本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及預(yù)測(cè)與防治自然流產(chǎn)的生物標(biāo)記物，具體涉及表達(dá)tim-3的外周血nk細(xì)胞在制備自然流產(chǎn)生物標(biāo)記物中的用途。該自然流產(chǎn)的生物標(biāo)記物可用于作為早期妊娠失敗的預(yù)測(cè)與防治靶點(diǎn)。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了有關(guān)妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)方法主要是根據(jù)孕婦的外周血hcg-β與孕酮水平，但實(shí)踐中大量的證據(jù)表明孕婦外周血p水平與妊娠結(jié)局關(guān)系并不完全一致；盡管hcg-β能比較真實(shí)的反應(yīng)孕婦的妊娠預(yù)后，但越來(lái)越多的臨床資料表明：一旦孕婦外周血hcg下降(除了hcg-β生理性下降)，胚胎已無(wú)法挽救；另外，部分孕婦盡管持續(xù)分泌大量的hcg-β與p，但胚胎仍停止發(fā)育(或是空胚囊)；顯然hcg-β與p作為檢測(cè)妊娠結(jié)局的指標(biāo)存在諸多的缺陷，臨床實(shí)踐迫切需要一個(gè)反映早孕期妊娠狀態(tài)的早期預(yù)測(cè)與防治的生物指標(biāo)。

研究公開(kāi)了，胚胎表達(dá)父系抗原，因而可視為一種半同種移植物，作為這種半同種移植物的胚胎能夠在母體內(nèi)存活直至分娩實(shí)際是反應(yīng)了母體對(duì)胚胎的免疫耐受。一旦這種母-胎免疫耐受被打破，將會(huì)導(dǎo)致妊娠失敗或自然流產(chǎn)與妊娠并發(fā)癥。自然流產(chǎn)是嚴(yán)重危害人類生殖健康的常見(jiàn)疾患之一，其發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料表明，目前，自然流產(chǎn)發(fā)生率高達(dá)15～40％，即便是在輔助生育技術(shù)飛速發(fā)展的今天，仍不能克服因母-胎免疫調(diào)節(jié)紊亂造成的妊娠失敗，遺憾的是臨床實(shí)踐中仍缺乏對(duì)之有效的早期診斷與防治策略。自然流產(chǎn)的發(fā)生多歸因于遺傳、感染、內(nèi)分泌、生殖道畸形等等，但臨床仍有50％以上的流產(chǎn)尤其是反復(fù)自然流產(chǎn)病因不明，其中，母-胎免疫調(diào)節(jié)失衡被認(rèn)為是重要原因之一；有研究顯示，免疫細(xì)胞是母-胎免疫耐受的執(zhí)行者與效應(yīng)者，其中nk細(xì)胞在母-胎耐受中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用；本申請(qǐng)的前期研究發(fā)現(xiàn)，蛻膜nk細(xì)胞對(duì)母-胎耐受的建立和維持至關(guān)重要，妊娠期蛻膜nk細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞表面分子與細(xì)胞 內(nèi)各種因子的作用，維持母-胎耐受與正常妊娠的進(jìn)行，然而由于妊娠期蛻膜組織不易獲取，用于臨床診斷與防治靶點(diǎn)幾無(wú)可能。因此，臨床實(shí)踐中迫切需要一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的方法對(duì)早期自然流產(chǎn)的免疫學(xué)狀態(tài)進(jìn)行客觀的評(píng)估，并能對(duì)之進(jìn)行干預(yù)以達(dá)到防治自然流產(chǎn)挽救妊娠胚胎的目的。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種預(yù)測(cè)與防治自然流產(chǎn)的生物標(biāo)記物，尤其是表達(dá)tim-3的外周血nk細(xì)胞在用于制備自然流產(chǎn)生物標(biāo)記物中的用途。該自然流產(chǎn)的生物標(biāo)記物可用于作為早期妊娠失敗的預(yù)測(cè)與防治靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目地是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種預(yù)測(cè)與防治自然流產(chǎn)的生物標(biāo)記物，具體涉及表達(dá)tim-3的外周血nk細(xì)胞在用于制備自然流產(chǎn)生物標(biāo)記物中的用途。該自然流產(chǎn)的生物標(biāo)記物可用于作為早期妊娠失敗的預(yù)測(cè)與防治靶點(diǎn)。

本發(fā)明中，進(jìn)行了不同妊娠狀態(tài)外周血tim-3⁺nk細(xì)胞百分率比較實(shí)驗(yàn)與差異分析，分析tim-3在不同妊娠狀態(tài)外周血nk細(xì)胞的表達(dá)特征及其調(diào)節(jié)情況；結(jié)果顯示，tim-3在nk細(xì)胞表達(dá)水平在不同孕期有明顯差異，妊娠早期外周血nk細(xì)胞tim-3表達(dá)明顯上調(diào)，妊娠中期降至未孕期水平；妊娠早期，妊娠相關(guān)激素(主要是孕酮)與th2型細(xì)胞因子(il-4)參與外周nk細(xì)胞的tim-3表達(dá)上調(diào)；

本發(fā)明中，進(jìn)行了galectin-9/tim-3信號(hào)介導(dǎo)早孕外周nk細(xì)胞免疫耐受試驗(yàn)，結(jié)果顯示：與tim3^-nk細(xì)胞相比，tim-3⁺nk細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的th2型細(xì)胞因子和較低水平的th1型細(xì)胞因子，并呈現(xiàn)出較弱的殺傷活性，這些表型特征將更有利于維持妊娠外周免疫的耐受狀態(tài)；，nk細(xì)胞上的tim-3受體與galectin-9相互作用，通過(guò)活化akt、jnk信號(hào)通路，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子id-2、blimp1、gata-3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)外周nk細(xì)胞向免疫耐受表型分化；tim-3/gal-9信號(hào)參與nk細(xì)胞優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生th2型細(xì)胞因子；

本發(fā)明中，進(jìn)行了早孕外周nk細(xì)胞galectin-9/tim-3信號(hào)異常致nk功能障礙與妊娠失敗的試驗(yàn)，結(jié)果表明，外周nk細(xì)胞tim-3表達(dá)的降低及外周gal-9產(chǎn)生水平的下調(diào)破壞外周nk細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子和維持較低的殺傷活性而發(fā)揮的免疫耐受作用，進(jìn)而導(dǎo)致自然流產(chǎn)；

進(jìn)一步，本發(fā)明進(jìn)行了干擾gal-9/tim-3信號(hào)通路對(duì)妊娠結(jié)局的影響試驗(yàn)以及過(guò)繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細(xì)胞挽救妊娠失敗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，tim-3在正常妊娠過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)外周nk細(xì)胞的功能起保護(hù)作用，如果tim-3所介導(dǎo)的信號(hào)通路被破壞，會(huì)影響外周nk細(xì)胞的功能甚至分化發(fā)育，從而影響妊娠的正常進(jìn)行和胚胎的發(fā)育，尤其galectin-9/tim-3信號(hào)通路異常會(huì)引起早孕外周血nk細(xì)胞功能紊亂致不良妊娠結(jié)局；經(jīng)過(guò)il-4和孕酮刺激的tim-3⁺nk細(xì)胞有效緩解流產(chǎn)模型高胚胎吸收率；過(guò)繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細(xì)胞降低nk細(xì)胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，過(guò)繼轉(zhuǎn)輸tim-3^-nk細(xì)胞不影響妊娠結(jié)局。

本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明了一種耐受性nk亞群在正常妊娠外周血的高表達(dá)，而自然流產(chǎn)患者這種細(xì)胞數(shù)量下降、功能紊亂；拮抗nk細(xì)胞的tim-3導(dǎo)致妊娠失敗，過(guò)繼轉(zhuǎn)輸該nk細(xì)胞亞群可挽救免疫性自然流產(chǎn)模型以及nk敲除所致的妊娠失?。凰龅谋磉_(dá)tim-3的外周血nk細(xì)胞可用于制備自然流產(chǎn)生物標(biāo)記物，進(jìn)一步作為臨床不明原因自然流產(chǎn)的新型預(yù)測(cè)與防治靶點(diǎn)。

本項(xiàng)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

提供了表達(dá)tim-3的外周血nk細(xì)胞可用于制備自然流產(chǎn)生物標(biāo)記物，進(jìn)一步作為臨床不明原因自然流產(chǎn)的新型預(yù)測(cè)與防治靶點(diǎn)；

所述的tim-3⁺nk細(xì)胞在婦女外周血存在，其表型與功能在早孕外周與蛻膜局部高度一致，只需抽取少許外周血，通過(guò)流式細(xì)胞分析即可監(jiān)測(cè)孕婦的子宮局部與全身的免疫耐受狀態(tài)；不僅如此，針對(duì)這群細(xì)胞，通過(guò)體外刺激(如il-4、p)后過(guò)繼轉(zhuǎn)輸該亞群細(xì)胞可用于直接防治反復(fù)自然流產(chǎn)患者的再次妊娠失敗。

附圖說(shuō)明

圖1：顯示人早孕外周血不同免疫細(xì)胞亞群tim-3的表達(dá)情況以及tim-3⁺nk細(xì)胞在不同孕期的比例，其中tim-3⁺nk細(xì)胞在早孕期比例明顯高于非孕與中孕期。

圖2，顯示il-4/stat6信號(hào)與妊娠相關(guān)的孕激素上調(diào)外周血tim3⁺nk細(xì)胞比例，

其中，th2型細(xì)胞因子il-4通過(guò)活化stat6信號(hào)上調(diào)tim-3表達(dá)，stat6抑制劑與th1型細(xì)胞因子抑制il-4的這種調(diào)節(jié)作用，經(jīng)典的保胎劑孕酮亦促進(jìn)pnk細(xì)胞表達(dá)tim-3。

圖3，顯示人早孕外周血tim-3⁺nk細(xì)胞呈現(xiàn)免疫耐受表型，

其中，芯片分析結(jié)果顯示tim-3+nk細(xì)胞和tim-3-nk細(xì)胞是有差異基因表達(dá)的兩群nk細(xì)胞亞群，tim-3⁺nk細(xì)胞中865個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，100個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，并且上調(diào)表達(dá)的基因多與th2型免疫應(yīng)答及免疫耐受有關(guān)；fcm分析人早孕外周血tim-3⁺與tim-3^-的nk細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與tim-3^-nk細(xì)胞相比，tim-3⁺nk細(xì)胞產(chǎn)生更高水平il-4、il-10與tgf-β，更低水平的tnf-α與perforin；其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的殺傷活性亦明顯下降。

圖4：galectin-9/tim-3信號(hào)通過(guò)活化jnk與akt信號(hào)調(diào)控外周nk細(xì)胞呈現(xiàn)耐受表型，其中顯示，tim-3的天然配體gal-9刺激pnk細(xì)胞，qpcr與westernblot顯示gal-9刺激后活化與nk細(xì)胞發(fā)育分化以及細(xì)胞毒性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子水平，上調(diào)il-4/il-10、下調(diào)tnf-1/perforin與細(xì)胞毒性。

圖5：自然流產(chǎn)患者外周血nk細(xì)胞tim-3/gal-9表達(dá)異常，伴有nk細(xì)胞功能紊亂，其中，圖5.1顯示自然流產(chǎn)患者外周血nk細(xì)胞tim-3表達(dá)下降、外周血gal-9水平低下，伴隨tim-3⁺nk細(xì)胞抗炎細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的染色質(zhì)可接近性顯著降低，促炎細(xì)胞因子生成降低，導(dǎo)致th2/th1型細(xì)胞因子紊亂、細(xì)胞殺傷毒性增強(qiáng)；圖5.2顯示早孕小鼠外周血與脾臟nk細(xì)胞gal-9/tim-3表達(dá)高于中孕期；自然流產(chǎn)小鼠組低于正常妊娠小鼠；自然流產(chǎn)小鼠外周血與脾臟tim-3⁺nk細(xì)胞產(chǎn)生th2/th1型細(xì)胞因子紊亂。

圖6：阻斷tim-3信號(hào)損傷nk細(xì)胞功能導(dǎo)致妊娠失敗，其中，

圖示正常妊娠與自然流產(chǎn)模型小鼠的胚胎吸收與發(fā)育以及nk細(xì)胞的功能，阻斷tim-3信號(hào)降低正常妊娠與自然流產(chǎn)小鼠的窩崽數(shù)、增加其胚胎吸收、抑制胚胎生長(zhǎng)；這種作用在自然流產(chǎn)組更顯著，外源性給予gal-9不影響正常妊娠的窩崽數(shù)、胚胎大小與吸收率與nk細(xì)胞功能，但顯著抑制自然流產(chǎn)小鼠的胚胎吸收，并且改善nk細(xì)胞的功能。

圖7：過(guò)繼轉(zhuǎn)輸正常妊娠脾臟tim-3⁺nk細(xì)胞緩解胚胎丟失，

其中，a為實(shí)驗(yàn)流程圖，b，c，d，e顯示過(guò)繼轉(zhuǎn)輸正常妊娠脾臟tim-3⁺nk細(xì)胞緩解自然流產(chǎn)模型胚胎吸收，而過(guò)繼轉(zhuǎn)輸自然流產(chǎn)小鼠tim-3^-nk則無(wú)改善作用；將自然流產(chǎn)小鼠nk細(xì)胞經(jīng)il-4、p處理后的tim-3⁺nk過(guò)繼轉(zhuǎn)輸給自然流產(chǎn)小鼠后，胚胎吸收率顯著下降；nk細(xì)胞缺陷小鼠妊娠模型，其胚胎吸收率顯著升高，過(guò)繼轉(zhuǎn)輸正常tim-3⁺nk而不是tim-3^-nk細(xì)胞，顯著降低nk缺陷鼠的胚胎吸收率。

圖8為表達(dá)tim-3的外周血nk細(xì)胞作為自然流產(chǎn)生物標(biāo)記物用于早期妊娠失敗的 預(yù)測(cè)與防治靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)流程總圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：不同妊娠狀態(tài)外周血tim-3⁺nk細(xì)胞百分率比較與差異分析/分析tim-3在不同妊娠狀態(tài)外周血nk細(xì)胞的表達(dá)特征及其調(diào)節(jié)

1)分析tim-3在不同妊娠狀態(tài)外周血nk細(xì)胞的表達(dá)特征

首先分離正常非孕、早孕、中孕期婦女外周血，ficoll分離淋巴細(xì)胞，fcm分析tim-3在cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞、nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞、dc細(xì)胞和單核細(xì)胞的表達(dá)(如圖1a所示)，結(jié)果顯示，nk細(xì)胞、dc細(xì)胞和單核細(xì)胞高表達(dá)tim-3(分別為80％、80％、90％)，tim-3在nk細(xì)胞表達(dá)水平在不同孕期有明顯差異，圖1b，c所示，妊娠早期外周血nk細(xì)胞tim-3表達(dá)明顯上調(diào)，妊娠中期降至未孕期水平。

2)tim-3在人早孕外周血nk細(xì)胞的表達(dá)調(diào)節(jié)

由于早孕期外周血與母-胎界面呈現(xiàn)th2優(yōu)勢(shì)，妊娠相關(guān)激素如e、p、hcg亦升高，本發(fā)明進(jìn)一步探討nk細(xì)胞tim-3表達(dá)上調(diào)的可能因素，用磁珠將未孕婦女外周nk細(xì)胞分離純化后，單獨(dú)或聯(lián)合添加重組人il-4(100ng/ml)和ifn-γ(35ng/ml)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)情況；圖2顯示th2型細(xì)胞因子il-4處理nk細(xì)胞后顯著上調(diào)tim-3表達(dá)，這種作用被ifn-γ所削弱；為了進(jìn)一步探討il-4/ifn-γ調(diào)控nk細(xì)胞tim-3表達(dá)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述方法處理后nk細(xì)胞中stat6(il-4作用的下游信號(hào)分子)的磷酸化水平，結(jié)果顯示，il-4處理的nk細(xì)胞組，其stat6的磷酸化水平確實(shí)明顯提高，而聯(lián)合應(yīng)用ifn-γ與il-4抑制il-4誘導(dǎo)的stat6磷酸化水平(圖2c，d)。westernblot檢測(cè)得到一致的結(jié)果如圖2e所示)，stat6的特異性阻斷劑a77-1726可以抑制il-4對(duì)tim-3的上調(diào)作用(如圖2f所示)，th2型細(xì)胞因子il-4通過(guò)活化其下游分子stat6進(jìn)一步促進(jìn)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)，而th1型細(xì)胞因子ifn-γ可以拮抗這一作用；

妊娠早期，不僅外周血中的th2/th1型細(xì)胞因子格局發(fā)生改變，母體的激素水平也發(fā)生明顯的變化，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察妊娠相關(guān)激素是否也會(huì)影響外周nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)，用不同濃度梯度的雌、孕激素、hcg-β刺激純化的未孕女性外周nk細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)情況，如圖2g所示，孕激素以濃度依賴的方式對(duì)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，較低濃度的孕激素促進(jìn)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)，更高濃 度時(shí)，這種上調(diào)作用就消失甚至抑制nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)，而雌激素與hcg-β對(duì)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)無(wú)顯著影響；

結(jié)果表明，妊娠早期，妊娠相關(guān)激素(主要是孕酮)與th2型細(xì)胞因子(il-4)參與外周nk細(xì)胞的tim-3表達(dá)上調(diào)。

實(shí)施例2：galectin-9/tim-3信號(hào)介導(dǎo)早孕外周nk細(xì)胞免疫耐受實(shí)驗(yàn)

1)外周血tim-3+nk與tim3-nk細(xì)胞的表型比較

為了探討tim-3在nk細(xì)胞上的表達(dá)是否與nk細(xì)胞功能相關(guān)，將分離得到的外周單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步用磁珠分選出tim-3⁺nk與tim3^-nk細(xì)胞，鑒定分選純度為92％，滿足實(shí)驗(yàn)要求，提取總rna后進(jìn)行全基因組芯片分析；如圖3a、b所示，tim-3+和tim-3-nk細(xì)胞是有差異基因表達(dá)的兩群nk細(xì)胞亞群，tim-3⁺nk細(xì)胞中865個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，100個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，并且上調(diào)表達(dá)的基因多與th2型免疫應(yīng)答及免疫耐受有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)用pma、離子霉素及bfa刺激4至6小時(shí)后上進(jìn)一步用流式檢測(cè)th2型、th1型細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平，如圖3c，d所示，th2型細(xì)胞因子il-4、il-10、tgf-β在tim-3⁺pnk細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于tim-3^-pnk細(xì)胞而th1型細(xì)胞因子tnf-α在兩群細(xì)胞的表達(dá)水平則相反；ifn-γ在tim-3⁺nk與tim3^-nk細(xì)胞的表達(dá)幾無(wú)差異(如圖3e，f所示)；

進(jìn)一步比較tim-3⁺nk與tim3^-nk細(xì)胞的殺傷活性，將純化的這兩群細(xì)胞分別與靶細(xì)胞htr-8(絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞系)接觸培養(yǎng)，用non-radioactivecytotoxicityassay試劑盒檢測(cè)細(xì)胞殺傷活性，如圖3i所示，tim-3⁺nk與tim3^-nk細(xì)胞的殺傷活性均隨著效靶比的下降而降低，但tim-3⁺nk細(xì)胞的殺傷活性始終低于tim3^-nk細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)分析tim-3⁺nk與tim3^-nk細(xì)胞產(chǎn)生穿孔素perforin的水平，結(jié)果顯示perforin在tim-3⁺nk細(xì)胞的表達(dá)水平明顯低于tim-3-nk細(xì)胞(如圖3g，h)；實(shí)驗(yàn)些結(jié)果顯示：與tim3^-nk細(xì)胞相比，tim-3⁺nk細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的th2型細(xì)胞因子和較低水平的th1型細(xì)胞因子，并呈現(xiàn)出較弱的殺傷活性，這些表型特征將更有利于維持妊娠外周免疫的耐受狀態(tài)。

2)tim-3天然配體gal-9對(duì)外周血nk細(xì)胞分化發(fā)育與功能相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)節(jié)

用tim-3的天然配體galectin-9處理外周nk細(xì)胞能明顯促進(jìn)與nk細(xì)胞分化發(fā)育及功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子id-2、blimp1、gata-3在mrna水平的表達(dá)，而調(diào)控nk細(xì)胞殺傷活性的轉(zhuǎn)錄因子eomes的表達(dá)則明顯下調(diào)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，gal-9通過(guò)活化akt、 jnk兩條信號(hào)通路，促進(jìn)nk細(xì)胞產(chǎn)生th2型細(xì)胞因子，抑制其th1型細(xì)胞因子生成，并且有效降低nk細(xì)胞殺傷活性；因此，nk細(xì)胞上的tim-3受體與galectin-9相互作用，通過(guò)活化akt、jnk信號(hào)通路，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子id-2、blimpl、gata-3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)外周nk細(xì)胞向免疫耐受表型分化。

3)，gal-9/tim-3信號(hào)對(duì)外周血nk細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌格局和殺傷活性的影響

研究提示tim-3通過(guò)與其配體gal-9結(jié)合可能參加nk細(xì)胞的表型與功能調(diào)節(jié)，因此，進(jìn)一步在外周nk細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入了rhgal-9或anti-tim-3中和性抗體，處理48小時(shí)后，rhgal-9處理組il-4、il-10產(chǎn)生水平明顯升高，而tnf-α產(chǎn)生水平則明顯降低；單獨(dú)用anti-tim-3中和性抗體處理組細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平在處理前后無(wú)明顯變化，但是rhgal-9和anti-tim-3聯(lián)合處理組il-4、il-10產(chǎn)生水平明顯低于rhgal-9處理組，tnf-α產(chǎn)生水平則相反；實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示tim-3/gal-9信號(hào)參與nk細(xì)胞優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生th2型細(xì)胞因子(如圖4c所示)；

此外，rhgal-9處理后的外周血nk細(xì)胞殺傷活性顯著下降，這一作用被anti-tim-3中和性抗體部分恢復(fù)，而單獨(dú)用anti-tim-3中和性抗體則無(wú)明顯作用；同樣，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rhgal-9或anti-tim-3中和性抗體處理后的nk細(xì)胞穿孔素perforin的產(chǎn)生水平也發(fā)生了上述改變(如圖4d，e所示)。

4)gal-9/tim-3相互作用通過(guò)活化jnk、akt信號(hào)調(diào)節(jié)外周血nk細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步解析tim-3/gal-9調(diào)節(jié)外周血nk細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用rhgal-9分別刺激純化的外周血nk細(xì)胞10分鐘、30分鐘、60分鐘，westernblot檢測(cè)外周血nk細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況，如圖4f所示，與nk細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，rhgal-9刺激后，akt、jnk和erk的磷酸化水平顯著升高而nk-κb的磷酸化水平在刺激前后沒(méi)有明顯變化，提示tim-3/gal-9很有可能通過(guò)活化akt、jnk和erk這三條信號(hào)通路來(lái)調(diào)控外周nk細(xì)胞的功能；

為了明確上述可能的信號(hào)通路，將akt、jnk和erk三條信號(hào)通路的特異性抑制劑加入gal-9處理nk細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)nk細(xì)胞細(xì)胞因子和穿孔素的產(chǎn)生水平，如圖4g所示，用jnk或akt的特異性阻斷劑可以抑制gal-9對(duì)nk細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，而erk的特異性阻斷劑則沒(méi)有明顯作用；結(jié)果表明，gal-9是通過(guò)活化jnk、akt兩條信號(hào)通路進(jìn)一步改變nk細(xì)胞的生物學(xué)功能，而不是erk。

實(shí)施例3：早孕外周nk細(xì)胞galectin-9/tim-3信號(hào)異常致nk功能障礙與妊娠失敗實(shí)驗(yàn)

1)自然流產(chǎn)患者外周nk細(xì)胞tim-3表達(dá)水平下降gal-9產(chǎn)生水平降低，nk細(xì)胞細(xì)

胞因子分泌水平紊亂，殺傷活性增強(qiáng)

為研究外周nk細(xì)胞數(shù)量與功能的異常與自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)正常妊娠和自然流產(chǎn)患者的外周血nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)是否有差異，血液中g(shù)al-9的含量是否有改變，nk細(xì)胞的功能是否也相應(yīng)變化？本實(shí)驗(yàn)采集了早期正常妊娠和不明原因自然流產(chǎn)患者的外周血，用流式細(xì)胞術(shù)針對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行了檢測(cè)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管tim-3+nk細(xì)胞在外周免疫活性細(xì)胞中所占的比例沒(méi)有發(fā)生明顯升降，但是tim-3在nk細(xì)胞表達(dá)的熒光密度在流產(chǎn)患者外周血中顯著降低(如圖5.1a所示)，進(jìn)一步系統(tǒng)比較正常妊娠和反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周tim-3+nk細(xì)胞的差異，利用atac-seq技術(shù)檢測(cè)和分析正常妊娠和反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周tim-3+nk細(xì)胞和tim-3-nk細(xì)胞的染色質(zhì)可接近性，主要成分分析結(jié)果顯示，病人tim-3+nk細(xì)胞和tim-3-nk細(xì)胞與正常人nk細(xì)胞可以很好的區(qū)分開(kāi)(如圖5.1d所示)，聚類分析的結(jié)果與主要成分分析結(jié)果是一致的，提示tim-3+nk細(xì)胞是與妊娠結(jié)局密切相關(guān)的功能細(xì)胞；進(jìn)一步對(duì)流產(chǎn)患者和正常妊娠女性外周tim-3+nk細(xì)胞進(jìn)行比較和分析，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)患者tim-3+nk細(xì)胞中有260個(gè)基因位點(diǎn)的染色質(zhì)可接近性下降，360個(gè)基因位點(diǎn)的染色質(zhì)可接近性升高(如圖5.1e所示)，結(jié)合已知的人cd56+nk細(xì)胞的chip-seq結(jié)果分析，染色質(zhì)可接近性降低的基因位點(diǎn)主要是增強(qiáng)子，而染色質(zhì)可接近性升高的基因位點(diǎn)主要的是啟動(dòng)子，其中，tgf-β1的3’端的染色質(zhì)可接近性降低最顯著，與此同時(shí)，tgf-β1的啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)可接近性也明顯降低，提示tgf-β13’端區(qū)域可能發(fā)揮著增強(qiáng)子的作用，與tgf-β1啟動(dòng)子協(xié)同調(diào)控tgf-β1的表達(dá)(如圖5.1f所示)，il-10的染色質(zhì)可接近性也有同樣的改變(如圖5.1g所示)；

進(jìn)一步檢測(cè)nk細(xì)胞產(chǎn)生th2、th1型細(xì)胞因子和反應(yīng)其殺傷活性的穿孔素perforin發(fā)現(xiàn)，由tim-3⁺pnk細(xì)胞產(chǎn)生的th2型細(xì)胞因子(l-4，il-10及tgf-β1)在流產(chǎn)患者外周血明顯下降，相反地，th1型細(xì)胞因子(tnf-α、ifn-γ)則明顯升高，tim-3^-pnk細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平在兩種樣本中并無(wú)明顯的差異(如圖5.1h，i所示)；同樣地，tim-3⁺pnk細(xì)胞而不是tim-3^-pnk細(xì)胞產(chǎn)生的穿孔素perforin在流產(chǎn)患者外周血中明 顯上調(diào)(如圖5.1j所示)，提示流產(chǎn)患者外周nk細(xì)胞殺傷活性明顯增強(qiáng)，而這主要是因?yàn)閠im-3⁺pnk細(xì)胞毒性的升高；

如圖5.1b所示，流產(chǎn)患者外周血gal-9分泌水平由正常情況下的1.84ng/ml下降到0.965ng/ml，另外，包括nk細(xì)胞自身在內(nèi)的各外周免疫活性細(xì)胞(cd4⁺、cd8⁺tcells，cd14⁺單核細(xì)胞和cd11c⁺樹(shù)突狀細(xì)胞)產(chǎn)生gal-9的水平也均有明顯的下調(diào)(如圖5.1c所示)；上述結(jié)果說(shuō)明外周nk細(xì)胞tim-3表達(dá)的降低及外周gal-9產(chǎn)生水平的下調(diào)可能破壞了外周nk細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子和維持較低的殺傷活性而發(fā)揮的免疫耐受作用，進(jìn)而導(dǎo)致自然流產(chǎn)。

實(shí)施例4：干擾gal-9/tim-3信號(hào)通路對(duì)妊娠結(jié)局的影響實(shí)驗(yàn)

基于已經(jīng)驗(yàn)證了gal-9/tim-3在妊娠早期外周血中異常表達(dá)可能與自然流產(chǎn)有關(guān)，為了進(jìn)一步解析這一對(duì)分子介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)妊娠結(jié)局的影響及分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)正常和流產(chǎn)小鼠模型的gal-9/tim-3信號(hào)進(jìn)行人為干預(yù)；首先建立正常和流產(chǎn)小鼠模型，比較早孕和中孕期小鼠外周(包括外周血和脾臟)nk細(xì)胞tim-3的表達(dá)，結(jié)果顯示，正常妊娠小鼠的早孕期外周nk細(xì)胞tim-3表達(dá)高于中孕期，與人是一致的，也就是說(shuō)tim-3+nk細(xì)胞在妊娠早期富集；圖5.1a的結(jié)果顯示流產(chǎn)患者外周nk細(xì)胞gal-9/tim-3差異表達(dá)伴隨nk細(xì)胞功能紊亂，本實(shí)驗(yàn)分析比較了tim-3與gal-9在正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型早孕期外周nk細(xì)胞上的表達(dá)，如圖5.2a，b所示，相對(duì)于正常妊娠小鼠，自然流產(chǎn)小鼠nk細(xì)胞在外周血和脾臟中表達(dá)tim-3和gal-9的水平均明顯下降，不僅如此，自然流產(chǎn)模型tim-3+pnk產(chǎn)生th2型細(xì)胞因子(il-4，il-10及tgf-β)的水平降低，而產(chǎn)生th1型細(xì)胞因子的水平(tnf-α)則升高；流式細(xì)胞術(shù)分析顆粒酶a(granzymea，反映nk細(xì)胞的殺傷活性)也發(fā)現(xiàn)在自然流產(chǎn)模型外周tim-3+nk細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常妊娠模型tim-3+nk；分析脾臟中的上述指標(biāo)，與外周血的結(jié)果是一致的；(圖5.2c，d)顯示了不管是在外周血還是，在脾臟，tim-3-nk分泌細(xì)胞因子的功能和殺傷活性在正常妊娠和自熱流產(chǎn)模型中幾乎沒(méi)有差異，結(jié)果表明gal-9/tim-3與妊娠外周nk細(xì)胞正常功能的發(fā)揮密切相關(guān)；

為了明確tim-3/gal-9在妊娠中的作用，本實(shí)驗(yàn)用重組的外源性的gal-9和rm3-23(tim-3信號(hào)通路的阻斷劑)來(lái)干預(yù)妊娠小鼠體內(nèi)gal-9/tim-3信號(hào)通路，正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型在用rmt3-23阻斷tim-3信號(hào)通路后，兩組的胚胎吸收率均明顯 上升，正常妊娠模型由5％左右的胚胎吸收率增加至17％，而自然流產(chǎn)模型原本就較高的胚胎吸收率由約27％增加至約46％(圖6a，d)；相應(yīng)的，正常妊娠模型存活下來(lái)的胎仔數(shù)由10只降到6只，自然流產(chǎn)模型則由干預(yù)前的7只降到4只(如圖6a，c所示)；盡管正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型的胚胎吸收率有明顯的差異，但是存活的胚胎大小并無(wú)差異；然而，用rmt3-23注射小鼠后，兩種模型的小鼠胚胎體積均明顯小于未注射組，推測(cè)tim-3信號(hào)的阻斷不僅會(huì)影響胚胎吸收率，對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育也有顯著的抑制作用(如圖6b，e所示)；為了證明tim-3信號(hào)的阻斷是否會(huì)對(duì)nk細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析了上述處理組小鼠的外周血和脾臟nk細(xì)胞，結(jié)果顯示，注射了rmt3-23的小鼠其外周血中的nk細(xì)胞數(shù)量急劇降低，由處理前的5-10％降到1-2％，甚至達(dá)到刪除水平，但是脾臟中的nk細(xì)胞數(shù)量并沒(méi)有發(fā)生改變；進(jìn)一步分析脾臟nk細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn)正常妊娠小鼠脾臟nk細(xì)胞il-4、il-10、tgf-β的產(chǎn)生水平在阻斷tim-3信號(hào)后顯著下降，tnf-α則顯著上升，inf-上在阻斷前后無(wú)明顯差異；tim-3信號(hào)阻斷對(duì)正常妊娠脾臟nk細(xì)胞的作用在自然流產(chǎn)模型中體現(xiàn)得更加顯著(如圖6f所示)；對(duì)脾臟nk細(xì)胞顆粒酶a(granzymea)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)模型在tim-3阻斷后產(chǎn)生更高水平的granzymea，提示nk細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)，而tim-3阻斷沒(méi)有增強(qiáng)正常妊娠組nk細(xì)胞的殺傷活性，反而呈現(xiàn)出一定水平的降低，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，tim-3在正常妊娠過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)外周nk細(xì)胞的功能起保護(hù)作用，如果tim-3所介導(dǎo)的信號(hào)通路被破壞，會(huì)影響外周nk細(xì)胞的功能甚至分化發(fā)育，從而影響妊娠的正常進(jìn)行和胚胎的發(fā)育；

本實(shí)驗(yàn)給孕鼠注射外源性重組gal-9，以期是否會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局有所改善，結(jié)果顯示，給予外源性gal-9確實(shí)能在一定程度上改善妊娠結(jié)局：對(duì)于自然妊娠模型，能降低胚胎吸收率，增加存活的胎仔數(shù)，但對(duì)tim-3阻斷的自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型的妊娠結(jié)局無(wú)明顯的改善作用；檢測(cè)脾臟nk細(xì)胞的功能發(fā)現(xiàn)，注射gal-9的自然流產(chǎn)模型的nk細(xì)胞il-4、tgf-β的產(chǎn)生水平上升，inf-γ下降，granzymea也下降，而il-10、tnf-α沒(méi)有明顯改變；預(yù)先用rmt3-23阻斷tim-3的正常妊娠模型和自然流產(chǎn)模型，給予gal-9后nk細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生水平和殺傷活性均沒(méi)有顯著變化；上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，gal-9是通過(guò)與其受體tim-3結(jié)合并相互作用來(lái)調(diào)節(jié)外周nk細(xì)胞的功能從而維持正常妊娠順利進(jìn)行，如果tim-3的信號(hào)通路被阻斷，則gal-9無(wú)法與tim-3正常結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(如圖6所示)；

因此，galectin-9/tim-3信號(hào)通路異常會(huì)引起早孕外周血nk細(xì)胞功能紊亂致不良妊娠結(jié)局。

實(shí)施例5：過(guò)繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細(xì)胞挽救妊娠失敗實(shí)驗(yàn)

從正常妊娠小鼠的脾臟中流式分選出tim-3⁺nk，tim-3^-nk和總nk細(xì)胞，分別將上述三種細(xì)胞重懸于200ulpbs中，經(jīng)尾靜脈注射過(guò)繼轉(zhuǎn)輸給懷孕第4.5天的流產(chǎn)小鼠；用同樣的方法從流產(chǎn)小鼠的脾臟中得到tim-3⁺nk，tim-3^-nk和總nk細(xì)胞，tim-3⁺nk，tim-3^-nk和其中一部分nk細(xì)胞用同樣的方法過(guò)繼轉(zhuǎn)輸給流產(chǎn)小鼠，另一部分nk細(xì)胞分別用il-4和孕酮體外刺激，48小時(shí)后，再次流式分選tim-3⁺nk，tim-3^-nk細(xì)胞，按照上述方法過(guò)繼轉(zhuǎn)輸給流產(chǎn)小鼠，孕14.5天處死流產(chǎn)小鼠，觀察胚胎吸收情況(如圖7a所示)，結(jié)果顯示，正常妊娠小鼠tim-3⁺nk降低流產(chǎn)模型胚胎吸收率，而流產(chǎn)小鼠tim-3⁺nk無(wú)顯著作用，但是經(jīng)過(guò)il-4和孕酮刺激的tim-3⁺nk細(xì)胞有效緩解流產(chǎn)模型高胚胎吸收率(圖7d所示)；

建立nk細(xì)胞缺陷小鼠(nfil3^-/^-)的早孕模型，于孕4.5天按上述方法過(guò)繼轉(zhuǎn)輸正常妊娠nfil3⁺/⁺小鼠脾臟的tim-3⁺nk與tim-3^-nk細(xì)胞，于孕14.5天處死nfil3^-/^-孕鼠，觀察胚胎著床數(shù)與胚胎吸收率，結(jié)果顯示過(guò)繼轉(zhuǎn)輸tim-3⁺nk細(xì)胞降低nk細(xì)胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，過(guò)繼轉(zhuǎn)輸tim-3^-nk細(xì)胞不影響妊娠結(jié)局(如圖7e，f所示)。