本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備重組人凝血因子ⅷ的方法，具體涉及通過波浪式生物反應(yīng)器培養(yǎng)表達重組人凝血因子ⅷ的細胞以及從細胞培養(yǎng)液中分離并純化重組人凝血ⅷ因子。

背景技術(shù)：

血友病為一種先天性凝血因子基因缺陷或突變導致凝血功能障礙的遺傳出血性疾病。根據(jù)相應(yīng)的凝血因子將血友病分為甲型、乙型、丙型血友病(即血友病a、b、c)，其中血友病a占80％-85％。目前替代療法如輸注血漿、凝血因子ⅷ或ⅸ是治療血友病有效措施，但由于血漿來源的凝血制品極易造成血源性病毒污染，基因重組類凝血因子因其安全性及有效性成為治療血友病的主要產(chǎn)品。重組人凝血因子ⅷ與天然凝血因子ⅷ具有相似的生化、免疫及藥理學特性，能有效糾正血友病患者的出血傾向，具有良好的治療效果。目前上市的重組人凝血因子ⅷ有recombinate(baxter公司)、advate(baxter公司)、kogenatefs(bayer公司)、refacto(pfizer公司)、xyntha(pfizer公司)、eloctate(biogen公司，b結(jié)構(gòu)域缺失的因子ⅷ與igg1fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)以及octanate(octapharma公司)等。

作為哺乳動物表達細胞的一種，人胚腎細胞(hek293)表達系統(tǒng)已經(jīng)被用于制備許多包含重組凝血八因子的治療蛋白，其表達的重組蛋白的蛋白翻譯后修飾完全且免疫反應(yīng)低，但hek293細胞培養(yǎng)工藝技術(shù)壁壘高，細胞結(jié)團嚴重，細胞狀態(tài)難以維持。目前，重組八因子的細胞株的規(guī)?；囵B(yǎng)主要采用的是傳統(tǒng)攪拌式反應(yīng)器，如中國專利申請cn103517919采用攪拌式反應(yīng)器通過施加較大的剪切應(yīng)力(即較大的攪拌速率)懸浮培養(yǎng)hek293細胞，培養(yǎng)產(chǎn)生的重組人凝血八因子最高活性僅達到16iu/ml；中國專利申請cn102776260通過在培養(yǎng)過程中控制細胞培養(yǎng)液中血管性血友病因子與人凝血八因子的活性比為1～10:1，獲得的重組人凝血八因子的表達量最高也僅達到10～20國際單位/天/10⁶細胞。因此，仍需要高效培養(yǎng)重組人凝血因子ⅷ的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面提供一種制備重組人凝血因子ⅷ的方法，包括：

(1)采用波浪式生物反應(yīng)器培養(yǎng)表達重組人凝血因子ⅷ的細胞，所述細胞處于對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好，所述反應(yīng)器培養(yǎng)的溫度為37℃，轉(zhuǎn)速15～25rpm，角度5～8度，co2濃度6～10％，空氣0.3～0.5lpm，培養(yǎng)時間為72～110小時，培養(yǎng)方式為流加培養(yǎng)；

(2)從步驟(1)的細胞培養(yǎng)液中收獲重組人凝血因子ⅷ。

其中所述重組人凝血因子ⅷ選自全長的重組人凝血因子ⅷ，或者b結(jié)構(gòu)域缺失的重組人 凝血因子ⅷ(bddrfⅷ，序列如seqidno:1所示)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述重組人凝血因子ⅷ選自b結(jié)構(gòu)域缺失的重組人凝血因子ⅷ。

優(yōu)選的，其中步驟(1)中波浪式生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為16-24rpm。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述波浪式生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為16、17、18、19、20、21、22、23或24rpm。

優(yōu)選的，其中步驟(1)中波浪式生物反應(yīng)器的角度為6-7度。在本發(fā)明的一個實施方案中，所波浪式生物反應(yīng)器的角度為6度。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述波浪式生物反應(yīng)器的角度為7度。

優(yōu)選的，其中步驟(1)中co2濃度為7-9％，更優(yōu)選為8％。

優(yōu)選的，其中步驟(1)中空氣設(shè)置為0.4lpm。

優(yōu)選的，其中步驟(1)中培養(yǎng)時間為80-100小時，更優(yōu)選為88-96小時。

其中步驟(1)中所使用的培養(yǎng)基不特別限制，只要適合細胞生長即可，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所使用的培養(yǎng)基為含4mmol/l谷氨酰胺、0.02％antifoamc、1g/lkolliphorp188的cdoptichoagt培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，其中步驟(1)中流加培養(yǎng)是在培養(yǎng)周期的24～72小時內(nèi)補加200mmol/l谷氨酰胺至其濃度為2～4mmol/l，補加200g/l葡萄糖溶液至葡萄糖含量為2～4g/l。

優(yōu)選的，步驟(1)的波浪式生物反應(yīng)器包括但不限于wave生物反應(yīng)器(gehealthcare)、appliflex(applikon)、biostatrm(sartoriusstedimbiotech)、celltainer(celltainerbiotech)、readytoprocesswave25(gehealthcare)、xuri細胞擴增系統(tǒng)w25(gehealthcare)、xrs20(palllifesciences)、sb50-x(kuhner)或sb200-x(kuhner)。更優(yōu)選的，步驟(1)的波浪式生物反應(yīng)器選自wave生物反應(yīng)器(gehealthcare)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，步驟(1)的波浪式生物反應(yīng)器選自wave波浪式反應(yīng)器(gehealthcare，型號20/50eht)。

優(yōu)選的，步驟(2)收獲重組人凝血因子ⅷ是在含有na⁺的溶液中進行的。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，重組人凝血因子ⅷ的制備方法包括以下步驟：

(1)一級種子液制備：從液氮罐中取凍存的重組人凝血因子ⅷ工作細胞庫細胞一支(裝量1ml)，37℃水浴解凍，轉(zhuǎn)移至含20ml種子培養(yǎng)基cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺、50μg/mlzeocin)的125ml細胞培養(yǎng)搖瓶中，放置于37℃、6～10％co2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中110～130rpm培養(yǎng)。細胞密度約3.0～4.0×10⁶cells/ml時傳代培養(yǎng)，傳代密度約為0.6～1.0×10⁶cells/ml，3～4次傳代后將一級種子液接種于wave波浪式反應(yīng)器(gehealthcare，型號20/50eht)

(2)二級種子液制備：wave波浪式反應(yīng)器培養(yǎng)二級種子液，接種比例為1/4～1/3，接種密度為0.6～1.0×10⁶cells/ml，培養(yǎng)基為cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺、0.02％antifoam c、1g/lkolliphorp188)，二級種子液培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速15～20rpm，角度5～8度，co2濃度6～10％，空氣0.3～0.5lpm。二級種子液的細胞處于對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好時接種于wave波浪式反應(yīng)器。

(3)wave波浪式反應(yīng)器培養(yǎng)：接種比例為1/4～1/3，接種密度為0.6～1.0×10⁶cells/ml，培養(yǎng)基為cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺、0.02％antifoamc、1g/lkolliphorp188)，流加培養(yǎng)，在培養(yǎng)周期的第24～72小時補加200mmol/l谷氨酰胺至其濃度為2～4mmol/l，補加200g/l葡萄糖溶液至葡萄糖含量為2～4g/l，培養(yǎng)周期第96小時收獲，wave波浪反應(yīng)器細胞培養(yǎng)主控參數(shù)設(shè)定：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速20～25rpm，角度5～8度，co2濃度6～10％以及空氣0.3～0.5lpm。

(4)從步驟(3)的細胞培養(yǎng)液中收獲重組人凝血因子ⅷ，收獲條件為終濃度0.5mol/l的nacl，2～8℃下電導為40～50ms/cm，溶液混合后靜置30分鐘。

本發(fā)明的制備方法進一步包括將步驟(2)收獲的重組人凝血因子ⅷ進一步純化的步驟，其中所述純化步驟包括：s/d病毒滅活、親和層析、陰離子交換層析、疏水層析、納濾和超濾置換緩沖液。

本發(fā)明再一方面提供一種含有重組人凝血因子ⅷ的組合物，其中所述重組人凝血因子ⅷ由本發(fā)明的任一項制備方法獲得。

術(shù)語“流加培養(yǎng)”指反應(yīng)器培養(yǎng)過程中細胞不斷生長及產(chǎn)物不斷形成，而在此過程中隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng)成分，使細胞進一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。流加培養(yǎng)的特點就是能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，一方面，它可以避免在某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高時影響細胞的生長代謝以及產(chǎn)物的形成；另一方面，它還能防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成。

本發(fā)明的制備方法具有如下有益效果：wave波浪生物反應(yīng)器混合效率高，氣液交換充分，泡沫少且剪切力低，避免了攪拌式不銹鋼反應(yīng)器漿葉端和氣泡對細胞的傷害，因此細胞狀態(tài)、細胞活率及蛋白活性均高于攪拌式不銹鋼反應(yīng)器。此外，wave波浪生物反應(yīng)器采用較低的轉(zhuǎn)速(例如15rpm～25rpm)培養(yǎng)細胞時，細胞活率和蛋白表達量也獲得了出乎意料的提高。另外，進一步的純化有效去除了宿主蛋白、dna、親和配基、聚合物、降解物以及細胞培養(yǎng)過程中帶入的污染物，大大提高了重組人凝血因子ⅷ的產(chǎn)量及蛋白活性。

附圖說明

圖1：wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器的細胞生長曲線對比圖，左側(cè)縱坐標為細胞密度(10⁶細胞/ml)，右側(cè)縱坐標為細胞活率，橫坐標為培養(yǎng)時間。

圖2：wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器蛋白表達量對比圖。

圖3：wave波浪生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)周期的細胞生長曲線圖，左側(cè)縱坐標為細胞密度(10⁶細胞/ml)，右側(cè)縱坐標為細胞活率，橫坐標為培養(yǎng)時間。

圖4：wave波浪生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)周期的蛋白表達量圖。

圖5：重組人凝血因子ⅷ的純化流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明中的這些和其他實施例僅用于闡明而不限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，對本發(fā)明技術(shù)特征所作的等同替換，或相應(yīng)的改進，仍屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例1考察wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器細胞培養(yǎng)效果

一級種子液制備：從液氮罐中取凍存的重組人凝血因子ⅷ工作細胞庫細胞一支(自制，裝量1ml)，37℃水浴解凍，轉(zhuǎn)移至含20ml種子培養(yǎng)基cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、50μg/mlzeocin(invotrogen公司)，lifetechnologies公司)的125ml細胞培養(yǎng)搖瓶中，放置于37℃、6～10％co2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中110～130rpm培養(yǎng)。每天觀察細胞狀態(tài)，取樣進行細胞計數(shù)和檢測細胞活率(臺盼藍法)，細胞密度約3.0～4.0×10⁶cells/ml時傳代培養(yǎng)，傳代密度約為0.6～1.0×10⁶cells/ml，3～4次傳代后將一級種子液接種于wave波浪式反應(yīng)器(gehealthcare，型號20/50eht)

二級種子液制備：wave波浪式反應(yīng)器培養(yǎng)二級種子液，接種比例為1/4～1/3，接種密度為0.6～1.0×10⁶cells/ml，培養(yǎng)基為cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，二級種子液培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速15～20rpm，角度5～8度，co2濃度6～10％，空氣0.3～0.5lpm。二級種子液的細胞處于對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好時接種于wave波浪式反應(yīng)器和30l攪拌式不銹鋼反應(yīng)器(applikon公司，型號ez-control)。

wave波浪式反應(yīng)器細胞培養(yǎng)工藝：接種比例為1/4～1/3，接種密度為0.6～1.0×10⁶cells/ml，培養(yǎng)基為cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，流加培養(yǎng)，在培養(yǎng)周期的第24～72小時補加200mmol/l谷氨酰胺至其濃度為2～4mmol/l，補加200g/l葡萄糖(sigma公司)溶液至葡萄糖含量為2～4g/l，培養(yǎng)周期第96小時收獲。培養(yǎng)過程中每24小時取樣進行細胞計數(shù)檢測細胞活率(臺盼藍法)，以及檢測蛋白活性(一期法)。wave波浪反應(yīng)器細胞培養(yǎng)主控參數(shù)設(shè)定：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速20～25rpm，角度5～8度，co2濃度6～10％以及空氣0.3～0.5lpm。

30l攪拌式不銹鋼反應(yīng)器細胞培養(yǎng)工藝：接種比例為1/4～1/3，接種密度為0.6～1.0×10⁶ cells/ml，培養(yǎng)基為cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，流加培養(yǎng)，在培養(yǎng)周期的第24～72小時補加200mmol/l谷氨酰胺至其濃度為2～4mmol/l，補加200g/l葡萄糖(sigma公司)溶液至葡萄糖含量為2～4g/l，培養(yǎng)周期第96小時收獲。培養(yǎng)過程中每24小時取樣進行細胞計數(shù)檢測細胞活率(臺盼藍法)，以及檢測蛋白活性(一期法)。攪拌式不銹鋼反應(yīng)器主控參數(shù)設(shè)定：培養(yǎng)溫度37℃；攪拌轉(zhuǎn)速100～130rpm；do通過補加o2自控維持在40％；ph值通過補加co2及0.5mol/l氫氧化鈉溶液自控維持在7.00±0.20；空氣持續(xù)通氣，通氣量為500ml/min。

wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器的細胞生長曲線對比結(jié)果如圖1所示；wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器蛋白表達量對比結(jié)果如圖2所示；wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器工藝過程及培養(yǎng)效果對比如表1所示。

表1：wave波浪生物反應(yīng)器與攪拌式不銹鋼反應(yīng)器工藝過程及培養(yǎng)效果對比

wave波浪生物反應(yīng)器混合效率高，氣液交換充分，泡沫少且剪切力低，避免了攪拌式不銹鋼反應(yīng)器漿葉端和氣泡對細胞的傷害，因此細胞狀態(tài)、細胞活率及蛋白活性均高于攪拌式不銹鋼反應(yīng)器。此外，wave波浪生物反應(yīng)器采用較低的轉(zhuǎn)速(例如15rpm～25rpm)培養(yǎng)細胞時，細胞活率和蛋白表達量也獲得了出乎意料的提高。

實施例2wave波浪生物反應(yīng)器考察不同培養(yǎng)周期對細胞活率及蛋白表達量的影響

參照實施例1的制備方法獲得二級種子液。

將二級種子液以1/4～1/3的接種比例，0.6～1.0×10⁶cells/ml的接種密度，培養(yǎng)基為cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，流加培養(yǎng)，在培養(yǎng)周期的第24～72小時補加200mmol/l谷氨酰胺至其濃度為2～4mmol/l，補加200g/l葡萄糖(sigma公 司)溶液至葡萄糖含量為2～4g/l，培養(yǎng)周期第120小時收獲。培養(yǎng)過程中每24小時取樣進行細胞計數(shù)檢測細胞活率(臺盼藍法)，以及檢測蛋白活性(一期法)。wave波浪反應(yīng)器細胞培養(yǎng)主控參數(shù)設(shè)定：培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速20～25rpm，角度5～8度，co2濃度6～10％以及空氣0.3～0.5lpm。

wave波浪生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)周期的細胞生長曲線圖如圖3所示；wave波浪生物反應(yīng)器不同培養(yǎng)周期的蛋白表達量如圖4所示。細胞培養(yǎng)96小時后細胞狀態(tài)不佳，細胞活率降低，蛋白快速降解，故將培養(yǎng)周期縮短至80～100小時，產(chǎn)品在袋內(nèi)停留時間短利于保持產(chǎn)品活性。

實施例3重組人凝血因子ⅷ的純化

(1)收獲細胞培養(yǎng)液

向?qū)嵤├?獲得的細胞懸液(wave波浪式反應(yīng)器培養(yǎng))中加入含有氯化鈉和氯化鈣的緩沖液(10mmol/lhepes，5mmol/l二水氯化鈣，4mol/l氯化鈉，ph7.2)，使氯化鈉的終濃度約為0.5mol/l，使其2～8℃下電導為40～50ms/cm，將溶液混合后靜置約30分鐘，通過深層過濾將細胞移除之后進行無菌過濾(0.22μm)以除去任何殘留的細胞碎片和顆粒物。

(2)s/d病毒滅活

使用0.3％的磷酸三丁脂(tnbp)(v/v)和1％的tritonx-100對步驟(1)獲得的澄清細胞收獲液進行病毒滅活。在20～25℃下攪拌45分鐘進行病毒滅活。

(3)親和層析

將步驟(2)獲得的細胞收獲液使用gehealthcareindex系列層析柱(柱床高度6.5cm，直徑7cm，體積約250ml，填料為ⅷselect凝膠(gehealthcare公司))進行純化。用于親和層析的緩沖液和親和層析步驟如表2和表3所示。

表2：用于親和層析的緩沖液

表3：親和層析步驟

(4)陰離子柱層析

將q-sepharosehighperformance填料(gehealthcare公司)裝填至層析柱管(geheatlhcarexk50層析柱)中，使柱床高度為6～7cm，直徑為5cm，體積約為110～140ml。稀釋步驟(3)的洗脫液使其電導值為12～15ms/cm(2～8℃)，從而使凝血因子ⅷ能與凝膠結(jié)合。用于親和層析的緩沖液和層析步驟如表4和表5所示。

表4：用于陰離子交換層析的緩沖液

表5：陰離子柱層析步驟

(5)疏水柱層析

將butylsepharosehighperformance填料(gehealthcare公司)裝填至層析柱(gehealthcarexk26)中，使柱床高度為16～21cm，直徑為2.6cm，體積約為80～110ml。使用電導調(diào)節(jié)緩沖液稀釋步驟(4)的洗脫液使其電導值為58～62ms/cm(2～8℃)。用于疏水柱層析的緩沖液和層析步驟如表6和表7所示。

表6：用于疏水層析的緩沖液

表7：疏水層析步驟

(6)納濾(除病毒過濾)

使用平衡緩沖液(10mmol/lhepes，5mmol/l二水氯化鈣，0.7mol/l氯化鈉，ph7.2)平衡納濾膜(planovabioex，asahi-kasei公司)，過濾步驟(5)獲得的的疏水流穿液以除去無包膜病毒。

(7)超濾置換緩沖液

通過10kda纖維素超濾膜(millipore公司)對步驟(6)所得濾出液進行緩沖液置換。在過程中，保持系統(tǒng)壓力小于0.1mpa，濃縮到一定體積后，采用置換緩沖液(3mg/mll-組氨酸，0.7mol/l氯化鈉，5mmol/l氯化鈣，ph7.0)置換約15個系統(tǒng)體積，置換完畢后加入終濃度為6mg/ml的蔗糖，得到原液并-80℃保存。

三批中試規(guī)模純化結(jié)果如表8所示。

表8：三批中試規(guī)模純化結(jié)果

*上述重組人凝血因子viii蛋白活性檢測均采用一期法，參照中國藥典(2010版)三部附錄xn人凝血因子ⅷ測定法。^#蛋白含量測定采用紫外分光光度法。