本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種火炬樹果實(shí)提取物(extractionfromrhustyphina,rtse)、制備方法及該提取物在基因工程產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

火炬樹(rhushirtal.)，漆樹科植物，原產(chǎn)于北美的落葉灌木，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，1959年由中國科學(xué)院植物研究所引種于我國，1974年以來向全國各省區(qū)推廣，以黃河流域以北各省(區(qū))栽培較多?；鹁鏄涔麑?shí)既可以作為飲食調(diào)味品，也可以制作成飲料或其他藥物使用，有報(bào)道指出火炬樹果實(shí)提取物可以抗癌、抗炎甚至具有清血，利尿，健胃的功效，針對rtse的抗氧化及自由基清除活性，以及火炬樹色素的提取及應(yīng)用在我國已經(jīng)有諸多專利申請并獲得授權(quán)，而本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)一定濃度的rtse對基因工程常用宿主大腸桿菌的生長有一定的促進(jìn)作用，基于此我們課題組從2011年至今在吉林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(2011a34064、2012c34100、2016b34216)支持下進(jìn)行了詳細(xì)的研究，現(xiàn)根據(jù)研究成果提出本專利申請。

由于大腸桿菌(escherichiacoli)可以在較為廉價(jià)的培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度的快速發(fā)酵，已經(jīng)被廣泛的用作基因工程外源基因表達(dá)的宿主，cd4、木糖異構(gòu)酶、木聚糖酶、t4dna連接酶以及一系列人的免疫調(diào)節(jié)因子、生長因子、激素血蛋白和疫苗等經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的產(chǎn)品都在重組大腸桿菌中得以生產(chǎn)(hodgsonj.bio/technology.,1993,11:887-893)。lac/tac啟動(dòng)子是目前最為廣泛應(yīng)用的調(diào)控外源蛋白在菌中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子，它的作用機(jī)制在分子水平上被闡述的最為清晰(augerea.etal.,biotechnollett.,1987,8:157～162)，而衍生自lac啟動(dòng)子的以異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside,iptg)誘導(dǎo)的lacuv5-t7基礎(chǔ)表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的外源蛋白的表達(dá)體系是目前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)較常見的外源蛋白表達(dá)體系，該體系具有轉(zhuǎn)錄水平高、蛋白表達(dá)量大、誘導(dǎo)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)(kilikianb.v.,processbiochem.,2000,35(9):1019～1025；stanleyt.,proc.nati.acad.sci.,1985,82(4):1074～1078.)。但是，donovanrs指出iptg誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)僅適用于實(shí)驗(yàn)室研究而不適用于工業(yè)生產(chǎn)(donovanrs.,journalofindustrialmicrobiology,199616,145～154.)，其原因在于：①iptg價(jià)格昂貴，iptg終濃度達(dá)到1mm時(shí)，發(fā)酵體系成本增加6美元/升發(fā)酵液，而在較大的發(fā)酵體系中，如200l發(fā)酵體系，其iptg消耗為1200美元(woyskid.etal.archivesofbiochemistryandbiophysics2001,388(2):276～280)；②iptg對人具有潛在毒性，與重組蛋白不易分離，一些國家已經(jīng)明文規(guī)定生產(chǎn)人用重組蛋白過程中不能使用iptg(zl201010221511.8；donovanrs.,journalofindustrialmicrobiology,199616,145～154.)；③iptg對菌體生長有一定的抑制作用(donovanrs.,journalofindustrialmicrobiology,199616,145～154.)，菌體量對外源蛋白的表達(dá)非常重要，iptg對菌體的抑制作用，同樣也限制了外源蛋白的高效表達(dá)(donovanrs.,journalofindustrialmicrobiology,199616,145～154.)。因此，研究開發(fā)可以降低iptg使用量的方法對于各種利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn),具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

iptg誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)外源蛋白時(shí)，所需iptg濃度在0.8～1.0mm左右(bentleywe.etal.biotechnolbioeng38:749-760.)，高濃度的iptg在基因工程產(chǎn)品中的殘余無法徹底清除，對人體具有毒害作用，而高濃度的iptg誘導(dǎo)下，部分外源蛋白容易形成包涵體，而包涵體形式的蛋白并非基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)需要的可溶性、活性蛋白，包涵體的變性-復(fù)性一直是領(lǐng)域內(nèi)的難點(diǎn)。為降低iptg使用量，人們構(gòu)建了分泌型外源蛋白表達(dá)體系，此時(shí)iptg的使用濃度可以大幅度降低，濃度范圍降至0.01～0.1mm(donovanrs.,journalofindustrialmicrobiology,199616,145～154.)，但是并不是每個(gè)蛋白都適合進(jìn)行分泌型表達(dá)。

為克服iptg的不利影響，溫度誘導(dǎo)的lac體系、乳糖誘導(dǎo)的lac體系等方法被不同的課題組開發(fā)應(yīng)用，但是溫度誘導(dǎo)對于工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵而言能耗較大、成本較高(murrayne.etal.jmolecbiol,1979132:493～505.)；乳糖誘導(dǎo)時(shí)，乳糖作為菌的碳源對宿主的增殖及生理行為具有諸多影響，基因工程產(chǎn)品質(zhì)量控制較難(beckwithjr.1987.cellularandmolecularbiology.americansocietyformicrobioloty,washington,dc.vol2,pp1444～1452.)。

本發(fā)明所提供的rtse可以有效降低iptg濃度，使發(fā)酵體系在較低iptg濃度下，大量生產(chǎn)目的產(chǎn)品，并且rtse可以在培養(yǎng)基配制過程中添加，并隨同培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌操作，而無需在發(fā)酵進(jìn)程中額外添加，使基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)過程進(jìn)一步簡化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種rtse制備方法，并將得到的rtse應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品發(fā)酵，以降低基因工程產(chǎn)品發(fā)酵過程中誘導(dǎo)劑iptg的使用量。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種火炬樹果實(shí)提取物rtse的制備方法，該方法包括：(1)將火炬樹果實(shí)干燥，使含水量的重量百分比低于10％；(2)將干燥后的火炬樹果實(shí)與提取液混合，得到混合后的物料，提取液為10～50％體積含量的乙醇水溶液，相對于1kg干燥的火炬樹果實(shí)，所述提取液的用量為5～15l；(3)將混合后的物料在微沸狀態(tài)下加熱回流1～4小時(shí)，然后冷卻至室溫，過濾離心后得到清液；(4)按照8～12：1的體積比例將得到的清液減壓濃縮并通過0.22μm的濾膜過濾除菌，得到本發(fā)明所述火炬樹果實(shí)提取物液體(extractionfromrhustyphina,rtse)。

上述rtse經(jīng)behc181.7um2.1*100mm色譜柱分離，xevog2qtof質(zhì)譜分析，所得rtse中以保留時(shí)間為0.70分鐘和1.57分鐘的成分為主，兩者在液相色譜圖中面積之和占總面積量50％以上，分析結(jié)果見圖1。

本發(fā)明還提供了如上所述的制備方法得到的rtse及其在基因工程產(chǎn)品發(fā)酵中的用途。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明得到的rtse可以增加基因工程發(fā)酵體系中宿主菌的菌量，發(fā)酵體系中單獨(dú)使用所述rtse時(shí)，發(fā)酵體系中宿主細(xì)胞生物量提高5％以上，總蛋白量及外源蛋白活性表達(dá)量均提高20％以上；發(fā)酵體系中所述rtse與iptg共同使用時(shí)，發(fā)酵體系中宿主細(xì)胞生物量提高12％以上，總蛋白量提高30％以上，外源蛋白活性表達(dá)量提高35％以上。

本發(fā)明提供的火炬樹果實(shí)提取物可以有效降低發(fā)酵體系中iptg的使用量(添加火炬樹果實(shí)提取物的發(fā)酵體系中iptg使用量降至常規(guī)發(fā)酵體系iptg使用量的5％以下，體系所表達(dá)目的蛋白量與常規(guī)發(fā)酵體系相當(dāng)甚至更高)，在較低iptg濃度下，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)，節(jié)約發(fā)酵成本，降低發(fā)酵產(chǎn)品毒性。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1：實(shí)施例1中rtse的uplc-ms圖譜(色譜柱behc181.7um2.1*100mm，溶液a:水+0.1％(體積百分比)三氟乙酸，溶液b:乙腈)；

圖2：實(shí)施例2中rtse對lacq(灰色)以及l(fā)acuv5-t7(黑色)外源蛋白表達(dá)體系的影響。分別從(a)生物質(zhì)表達(dá)量，(b)蛋白表達(dá)量，(c)目標(biāo)蛋白精氨酸酶活性表達(dá)量，三個(gè)角度探索實(shí)施例2中rtse對lacq以及l(fā)acuv5-t7的影響。

圖3：實(shí)施例3中rtse添加量對iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系活性表達(dá)外源蛋白表達(dá)能力的影響?；疑珵闊oiptg誘導(dǎo)組，黑色為有0.05mmiptg誘導(dǎo)組。分別從(a)生物質(zhì)表達(dá)量，(b)蛋白表達(dá)量，(c)目標(biāo)蛋白精氨酸酶活性表達(dá)量，三個(gè)角度探索實(shí)施例3中rtse對iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系活性表達(dá)外源蛋白表達(dá)能力的影響。

圖4：實(shí)施例4中rtse對iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系活性表達(dá)外源蛋白表達(dá)能力的影響?；疑珶ortse預(yù)先添加，黑色rtse在發(fā)酵體系中濃度為3.7mg/l。分別從(a)生物質(zhì)表達(dá)量，(b)蛋白表達(dá)量，(c)目標(biāo)蛋白精氨酸酶活性表達(dá)量，三個(gè)角度研究實(shí)施例4中rtse對iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系活性表達(dá)外源蛋白表達(dá)能力的影響。

圖5：實(shí)施例5中氧供給對rtse影響iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系活性表達(dá)外源蛋白表達(dá)能力的影響?；疑珶ortse預(yù)先添加，黑色rtse在發(fā)酵體系中濃度為3.7mg/l，iptg誘導(dǎo)濃度為50mm。分別從(a)生物質(zhì)表達(dá)量，(b)蛋白表達(dá)量，(c)目標(biāo)蛋白精氨酸酶活性表達(dá)量，三個(gè)角度研究實(shí)施例5中氧供給對rtse影響iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系活性表達(dá)外源蛋白表達(dá)能力的影響。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的經(jīng)濟(jì)體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

在本發(fā)明中，在未做相反說明的情況下，使用的液體或者氣體的體積數(shù)值均是20℃，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的數(shù)值。

實(shí)施例1

rtse的制備

將新鮮的火炬樹果實(shí)置室溫陰涼通風(fēng)處陰干，然后60℃鼓風(fēng)干燥至含水量重量5％，將所述干燥火炬樹果實(shí)與體積百分?jǐn)?shù)為20％的乙醇水溶液混合，相對于1kg的干燥火炬樹果實(shí)，乙醇水溶液的用量為8l，得到混合后的物料，將所述混合后的物料置圓底燒瓶中加熱，保持處于微沸狀態(tài)下回流2小時(shí)，將回流后的物料冷卻后以中空纖維濾膜過濾，將過濾后的物料在5000rpm的條件下離心30分鐘，取得清液，將清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45℃減壓除去乙醇并按照10:1比例進(jìn)行濃縮后通過0.22μm的濾膜過濾除菌，得到rtse。

所得rtse采用福林酚試劑法測定多酚含量；采用硫酸-苯酚法測定多糖含量；采用bradford方法測定蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示所得rtse中含多酚74.7g/l、總糖0.117g/l、蛋白質(zhì)0.230g/l。

所得rtse經(jīng)uplc-ms分離鑒定(色譜柱behc181.7um2.1*100mm，，溶液a:水+0.1％(體積百分比)三氟乙酸，溶液b:乙腈)符合圖1特征，即：保留時(shí)間為0.70、1.57、2.19、2.81、3.98和5.31分鐘的組分的峰面積和不低于總面積的65％。保留時(shí)間為0.70分鐘和1.57分鐘的成分為主，兩者液相色譜峰的面積之和占總液相色譜峰面積的50％以上。

在后續(xù)各例中采用多酚濃度標(biāo)示rtse添加劑量。

實(shí)施例2

rtse對lacuv5-t7體系及l(fā)aciq體系表達(dá)外源能力的影響

本實(shí)施例中以大腸桿菌bl21(de3)宿主，lacuv5-t7體系采用pet28a質(zhì)粒；laciq體系采用puc19質(zhì)粒。外源目的基因精氨酸酶的編碼基因分別插入到兩個(gè)質(zhì)粒的lac啟動(dòng)子后面。

質(zhì)粒puc-arg(laciq)，pet28a-arg(lacuv5-t7)；菌株e.colibl21(de3)[f-ompthsds(r-bm-b)galdcm(de3)]購自transgenbiotech公司。

采用實(shí)施例1中制備的rtse，以去離子水進(jìn)行預(yù)稀釋，使得各個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中rtse的終濃度分別為74.7、18.7、3.7和0.7mg/l。

2.1rtse對bl21(de3)-puc-arg的影響

bl21(de3)-puc-arg轉(zhuǎn)化子挑取單菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，32℃恒溫振蕩器150rpm過夜。再將復(fù)壯的菌液以3od的接菌量分別轉(zhuǎn)接到5瓶含100μg/ml氨芐青霉素的新鮮lb培養(yǎng)基中，100mllb培養(yǎng)基置于250ml錐形瓶，在其中4瓶培養(yǎng)基中分別加入100μl不同濃度的rtse，另一瓶加100μl無菌水作為對照，于37℃恒溫振蕩器中180rpm培養(yǎng)25小時(shí)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組中發(fā)酵液終體積相同，除rtse外各個(gè)組成成分相同。

2.2rtse對bl21(de3)-pet28a-arg的影響

bl21(de3)-pet28a-arg轉(zhuǎn)化子挑取單菌落于含35μg/ml的卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中37℃恒溫振蕩器200rpm培養(yǎng)9小時(shí)，按照3od接菌量分別接入5瓶含35μg/ml卡那霉素的100ml新鮮lb液體培養(yǎng)基中，其中4瓶分別添加不同濃度提取物100μl，另一瓶加100ul無菌水作為對照，于37℃恒溫振蕩器中180rpm培養(yǎng)25小時(shí)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組中發(fā)酵液終體積相同，除rtse外各個(gè)組成成分相同。

2.3生物質(zhì)量、蛋白量及酶活性檢測

發(fā)酵體系中的生物質(zhì)量即為發(fā)酵體系中od595總量，od595在本發(fā)明中采用uv1700分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

使用uv1700測定各組菌液的od595，再將各組菌分別5000rpm離心20分鐘，獲得的菌體利用200mm，ph8.2的tris緩沖液洗滌后離心，超聲裂菌20分鐘，10000rpm離心20分鐘取上清，為粗蛋白樣品，用于進(jìn)一步檢測精氨酸酶活性。

粗蛋白樣品的蛋白含量采用bca蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行檢測。

目標(biāo)基因工程外源蛋白——精氨酸酶活性表達(dá)情況，采用r&dsystems公司的精氨酸酶(rharg1#5868-ar)活性檢測方法進(jìn)行檢測，通過測定底物l-argininehcl水解產(chǎn)生的尿素進(jìn)行精氨酸酶活性測定，在96孔板中分別添加尿素標(biāo)準(zhǔn)樣品0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、20mm各50μl，粗蛋白樣品反應(yīng)體系為：稀釋一定倍數(shù)樣品40μl，25mmmncl25μl，300mml-argininehcl5μl，37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)。在50mm硼酸，1m硫酸，0.03％(質(zhì)量/體積)的十二烷基聚乙二醇醚(brij35)溶液中混合稀釋鄰苯二甲醛(opa)、n-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸(ned)至終濃度均為2mm，混勻后立即向96孔板中添加200μl混合液，室溫放置15分鐘，在酶標(biāo)儀上讀取520nm吸光值，根據(jù)尿素含量計(jì)算酶活性。

2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有測試均進(jìn)行了6次平行操作，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)graphpadprism軟件雙因素方差分析方法(two-wayanova)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05為具有顯著性差異。

數(shù)據(jù)表明：

rtse的存在對laciq體系、lacuv5-t7發(fā)酵體系中宿主細(xì)胞生物量均有顯著提高(p<0.05)，在發(fā)酵體系中rtse濃度達(dá)到74.7mg/l時(shí)，宿主細(xì)胞生物量比對照組提高5％以上。

rtse濃度對laciq體系、lacuv5-t7體系的總蛋白量及目標(biāo)外源蛋白的活性表達(dá)能力具有極顯著影響(p<0.001)，rtse存在條件下，發(fā)酵體系總蛋白量及外源蛋白活性表達(dá)量均提高20％以上。與laciq體系需要在rtse較高濃度下呈現(xiàn)明顯的外源蛋白活性表達(dá)量提升不同，lacuv5-t7體系在較低濃度rtse條件下就呈現(xiàn)了較強(qiáng)的外源蛋白表達(dá)能力，rtse濃度為18.7mg/l時(shí)，與對照組相比lacuv5-t7體系精氨酸酶的活性表達(dá)提高了39.1％，在此條件下，lacuv5-t7體系總蛋白量提高不足0.9％，可以通過添加rtse實(shí)現(xiàn)外源蛋白的可溶性、活性表達(dá)。

實(shí)施例3

不同濃度rtse，對iptg誘導(dǎo)lacuv5-t7體系外源蛋白活性表達(dá)的影響。

考察發(fā)酵液中添加0.05mmiptg時(shí)，不同rtse濃度對lacuv5-t7表達(dá)活性精氨酸酶能力的影響。

采用實(shí)施例1中制備的rtse，使得rtse在發(fā)酵體系中的濃度分別為74.7mg/l、18.7mg/l、3.7mg/l和0.7mg/l。

采用實(shí)施例2中的pet28a-arg質(zhì)粒，以大腸桿菌bl21(de3)作為宿主。

采用實(shí)施例2中的生物質(zhì)量、蛋白量、酶活測定方法以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

3.1rtse與iptg相互作用

bl21(de3)-pet28a-arg轉(zhuǎn)化子挑取單菌落于含35μg/ml的卡那霉素100m的lb液體培養(yǎng)基中37℃恒溫振蕩器200rpm培養(yǎng)9小時(shí)，按照3od接菌量接入6瓶新鮮含相同量卡那霉素100ml的lb培養(yǎng)基，其中4瓶分別添加不同濃度提取物100μl，37℃200rpm待od595約為0.8時(shí)加入終濃度為0.05mmiptg誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，另外兩瓶未加rtse作為對照組，其中1瓶未加提取物的也不加iptg做為陰性對照，16℃200rpm培養(yǎng)16小時(shí)；一瓶37℃200rpm待od595約為0.8時(shí)加入終濃度為0.05mmiptg誘導(dǎo)目標(biāo)到白表達(dá)誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)作為陽性對照組。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組中發(fā)酵液終體積相同，除rtse及iptg外，各個(gè)組成成分相同。

數(shù)據(jù)表明：

iptg加入后與預(yù)先在培養(yǎng)基中添加rtse的組別相比，未添加rtse的各組發(fā)酵體系中宿主細(xì)胞的含量均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，p<0.001。rtse的添加不能完全克服iptg對宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，但是隨著發(fā)酵體系中rtse含量的增加，宿主細(xì)胞的含量顯著增加(p<0.05)，發(fā)酵體系中添加rtse后，較無rtse添加體系，宿主細(xì)胞生物量提高12％以上。

iptg的添加顯著提高lacuv5-t7體系的外源蛋白活性表達(dá)量，p<0.001；rtse的預(yù)先添加同樣顯著增加lacuv5-t7體系的外源蛋白活性表達(dá)量，p<0.001；iptg誘導(dǎo)條件下，rtse在發(fā)酵體系內(nèi)的濃度與外源蛋白的活性表達(dá)量呈顯著相關(guān)性。預(yù)先添加rtse的發(fā)酵體系與未添加rtse的發(fā)酵體系相比，總蛋白合成能力顯著增加(p<0.001)，發(fā)酵體系中添加rtse，可以顯著提高總蛋白量，添加rtse后較添加rtse前總蛋白量增加30％以上，蛋白質(zhì)合成能力的增加與rtse的濃度明顯呈正相關(guān)性，p<0.05。尤為重要的是，與無rtse體系相比，有rtse的發(fā)酵體系中外源蛋白活性表達(dá)量提高35％以上，從而提高目的蛋白產(chǎn)量。

實(shí)施例4

rtse存在前提下，iptg對lacuv5-t7體系的影響。

考察發(fā)酵液中預(yù)先添加rtse使得發(fā)酵體系中含有3.7mg/l的rtse時(shí)，iptg濃度對lacuv5-t7表達(dá)活性精氨酸酶能力的影響。

采用實(shí)施例1中制備的rtse，采用實(shí)施例2中的pet28a-arg質(zhì)粒，以大腸桿菌bl21(de3)作為宿主。

采用實(shí)施例2中的生物質(zhì)量、蛋白量、酶活測定方法以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

4.1rtse對iptg誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)能力的影響

在100ml的bl21((de3))-pet28a-arg發(fā)酵體系中，添加rtse100μl，使得反應(yīng)體系中rtse最終濃度為3.7mg/l，誘導(dǎo)時(shí)的iptg終濃度分別為0、0.05、0.2、0.5和1mm。

無rtse條件下，在100ml的bl21((de3))-pet28a-arg發(fā)酵體系中，添加無菌水100μl，誘導(dǎo)時(shí)的iptg終濃度分別為0、0.05、0.2、0.5和1mm。

數(shù)據(jù)表明：

隨著發(fā)酵體系中iptg濃度的增加，宿主細(xì)胞的增殖能力顯著降低，p<0.0001。這一點(diǎn)與前人報(bào)道的iptg對于宿主細(xì)胞具有毒性相一致。正如donovanrs指出，降低宿主細(xì)胞增殖能力將降低外源目標(biāo)蛋白的表達(dá)能力(donovanrs.,journalofindustrialmicrobiology,199616,145～154.)。隨著發(fā)酵體系中iptg使用濃度的提高，rtse對發(fā)酵體系中宿主細(xì)胞含量的增加作用更加顯著(p<0.05)，rtse預(yù)先添加到發(fā)酵體系中可以緩解iptg對宿主細(xì)胞的毒性作用，保護(hù)宿主細(xì)胞的增殖能力。

尤為重要的是，發(fā)酵體系中rtse的存在可以提高外源蛋白活性表達(dá)，因此可以在較低iptg濃度下實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效表達(dá)，以降低發(fā)酵體系中iptg濃度，節(jié)約發(fā)酵成本，減少有毒物料使用。

實(shí)施例5

不同供氧能力對rtse提取物添加發(fā)酵體系內(nèi)，iptg誘導(dǎo)外源蛋白活性表達(dá)能力的影響

氧供給是影響基因工程產(chǎn)品發(fā)酵進(jìn)程及產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。

采用實(shí)施例1中制備的rtse，采用實(shí)施例2中的pet28a-arg質(zhì)粒，以大腸桿菌bl21(de3)作為宿主。

采用實(shí)施例2中的生物質(zhì)量、蛋白量、酶活測定方法以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

5.1氧供給條件對rtse添加影響iptg誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)能力的影響

在250ml錐形瓶中分別加入30ml、60ml、100ml和150mllb液體培養(yǎng)基，其中分別添加提取物至最終濃度為3.7mg/l，每個(gè)體積分別對應(yīng)一組相同體積未添加提取物的對照組，其余操作按照實(shí)施例4所得發(fā)酵條件及發(fā)酵操作進(jìn)行。

數(shù)據(jù)表明：

不同氧供給條件下，rtse的添加可以顯著增加發(fā)酵體系中宿主細(xì)胞的含量，p<0.05；除極端供氧不足的150ml(250ml錐形瓶發(fā)酵容器)發(fā)酵體系外，rtse均可以對宿主菌的細(xì)胞含量增加起到積極作用，p<0.001。各個(gè)氧供給條件下，rtse的添加可以顯著增加發(fā)酵體系中總蛋白量，p<0.001，氧供給條件與rtse的添加之間存在顯著相互作用關(guān)系，常規(guī)供氧條件下(60ml/250ml，100ml/250ml)rtse的添加可以顯著提高發(fā)酵體系的總蛋白表達(dá)量，p<0.001；目的外源蛋白活性表達(dá)行為與總蛋白表達(dá)行為相一致。

驗(yàn)證例1

rtse對精氨酸酶催化活性影響

為檢測rtse對精氨酸酶活性的影響，采用上述實(shí)施例2中arg酶活測定方法，在測活體系中加入相同體積的rtse，使得反應(yīng)體系中rtse的濃度分別為74.7mg/l、18.7mg/l、3.7mg/l和0.7mg/l，與發(fā)酵體系中rtse的濃度相當(dāng)。

數(shù)據(jù)表明：

與未添加rtse的反應(yīng)體系相比，74.7mg/l、18.7mg/l、3.7mg/l和0.7mg/l的rtse添加，對精氨酸酶的活性呈現(xiàn)不同程度的抑制效果，表觀精氨酸酶活性分別為未加rtse粗酶的0.78、0.90、0.93和0.97倍。這表明，各個(gè)含rtse的精氨酸酶表達(dá)體系中，精氨酸酶的實(shí)際活性高于測量值，即，rtse對精氨酸酶表達(dá)的促使作用是真實(shí)、可信的。

以上內(nèi)容詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述具體實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外，在上述具體實(shí)施方式中所描述的的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。