為普通級和無特定病原體級兩 個級別。
[0006] 樹駆](tree shrews，Tupaia belangeri)是一種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳 綱攀駒目的小型動物，形態(tài)酷似松鼠，是靈長類動物的近親。由于樹駒具有體型小，經(jīng)濟(jì)易 得，易馴養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)，飼養(yǎng)管理成本低，對人類病毒易感等優(yōu)點(diǎn)，常常用于替代或減少一 些非人靈長類動物的使用，所以很早就被用作靈長類目（包括人類）的疾病動物模型。近年 來研究發(fā)現(xiàn)，樹駒在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、腫瘤等疾病的研究中 充當(dāng)重要角色，已經(jīng)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0007] 我國現(xiàn)生樹鼠句被認(rèn)為有1屬1種6亞種，即中緬樹鼠句（T u p a i a b e I an g e r i ChinensisH個種。我國從上世紀(jì)80~90年代開展樹駒人工馴養(yǎng)繁殖及相關(guān)研究，進(jìn)入21世 紀(jì)，隨著樹駒在生物醫(yī)學(xué)方面的特殊地位和重要作用，我國的昆明、北京、上海、蘭州、南寧、 廣州等地區(qū)的諸多科研院所和大專院校，像雨后春筍般地開展了樹駒的飼養(yǎng)繁殖與疾病動 物模型的研究。2006年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所率先完成了野生樹駒的馴化，攻 克了人工繁殖關(guān)鍵技術(shù)，初步實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)繁殖。2010年云南省陸續(xù)頒布了實(shí) 驗樹駒地方標(biāo)準(zhǔn)10項，其中DB53/T 328.1-2010實(shí)驗樹駒第1部分:微生物學(xué)等級及監(jiān)測以 及DB53/T 328.2-2010實(shí)驗樹駒第2部分:寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測，將實(shí)驗樹駒分為普通級和 無特定病原體級兩個等級。此后，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹駒種質(zhì)資源中心也 在長期的實(shí)驗樹駒標(biāo)準(zhǔn)化研究過程中，通過對野生樹駒自然攜帶微生物種類和寄生蟲種類 調(diào)查，制訂了實(shí)驗樹駒微生物等級及監(jiān)測的國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗樹駒第1部分:微生物學(xué)等級及 監(jiān)測》及《實(shí)驗樹駒第2部分:寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》研究稿，目前已通過國家標(biāo)準(zhǔn)委員會立 項，將實(shí)驗樹駒分為普通級、清潔級和無特定病原體三個等級，具體項目見表1和表2。
[0008] 表1實(shí)驗樹鼠句病原菌檢測項目
[0011] 表2實(shí)驗樹駒寄生蟲檢測項目
[0013]目前為止，國內(nèi)的實(shí)驗樹駒均為普通級種群，隨著生命科學(xué)的發(fā)展和社會公共安 全意識的提高，以及科研試驗對實(shí)驗動物質(zhì)量要求的提高，清潔級及以上等級的實(shí)驗樹駒 將成為科學(xué)研究的必要條件。樹駒從20世紀(jì)60年代開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物研究以來，培育清 潔級實(shí)驗樹駒一直是樹駒飼養(yǎng)繁殖中的難點(diǎn)問題，迄今為止國內(nèi)尚無通過藥物凈化培育清 潔級實(shí)驗樹駒的研究報道，包括對藥物種類、劑量、用藥途徑、用藥時間間隔、用藥后的處理 等諸方面的操作技術(shù)的文字記載。其他實(shí)驗動物中一般采用的方法為在無菌條件下剖腹取 出仔動物尋找其他泌乳期的清潔級的實(shí)驗動物作為代乳動物提供仔動物母乳或者人工授 乳的方式，但在我們長期的樹駒飼養(yǎng)繁殖過程中，對這兩種方式均進(jìn)行了長久的嘗試，但對 于樹駒來說，首先無法找到適合的清潔級代乳實(shí)驗動物，其次也沒有樹駒適合的人工授乳 配方，從而清潔級實(shí)驗樹駒的研究一直是空白狀態(tài)。
[0014]之后我們在嘗試使用藥物凈化和篩選法相結(jié)合來進(jìn)行清潔級實(shí)驗樹駒培育的時 候，意外的發(fā)現(xiàn)這種藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法能夠通過幾個簡單易行 的步驟，成功的培育清潔級實(shí)驗樹駒，這幾個步驟是相互配伍、相輔相成、缺一不可的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是為了填補(bǔ)清潔級實(shí)驗樹駒的空白，提供一種通過藥物凈化和篩選 法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法，該方法可以將實(shí)驗樹駒的微生物和寄生蟲等級由普通級凈 化為清潔級。其中，所使用的微生物和寄生蟲均為DB53/T 328.1-2010實(shí)驗樹駒第1部分:微 生物學(xué)等級及監(jiān)測以及DB53/T 328.2-2010實(shí)驗樹駒第2部分:寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測中要求 的方法。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0017] -種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法，包括如下步驟：
[0018] 步驟（1 )，體外寄生蟲凈化:取滅虱精，配制為質(zhì)量濃度為0.01 %的水溶液后，加熱 至38°C~40°C，抓取并保定樹駒，然后將樹駒除頭部外全身浸入滅虱精水溶液中，藥浴2~ 3min，離開滅虱精水溶液，待樹駒的毛發(fā)干了后，轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)，7天后，再采用上述 相同方法進(jìn)行藥浴，待樹駒的毛發(fā)擦干后，按照《GB/T 18448.1 -2001實(shí)驗動物體外寄生蟲 檢測方法》的規(guī)定進(jìn)行檢測，檢測時，用顯微鏡觀察樹駒毛發(fā)，見到體外寄生蟲卵和/或成蟲 者，判為陽性;反之判為陰性;將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)；
[0019] 所述的體外寄生蟲為虱、螨或蚤；
[0020] 步驟（2)，絳蟲和吸蟲凈化：口服吡喹酮，每天2次，間隔12小時1次，每次劑量為 120mg/kg，連續(xù)給藥2天，然后對樹駒新鮮糞便進(jìn)行檢測，按照《GB/T 18448.6-2001實(shí)驗動 物蠕蟲檢測方法》的規(guī)定進(jìn)行，顯微鏡下觀察到絳蟲的卵、絳蟲的成蟲、吸蟲的卵和吸蟲的 成蟲中的一種或幾種時，判為陽性;反之判為陰性;將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施 中飼養(yǎng)；
[0021] 步驟(3)，線蟲凈化:皮下注射伊維菌素，劑量為每只動物0.03m 1/次，每14天注射 1次，共注射3次;然后對樹駒新鮮糞便進(jìn)行檢測，按照《GB/T 18448.6-2001實(shí)驗動物蠕蟲檢 測方法》的規(guī)定進(jìn)行，顯微鏡下觀察到線蟲卵和/或成蟲時，判為陽性;反之判為陰性;將檢 測結(jié)果為陰性的樹駒；
[0022] 步驟(4)，沙門氏菌和志賀氏菌凈化：口服諾氟沙星，每天2次，間隔12小時1次，每 次劑量為l〇〇mg/kg，連續(xù)給藥2天，然后取樹駒肛拭子按照《GB/T 14926.1-2001實(shí)驗動物沙 門氏菌檢測方法》和《GB/T 14926.47-2008實(shí)驗動物志賀菌檢測方法》的規(guī)定進(jìn)行檢測，根 據(jù)生化鑒定結(jié)果判定，剔除檢測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒；
[0023] 步驟(5)，弓形蟲篩選:采集樹駒全血樣本，按照《GB/T18448.2-2008實(shí)驗動物弓形 蟲檢測方法》的規(guī)定執(zhí)行，根據(jù)該規(guī)定中檢測方法檢測弓形蟲抗原，根據(jù)檢測結(jié)果，剔除檢 測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒；
[0024]步驟（6 )，皰疹病毒篩選：采集樹駒血液樣本，根據(jù)實(shí)驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)GB / T 14926.60-2001實(shí)驗動物獼猴皰疹病毒I型(B病毒)檢測方法規(guī)定，提取DNA進(jìn)行皰疹病毒的 PCR檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，剔除檢測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒；
[0025] 步驟(7)，皮膚病原真菌篩選:采集樹駒毛發(fā)和皮肩，分離培養(yǎng)真菌，涂片鏡檢，按 照《GB/T14926.4-2001實(shí)驗動物皮膚病原真菌檢測方法》規(guī)定進(jìn)行，根據(jù)動物皮膚癬菌的病 原真菌形態(tài)進(jìn)行鑒定，剔除檢測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒；
[0026] 步驟(8)，清潔級實(shí)驗樹駒的判定:經(jīng)步驟（1)-步驟(7)凈化均為陰性的樹駒為清 潔級實(shí)驗樹駒。
[0027] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是步驟(1)中采用消毒干毛巾擦干和/或電吹風(fēng)吹干樹駒的毛發(fā)。
[0028] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是在體外寄生蟲凈化過程中的非藥浴日期，可同時進(jìn)行絳蟲和吸 蟲的藥物凈化，以及線蟲的藥物凈化;需要進(jìn)行完絳蟲和吸蟲的藥物凈化后，才能進(jìn)行線蟲 的藥物凈化；
[0029] 待體外寄生蟲凈化、絳蟲和吸蟲凈化以及線蟲凈化完畢后，再進(jìn)行沙門氏菌和志 賀氏菌凈化，沙門氏菌和志賀氏菌檢測均為陰性的樹駒，同時進(jìn)行弓形蟲、皰疹病毒和皮膚 病原真菌三種病原的篩選法。
[0030] 操作程序順序組合：
[0031] 為達(dá)到培育清潔級樹駒的最優(yōu)效果，實(shí)施次序原則上按照上述操作順序依次進(jìn) 行。
[0032] 但是為了時間的最大化利用，所以可以在體外寄生蟲凈化過程中的非藥浴日期， 同時進(jìn)行絳蟲和吸蟲的藥物凈化;絳蟲和吸蟲的藥物凈化完成之后，也在體外寄生蟲凈化 過程中的非藥浴日期進(jìn)行線蟲的藥物凈化;待體外寄生蟲凈化、絳蟲和吸蟲凈化以及線蟲 凈化完畢后，再進(jìn)行沙門氏菌和志賀氏菌的藥物凈化。檢測為陰性的樹駒進(jìn)行弓形蟲、皰疹 病毒和皮膚病原真菌三種病原的篩選法，利用篩選剔除這三種病原的篩選可以同時進(jìn)行 (即不按照順序），也可以按順序進(jìn)行。
[0033] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：
[0034]本發(fā)明操作方法步驟簡單，效果明顯，采用藥物凈化與和篩選法相結(jié)合的方法，將 實(shí)驗樹駒的微生物和寄生蟲等級由普通級凈化為清潔級。
[0035] 本發(fā)明體外寄生蟲和腸道蠕蟲的凈化率達(dá)到100 %，沙門氏菌和志賀氏菌凈化率 達(dá)到97.5%，同時采用篩選法剔除了弓形蟲、皰疹病毒和皮膚病原真菌陽性的個體，建立了 一種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法。在國內(nèi)實(shí)屬首創(chuàng)，填補(bǔ)了迄今為 止國內(nèi)尚無通過藥物凈化培育清潔級實(shí)驗樹駒的空白。
【附圖說明】
[0036] 圖1是本發(fā)明通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0038] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用原來或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的 常規(guī)產(chǎn)品。
[0039] 下面對實(shí)驗樹駒藥物凈化中藥物種類、劑量、配比、用藥方法、用藥時間間隔等諸 方面關(guān)鍵技術(shù)的詳細(xì)描述，培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法如圖1所示。
[0040] 1凈化候選種群實(shí)驗樹駒200只，雌雄各半。
[0041 ] 2體外寄生蟲凈化操作程序
[0042] 2.1操作:使用滅虱精(杭州時新衛(wèi)生用品廠生產(chǎn)，為1.5%菊酯水劑IOmL/袋)配制 為0.01 %濃度，最少配制量為5000mL溶液，可藥浴10只樹駒；加熱水溫至38°C~40°C ;手握 保定樹駒，除頭部外全身浸入藥液中，讓樹駒皮毛充分浸透，藥浴2~3min;離開藥液，用消 毒滅菌的干毛巾檫干樹駒毛發(fā)，電吹風(fēng)吹干，放入潔凈籠具中，療程為7天1次，共2次，即第0 天、第7天各1次；
[0043] 2.2作用:殺滅虱、螨、蚤的幼蟲；
[0044] 2.3效果：給藥前，虱、螨、蚤感染為64只；藥浴后，虱、螨、蚤感染為0只轉(zhuǎn)陰率 100%〇
[0045] 2.4檢測方法:透明膠帶紙取樹駒耳背、頸部、腋下、腹股溝部位的毛發(fā)，貼于載玻 片上，直接顯微鏡觀察。見到卵和成蟲者，判為陽性;反之判為陰性。
[0046] 2.5操作時間:第0天，第7天。
[0047] 2.6處理:將藥浴后的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)。
[0048] 3蠕蟲凈化操作程序
[0049] 3.1絳蟲和吸蟲凈化操作程序
[0050] 3.1.1操作：口服吡喹酮，劑量為120mg/kg(樹駒平均體重按150g計算，即每只動物 給藥量約I Smg/次），療程為每天2次(間隔12小時1次），共服藥2天；
[0051 ] 3.1.2作用:殺滅絳蟲和吸蟲；
[0052] 3.1.3效果:轉(zhuǎn)陰率 100 %;
[0053] 3.1.4檢測方法:取樹駒新鮮糞便，生理鹽水稀釋后直接涂片，顯微鏡觀察。見到卵 和成蟲者，判為陽性;反之判為陰性。
[0054] 3.1.5操作時間:第3天，第4天，每天2次。
[0055] 3.1.6處理:將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)。
[0056] 3.2線蟲凈化操作程序
[0057] 3.2.1操作:皮下注射清體康(佛山市南海東方澳龍藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，為伊維菌 素2mL:4000單位），使用劑量為每只動物0.03m 1/次，療程為14天1次，共3次，即第0天、第14 天和第28天各1次；
[0058] 3.2.2作用:殺滅體內(nèi)線蟲，并可輔助性殺滅體外螨蟲；
[0059] 3.2.3效果:轉(zhuǎn)陰率 100 %;
[0060] 3.2.4檢測方法:取樹駒新鮮糞便，生理鹽水稀釋后直接涂片，顯微鏡觀察。見到卵 和成蟲者，判為陽性;反之判為陰性；
[0061 ] 3.2.5操作時間：第10天，第24天，第38天各1次。
[0062] 3.2.6處理:將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)。
[0063 ] 4沙門氏菌、志賀氏菌兩種腸道致病細(xì)菌凈化操作程序
[0064] 4.1操作：口服諾氟沙星，劑量為100mg/kg(樹駒平均體重按150g計算，即每只動物 給藥量約15mg/次），每天2次(間隔12小時1次），連續(xù)給藥2天；
[0065] 4.2作用:殺沙門氏菌和志賀氏菌；
[0066] 4.3效果:給藥前，沙門氏菌及志賀氏菌感染為40只；給藥后，沙門氏菌及志賀氏菌 感染為1只。第40天，第41天，每天2次（間隔12小時1次）。
[0067] 4.4檢測方法:取樹駒肛拭子進(jìn)行分離培養(yǎng)，根據(jù)生化鑒定結(jié)果判定；
[0068] 4.5操作時間：第40天，第41天。
[0069] 4.6處理:將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入實(shí)驗動物屏障設(shè)施中飼養(yǎng)。
[0070] 5弓形蟲篩選操作程序
[0071 ] 5.1操作:采用篩選剔除法；即不作藥物處理，直接進(jìn)行病原篩查，根據(jù)結(jié)果，剔除 陽性動物，保留陰性動物進(jìn)入候選清潔級種群；
[0072] 5.2檢測方法:采集樹駒全血樣本，根據(jù)實(shí)驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18448.2-2008弓形 蟲PCR檢測方法檢測弓形蟲抗原。
[0073] 5.3效果:篩選剔除弓形蟲感染實(shí)驗樹駒0只；
[0074] 5.4操作時間：第42天。
[0075] 6病毒篩選操作程序
[0076] 6.1操作:采用篩選剔除法;直接進(jìn)行病原篩查，根據(jù)檢測結(jié)果，剔除陽性動物，保 留陰性動物進(jìn)入候選清潔級種群；
[0077] 6.2檢測方法:采集樹駒血液樣本，提取DNA進(jìn)行皰疹病毒的PCR檢測。
[0078] 6.3效果:篩選剔除皰疹病毒感染樹駒2只。
[0079] 6.4操作時間：第42天。
[0080] 7皮膚病原真菌篩選操作程序
[0081 ] 7.1操作:采用篩選剔除法;直接進(jìn)行病原篩查，根據(jù)檢測結(jié)果，剔除陽性動物，保 留陰性動物進(jìn)入候選清潔級種群；
[0082] 7.2檢測方法:采集動物毛、皮肩，分離培養(yǎng)真菌，涂片鏡檢，根據(jù)動物皮膚癬菌的 病原真菌形態(tài)進(jìn)行鑒定。
[0083] 7.3效果:篩選剔除皮膚病原真菌感染實(shí)驗樹駒3只。
[0084] 7.4操作時間：第42天。
[0085] 經(jīng)上述七步凈化均為陰性的樹駒為清潔級實(shí)驗樹駒。
[0086] 8藥物凈化和篩選前后結(jié)果比較
[0087]藥物凈化前后結(jié)果對比詳見表3藥物處理前后實(shí)驗樹駒寄生蟲和腸道致病菌攜帶 情況表。篩選前樹駒弓形蟲、皰疹病毒和皮膚病原真菌攜帶情況見表4。
[0088]同時，為驗證凈化和篩選結(jié)果，經(jīng)抽樣送第三方實(shí)驗動物檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果 完全一致。
[0089]表3藥物處理前后實(shí)驗樹駒寄生蟲、腸道致病菌攜帶情況表
LUUVJ」 以上顯不和捆還J不友明的盎不原埋、王安狩祉和不友明的1尤總。不仃業(yè)的扠不 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等效物界定。
【主權(quán)項】
1. 一種通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法，其特征在于，包括如下步 驟： 步驟（1)，體外寄生蟲凈化：取滅虱精，配制為質(zhì)量濃度為0.01%的水溶液后，加熱至38 °C~40°C，抓取并保定樹駒，然后將樹駒除頭部外全身浸入滅虱精水溶液中，藥浴2~3min， 離開滅虱精水溶液，待樹駒的毛發(fā)干了后，轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)，7天后，再采用上述相同方 法進(jìn)行藥浴，待樹駒的毛發(fā)擦干后，按照《GB/T 18448.1-2001實(shí)驗動物體外寄生蟲檢測 方法》的規(guī)定進(jìn)行檢測，檢測時，用顯微鏡觀察樹駒毛發(fā)，見到體外寄生蟲卵和/或成蟲者， 判為陽性;反之判為陰性;將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼養(yǎng)； 所述的體外寄生蟲為虱、螨或蚤； 步驟(2)，絳蟲和吸蟲凈化：口服吡喹酮，每天2次，間隔12小時1次，每次劑量為120mg/ kg，連續(xù)給藥2天，然后對樹駒新鮮糞便進(jìn)行檢測，按照《GB/T 18448.6-2001實(shí)驗動物蠕 蟲檢測方法》的規(guī)定進(jìn)行，顯微鏡下觀察到絳蟲的卵、絳蟲的成蟲、吸蟲的卵和吸蟲的成蟲 中的一種或幾種時，判為陽性;反之判為陰性;將檢測結(jié)果為陰性的樹駒轉(zhuǎn)入潔凈設(shè)施中飼 養(yǎng)； 步驟(3)，線蟲凈化:皮下注射伊維菌素，劑量為每只動物0.03ml/次，每14天注射1次， 共注射3次;然后對樹駒新鮮糞便進(jìn)行檢測，按照《GB/T 18448.6-2001實(shí)驗動物蠕蟲檢測 方法》的規(guī)定進(jìn)行，顯微鏡下觀察到線蟲卵和/或成蟲時，判為陽性;反之判為陰性;將檢測 結(jié)果為陰性的樹駒； 步驟(4)，沙門氏菌和志賀氏菌凈化：口服諾氟沙星，每天2次，間隔12小時1次，每次劑 量為100mg/kg，連續(xù)給藥2天，然后取樹駒肛拭子按照《GB/T 14926.1-2001實(shí)驗動物沙門 氏菌檢測方法》和《GB/T 14926.47-2008實(shí)驗動物志賀菌檢測方法》的規(guī)定進(jìn)行檢測，根 據(jù)生化鑒定結(jié)果判定，剔除檢測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒； 步驟(5)，弓形蟲篩選:采集樹駒全血樣本，按照《GB/T18448.2-2008實(shí)驗動物弓形蟲 檢測方法》的規(guī)定執(zhí)行，根據(jù)該規(guī)定中檢測方法檢測弓形蟲抗原，根據(jù)檢測結(jié)果，剔除檢測 結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒； 步驟(6)，皰疹病毒篩選:采集樹駒血液樣本，根據(jù)實(shí)驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.60-2001實(shí)驗動物獼猴皰疹病毒I型（B病毒)檢測方法規(guī)定，提取DNA進(jìn)行皰疹病毒的PCR檢 測，根據(jù)檢測結(jié)果，剔除檢測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒； 步驟（7)，皮膚病原真菌篩選：采集樹駒毛發(fā)和皮肩，分離培養(yǎng)真菌，涂片鏡檢，按照 《GB/T14926.4-2001實(shí)驗動物皮膚病原真菌檢測方法》規(guī)定進(jìn)行，根據(jù)動物皮膚癬菌的病 原真菌形態(tài)進(jìn)行鑒定，剔除檢測結(jié)果為陽性的樹駒，保留檢測結(jié)果為陰性的樹駒； 步驟(8)，清潔級實(shí)驗樹駒的判定:經(jīng)步驟（1)-步驟(7)凈化均為陰性的樹駒為清潔級 實(shí)驗樹駒。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法，其特征 在于:步驟(1)中采用消毒干毛巾擦干和/或電吹風(fēng)吹干樹駒的毛發(fā)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過藥物凈化和篩選法培育清潔級實(shí)驗樹駒的方法，其特征 在于:在體外寄生蟲凈化過程中的非藥浴日期，可同時進(jìn)行絳蟲和吸蟲的藥物凈化，以及線 蟲的藥物凈化;需要進(jìn)行完絳蟲和吸蟲的藥物凈化后，才能進(jìn)行線蟲的藥物凈化； 待體外寄生蟲凈化、絳蟲和吸蟲凈化以及線蟲凈化完畢后，再進(jìn)行沙門氏菌和志賀氏 菌凈化，沙門氏菌和志賀氏菌檢測均為陰性的樹駒，同時進(jìn)行弓形蟲、皰疹病毒和皮膚病原 真菌三種病原的篩選法。
【文檔編號】A01K67/02GK105941308SQ201610296868
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】孫曉梅, 罕園園, 匡德宣, 王文廣, 李娜, 陸彩霞, 仝品芬, 代解杰
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所