本發(fā)明涉及pseudomonasveroniicip104663蛋白的新用途，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：pseudomonasveroniicip104663蛋白是來(lái)源于pseudomonasveroniicip104663的一種蛋白，其氨基酸序列為序列表中序列2。用于其編碼的基因序列為序列表中序列1。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供了pseudomonasveroniicip104663蛋白的一種新用途，具體來(lái)說(shuō)，是指其作為催化劑的用途。更進(jìn)一步地，是用以催化l-賴氨酸鹽酸鹽或l-賴氨酸生物轉(zhuǎn)化制備l-2-哌啶甲酸的反應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)pseudomonasveroniicip104663蛋白的催化作用，我們需要獲得一種可以高效表達(dá)這一蛋白的菌體，從而以全細(xì)胞催化劑的形式將其加入到反應(yīng)體系中。在本發(fā)明中，我們選定的用于高效表達(dá)pseudomonasveroniicip104663蛋白的菌體為大腸桿菌。然而，在pseudomonasveroniicip104663中用以編碼pseudomonasveroniicip104663蛋白的野生型基因序列g(shù)c含量接近50％，在宿主菌中培養(yǎng)時(shí)難以實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。故通過(guò)全基因合成的方法，對(duì)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及密碼子偏好性進(jìn)行調(diào)整，以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的高表達(dá)。首先，我們利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并保證tm差異控制在3℃以內(nèi)，引物長(zhǎng)度控制在50base以內(nèi)，得到以下引物：合成上述引物，并將獲得的引物加雙蒸水溶解后，加到如下的反應(yīng)體系中，使得各引物的終濃度為30nm，首尾引物的終濃度為0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反應(yīng)體系總體積至50μl將配制好的pcr反應(yīng)體系置于博日xpcycler基因擴(kuò)增儀中，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：98℃30s，60℃45s，72℃120s，35x。將pcr得到的dna片段進(jìn)行切膠純化，利用同源重組的方法克隆進(jìn)pet30a的ndei/xhoi位點(diǎn)。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功的dna序列為seqidno.3。按照?qǐng)D1的方式構(gòu)建含有seqidno.3的表達(dá)質(zhì)粒。挑取含有seqidno.3的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落接種于10ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氫二鈉3.55g/l，磷酸二氫鉀3.4g/l，氯化銨2.68g/l，硫酸鈉0.71g/l，七水硫酸鎂0.493g/l，六水氯化鐵0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm過(guò)夜培養(yǎng)。次日取1l三角瓶，按1：100的接種比例接入到100ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氫二鈉3.55g/l，磷酸二氫鉀3.4g/l，氯化銨2.68g/l，硫酸鈉0.71g/l，七水硫酸鎂0.493g/l，六水氯化鐵0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培養(yǎng)至菌體od5-6，立刻將三角瓶置于25℃搖床中，250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。加iptg至終濃度0.1mm，并于25℃，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于4℃，12000g下離心20分鐘收集濕菌體。然后將菌體沉淀用蒸餾水清洗兩次，收集菌體，-70℃保存。將所收集得到的大腸桿菌作為全細(xì)胞催化劑加入至l-賴氨酸鹽酸鹽生物轉(zhuǎn)化制備l-2-哌啶甲酸的反應(yīng)中，從而獲得了一種高效率的生物催化系統(tǒng)。這一系統(tǒng)具有底物投量高，反應(yīng)時(shí)間短，產(chǎn)物ee值高的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為seqidno.3的表達(dá)質(zhì)粒圖譜圖2為含有seqidno.3表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌的sds-page圖譜。圖3為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的tlc圖譜圖4為l-2-哌啶甲酸的hplc譜圖圖5為l-2-哌啶甲酸的ms譜圖具體實(shí)施方式為了更好的解釋本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。在本實(shí)施例中所用到的儀器、試劑，除非有特殊說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品。以下實(shí)施例中涉及到的tlc檢測(cè)中：展開劑：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混勻后放置10min左右。硅膠板規(guī)格：薄層層析硅膠板5*10。顯色劑：茚三酮顯色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混勻。以下實(shí)例中涉及到的lc-ms檢測(cè)條件為：prevailc18色譜柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(elsd)；檢測(cè)器溫度：120℃；載氣：氮?dú)?純度99.9％)；載氣流速：4l/min；進(jìn)樣體積：10μl。實(shí)施例1將pseudomonasveroniicip104663置于lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制溫度為28.0℃，180rpm培養(yǎng)3天，離心收集沉淀，用dna提取純化試劑盒qiaampkit(qiagen，germany)提取純化pseudomonasveronii基因組dna。用pfu高保真酶對(duì)pseudomonasveronii基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所用引物為pve-f5'atggtggcacagcgagcaac3'pve-r5'tcatgctaattttaaggtacggtcg3'由于pseudomonasveroniicip104663的dna的gc含量接近50％，故使用pfu高保真酶直接擴(kuò)增。之后將擴(kuò)增的片段用taq聚合酶72℃處理10分鐘，在dna3'端添加堿基a。之后將其連接到pmd19t-simple(takara寶生物公司，北京)克隆載體中，挑取單克隆送至南京金斯瑞生物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到dna序列為seqidno.1，相應(yīng)的氨基酸序列為seqidno.2。實(shí)施例2通過(guò)全基因合成的方法，對(duì)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及密碼子偏好性進(jìn)行調(diào)整，并且調(diào)整dna序列的gc含量到40％～60％，以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的高表達(dá)。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并保證tm差異控制在3℃以內(nèi)，引物長(zhǎng)度控制在50base以內(nèi)，得到以下引物：合成上述引物，并將獲得的引物加雙蒸水溶解后，加到如下的反應(yīng)體系中，使得各引物的終濃度為30nm，首尾引物的終濃度為0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反應(yīng)體系總體積至50μl將配制好的pcr反應(yīng)體系置于博日xpcycler基因擴(kuò)增儀中，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。將pcr得到的dna片段進(jìn)行切膠純化，利用同源重組的方法克隆進(jìn)pet30a的ndei/xhoi位點(diǎn)。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功的dna序列為seqidno.3。實(shí)施例3挑取含有seqidno.3表達(dá)載體的大腸桿菌單菌落接種于10ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氫二鈉3.55g/l，磷酸二氫鉀3.4g/l，氯化銨2.68g/l，硫酸鈉0.71g/l，七水硫酸鎂0.493g/l，六水氯化鐵0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm過(guò)夜培養(yǎng)。次日取1l三角瓶，按1：100的接種比例接入到100ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氫二鈉3.55g/l，磷酸二氫鉀3.4g/l，氯化銨2.68g/l，硫酸鈉0.71g/l，七水硫酸鎂0.493g/l，六水氯化鐵0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培養(yǎng)至菌體od5-6，立刻將三角瓶置于25℃搖床中，250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。加iptg至終濃度0.1mm，并于25℃，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于4℃，12000g下離心20分鐘收集濕菌體。然后將菌體沉淀用蒸餾水清洗兩次，收集菌體，-70℃保存。同時(shí)取少量菌體進(jìn)行sds-page檢測(cè)。結(jié)果見圖2，其中1道為蛋白上清，2道為包涵體。sds-page蛋白膠顯示，含有seqidno.3表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)量高，滿足生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的需要。實(shí)施例4加入0.1m磷酸鉀緩沖液(ph8.0)，65g/l含有seqidno.3表達(dá)質(zhì)粒的菌體，60g/ll-賴氨酸鹽酸鹽，0.1mmnad，敞口反應(yīng)，25℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為180rpm。反應(yīng)中不斷取樣進(jìn)行tlc檢測(cè)，當(dāng)反應(yīng)16小時(shí)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果如圖3，結(jié)果顯示28小時(shí)生成大量產(chǎn)物，無(wú)底物殘余。對(duì)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物最終濃度為48.7g/l。同時(shí)取樣進(jìn)行l(wèi)c-ms檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4，圖5所示。當(dāng)我們?cè)隗w系中加入l-賴氨酸的時(shí)候，其快速轉(zhuǎn)變?yōu)閘-賴氨酸鹽酸鹽，然后按照前述實(shí)施例的方式進(jìn)行反應(yīng)。sequencelisting<110>南京諾云生物科技有限公司<120>pseudomonasveroniicip104663蛋白的新用途<130>2016<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1116<212>dna<213>pseudomonasveronii<400>1atggtggcacagcgagcaactattatcctctctgaggaaaacattggtgaaattgtcgca60gcagtcgggctcgacactttaatggatgaaacgattgcaaaactacgtgatgccctcaac120gtgtttggtgatggccaggttgaaatacaaccgcgcaccggctttgtctatgaaactccg180gaaatggggctgatagagtttatgccggcttaccgccgggataaaaatgtcgcgttaaaa240gttgttggctaccatccgggaaatccgtttaaccggggcatgccgacggtcatcgccact300aactccctatatgacgtaagggacggccaccttattgcggtgatcgatggtgtatttgca360acagcagtacgaacgggcgcagcatccgctgtggcttcgaagttgctggctcatcctgaa420agcaaaacccttgggctgatcggagctggcgccatggcagtgacccaggcccatgccctc480agtcgaatttatgactttgacgcagtcttgatccacgatattgaccccgcagtggaaaaa540actttcgccaagcgggtatccgccctgggaattacaccgatcatcgcttccaaagacagg600gtactggcagagtccgacatcatctgtgttgctacctccattggccttgatgcaggcccg660gttctccacgctggcgggatgaaaccacatgtacacatcaatgctattggtgccgacacg720ccgcgcaaatatgaattatcaacagagctgctcaaaagctcgttccttgtcacggattat780ctggaacaggccattaacgaaggtgaatgccagcaattgagtaaagacgaatacggctat840atcggccctgagttgcacaaaatagtgaaagagccgcaagcctatatccaatatcagatg900aaacagaccatctttgatagcaccggtatttcattggaagatcagataatgaccgaggtc960ttgatcgatcaggcggagagactagggcttggtcagcggatcctgattgaagcgggatgt1020gatgaccccatgaacccatatcttttctcaaattccgcgaacgctcttgataccgtcaag1080aatacagtgcacgaccgtaccttaaaattagcatga1116<210>2<211>371<212>prt<213>pseudomonasveronii<400>2metvalalaglnargalathrileileleuserglugluasnilegly151015gluilevalalaalavalglyleuaspthrleumetaspgluthrile202530alalysleuargaspalaleuasnvalpheglyaspglyglnvalglu354045ileglnproargthrglyphevaltyrgluthrproglumetglyleu505560ilegluphemetproalatyrargargasplysasnvalalaleulys65707580valvalglytyrhisproglyasnpropheasnargglymetprothr859095valilealathrasnserleutyraspvalargaspglyhisleuile100105110alavalileaspglyvalphealathralavalargthrglyalaala115120125seralavalalaserlysleuleualahisprogluserlysthrleu130135140glyleuileglyalaglyalametalavalthrglnalahisalaleu145150155160serargiletyrasppheaspalavalleuilehisaspileasppro165170175alavalglulysthrphealalysargvalseralaleuglyilethr180185190proileilealaserlysaspargvalleualagluseraspileile195200205cysvalalathrserileglyleuaspalaglyprovalleuhisala210215220glyglymetlysprohisvalhisileasnalaileglyalaaspthr225230235240proarglystyrgluleuserthrgluleuleulysserserpheleu245250255valthrasptyrleugluglnalaileasngluglyglucysglngln260265270leuserlysaspglutyrglytyrileglyprogluleuhislysile275280285vallysgluproglnalatyrileglntyrglnmetlysglnthrile290295300pheaspserthrglyileserleugluaspglnilemetthrgluval305310315320leuileaspglnalagluargleuglyleuglyglnargileleuile325330335glualaglycysaspaspprometasnprotyrleupheserasnser340345350alaasnalaleuaspthrvallysasnthrvalhisaspargthrleu355360365lysleuala370<210>3<211>1116<212>dna<213>人工序列<400>3atggttgctcagcgtgctaccatcatcctgtctgaagaaaacatcggtgaaatcgttgct60gctgttggtctggacaccctgatggacgaaaccatcgctaaactgcgtgacgctctgaac120gttttcggtgacggtcaggttgaaatccagccgcgtaccggtttcgtttacgaaaccccg180gaaatgggtctgatcgaattcatgccggcttaccgtcgtgacaaaaacgttgctctgaaa240gttgttggttaccacccgggtaacccgttcaaccgtggtatgccgaccgttatcgctacc300aactctctgtacgacgttcgtgacggtcacctgatcgctgttatcgacggtgttttcgct360accgctgttcgtaccggtgctgcttctgctgttgcttctaaactgctggctcacccggaa420tctaaaaccctgggtctgatcggtgctggtgctatggctgttacccaggctcacgctctg480tctcgtatctacgacttcgacgctgttctgatccacgacatcgacccggctgttgaaaaa540accttcgctaaacgtgtttctgctctgggtatcaccccgatcatcgcttctaaagaccgt600gttctggctgaatctgacatcatctgcgttgctacctctatcggtctggacgctggtccg660gttctgcacgctggtggtatgaaaccgcacgttcacatcaacgctatcggtgctgacacc720ccgcgtaaatacgaactgtctaccgaactgctgaaatcttctttcctggttaccgactac780ctggaacaggctatcaacgaaggtgaatgccagcagctgtctaaagacgaatacggttac840atcggtccggaactgcacaaaatcgttaaagaaccgcaggcttacatccagtaccagatg900aaacagaccatcttcgactctaccggtatctctctggaagaccagatcatgaccgaagtt960ctgatcgaccaggctgaacgtctgggtctgggtcagcgtatcctgatcgaagctggttgc1020gacgacccgatgaacccgtacctgttctctaactctgctaacgctctggacaccgttaaa1080aacaccgttcacgaccgtaccctgaaactggcttaa1116當(dāng)前第1頁(yè)12