本發(fā)明涉及真菌提取物領(lǐng)域，尤其涉及一種海洋真菌提取物、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物病害嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(fao)統(tǒng)計，每年農(nóng)作物因遭受病害造成的減產(chǎn)損失平均為總產(chǎn)量的10％～15％。其中，植物細(xì)菌病害帶來的問題尤為嚴(yán)重，隨著農(nóng)用硫酸鏈霉素的停用，極為缺乏有效的防治藥劑，而銅制劑等防治效果一般，且屬于化學(xué)農(nóng)藥，易造成環(huán)境污染和食品安全問題，同時還會造成病原菌抗藥性的出現(xiàn)。因此研發(fā)新型環(huán)境友好型高效低毒生物農(nóng)藥用來防治植物細(xì)菌病害成為迫在眉睫的課題。

海洋真菌由于能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物而引起了人們的關(guān)注。自2007年以來，每年從海洋真菌中獲得的新化合物數(shù)目在100個以上，僅2015年，就報道了400多個新的海洋真菌次級代謝產(chǎn)物。這些化合物當(dāng)中很多都具有諸如抗菌、抗炎、抗癌、酶抑制等顯著地生物活性。

然而目前對于海洋真菌次級代謝產(chǎn)物的活性研究大多集中于人類醫(yī)學(xué)方面，對于其在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用很少，特別是在防治植物病原細(xì)菌方面，文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前并沒有對于海洋真菌次級代謝產(chǎn)物防治植物細(xì)菌病害的報道。因此從海洋真菌中獲得具有抗植物病原細(xì)菌活性的化合物具有十分廣闊的發(fā)展前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種海洋真菌提取物、制備方法及應(yīng)用，該海洋真菌提取物具有抗植物病原細(xì)菌活性，作為殺菌劑應(yīng)用可用來預(yù)防和治療植物病原細(xì)菌引起的植物病害。

本發(fā)明一方面提供了一種海洋真菌提取物，該海洋真菌提取物提取自海洋真菌fusariumequisetigly27,所述海洋真菌fusariumequisetigly27的保藏號是cgmcc14348。

本發(fā)明另一方面提供了上述海洋真菌提取物的制備方法，包括以下步驟：

在菌種培養(yǎng)基中進(jìn)行對海洋真菌fusariumequisetigly27培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，將所得發(fā)酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷為1:1的溶液浸泡，減壓濃縮，過濾，將剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物減壓濃縮、干燥后得海洋真菌提取物。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述菌種培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基，在菌種培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)5-7天。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基配比為：馬鈴薯5-6g/l、葡萄糖15-20g/l、瓊脂18-20g/l，其余為去離子水。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為大米固體培養(yǎng)基，500ml錐形瓶中加入大米40g，水30ml，接種真菌后，28℃發(fā)酵培養(yǎng)30-40天。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，將所得發(fā)酵物用乙酸乙酯浸泡2次，隨后用甲醇：二氯甲烷體積比為1:1的溶液浸泡2次。

本發(fā)明的再一方面提供了上述海洋真菌提取物的應(yīng)用，所述海洋真菌提取物用于預(yù)防和治療由植物病原細(xì)菌引起的植物病害。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述植物病原細(xì)菌為丁香假單胞桿菌p.syringae、燕麥?zhǔn)乘峋鷄.avenae、胡蘿卜軟腐歐文氏菌e.carotovora和密執(zhí)安棍狀桿菌c.michiganensis。

本發(fā)明的又一方面提供了一種植物病原細(xì)菌殺菌劑，其有效成分為上述海洋真菌提取物，還包括溶劑或助劑。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述植物病原細(xì)菌殺菌劑為所述海洋真菌提取物溶解于二甲基亞砜制得，海洋真菌提取物的濃度為0.1-1.0mg/ml。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所具有的優(yōu)勢及有益效果在于：

1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了海洋真菌fusariumequisetigly27發(fā)酵粗提物的抗植物病原細(xì)菌活性，殺菌活性高、效果好，低濃度下可發(fā)揮優(yōu)異的殺菌性能；

2、本發(fā)明的海洋真菌提取物，可作為農(nóng)用殺菌劑主要成分用來預(yù)防和治療植物病原細(xì)菌引起的病害，并且對由丁香假單胞桿菌p.syringae、燕麥?zhǔn)乘峋鷄.avenae、胡蘿卜軟腐歐文氏菌e.carotovora和密執(zhí)安棍狀桿菌c.michiganensis引起的植物細(xì)菌病害防治效果顯著；

3、本發(fā)明的海洋真菌提取物可以通過真菌發(fā)酵進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，成本低，制備效率高，不受資源限制，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例所提供的海洋真菌提取物(1.0mg/ml)、陽性對照藥劑、陰性對照藥劑對4種植物病原細(xì)菌的抗菌效果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例所提供的海洋真菌提取物(0.1mg/ml)和陽性對照藥劑對2種植物病原細(xì)菌的抗菌效果圖。

具體實(shí)施方式

下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的一實(shí)施例提供了一種海洋真菌提取物，該海洋真菌提取物提取自海洋真菌fusariumequisetigly27，所述海洋真菌fusariumequisetigly27的保藏號是cgmcc14348。該海洋真菌為木賊鐮刀菌，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2017年7月3日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明的另一實(shí)施例提供了海洋真菌提取物的制備方法，包括以下步驟：在菌種培養(yǎng)基中進(jìn)行對海洋真菌fusariumequisetigly27培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，將所得發(fā)酵物用乙酸乙酯浸泡后再用甲醇：二氯甲烷體積比為1:1的溶液浸泡，減壓濃縮，過濾，將剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物減壓濃縮、干燥后得海洋真菌提取物。本步驟中，海洋真菌經(jīng)過菌種活化和發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)后能夠產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，利于提取物的制備，發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過乙酸乙酯浸泡，再經(jīng)過甲醇：二氯甲烷體積比為1:1的溶液浸泡，能夠充分提取其中的次級代謝產(chǎn)物。乙酸乙酯的萃取能夠保證提取物活性的基礎(chǔ)上進(jìn)行濃縮和提純。

在一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述菌種培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基，在菌種培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)5-7天；其中，馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基配比為：馬鈴薯5-6g/l、葡萄糖15-20g/l、瓊脂18-20g/l，其余為去離子水。本實(shí)施例中，可以理解的是，菌種的培養(yǎng)溫度可以在28℃左右，培養(yǎng)的時間可以根據(jù)培養(yǎng)的情況進(jìn)行略微調(diào)整。培養(yǎng)基中馬鈴薯和葡萄糖的配比是針對fusariumequiseti進(jìn)行了優(yōu)化和選擇的，能夠有效的促進(jìn)fusariumequiseti的生長。

在一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為大米固體培養(yǎng)基，500ml錐形瓶中加入大米40g，水30ml，接種真菌后，28℃發(fā)酵培養(yǎng)30-40天。本實(shí)施例中，可以理解的是，菌種的發(fā)酵溫度可以在28℃左右，具體發(fā)酵的時間可以根據(jù)發(fā)酵的情況進(jìn)行縮短或延長。發(fā)酵培養(yǎng)基中大米的濃度是針對fusariumequisetigly27進(jìn)行了優(yōu)化和選擇的，能夠有效的促進(jìn)fusariumequisetigly27的菌絲生長和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

在一優(yōu)選的實(shí)施例中，將所得發(fā)酵物用乙酸乙酯浸泡2次，隨后用甲醇：二氯甲烷為1:1的溶液浸泡2次。本實(shí)施例中，浸泡2次能夠充分提取，可以理解的是，浸泡多次也可以充分提取，但是比較費(fèi)時。

本發(fā)明的再一實(shí)施例為上述海洋真菌提取物的應(yīng)用，上述海洋真菌提取物用于預(yù)防和治療由植物病原細(xì)菌引起的植物病害。本實(shí)施例中，上述海洋真菌提取物對于植物病原細(xì)菌引起的植物細(xì)菌病害療效顯著。其中，針對丁香假單胞桿菌p.syringae、燕麥?zhǔn)乘峋鷄.avenae、胡蘿卜軟腐歐文氏菌e.carotovora和密執(zhí)安棍狀桿菌c.michiganensis引起的植物病害防治療效特別顯著。具體的，本發(fā)明的上述海洋真菌提取物可主要用來預(yù)防和治療由丁香假單胞桿菌p.syringae引起的角斑病，燕麥?zhǔn)乘峋鷄.avenae引起的果斑病，胡蘿卜軟腐歐文氏菌e.carotovora引起的軟腐病和密執(zhí)安棍狀桿菌c.michiganensis引起的潰瘍病。

本發(fā)明的又一實(shí)施例提供了一種植物病原細(xì)菌殺菌劑，其有效成分為上述海洋真菌提取物，還包括溶劑或助劑。本實(shí)施例中，以上述海洋真菌提取物為有效成分，可配合其他的溶劑或助劑配制成為具有優(yōu)異殺菌效果的殺菌劑。其中溶劑可以為能夠有效溶解上述海洋真菌提取物的任意溶劑，助劑包括能夠促進(jìn)該海洋真菌提取物發(fā)揮殺菌作用的有效助劑以及在具體施用殺菌劑過程中促進(jìn)施用效果的有效助劑，另外，本領(lǐng)域常見的殺菌劑配合助劑也可用于本發(fā)明的植物病原殺菌劑中，例如表面活性劑、分散劑、潤濕劑、增稠劑、消泡劑、填料等。

在一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述植物病原細(xì)菌殺菌劑為所述海洋真菌提取物溶解于二甲基亞砜制得，海洋真菌提取物的濃度為0.1-1.0mg/ml。本實(shí)施例中，所述植物病原細(xì)菌殺菌劑的濃度可以為上述濃度范圍內(nèi)的任意取值，具體應(yīng)用過程中可以根據(jù)病原細(xì)菌引起的病害程度以及實(shí)施方式具體選擇上述的濃度，例如，可以選擇的濃度可以為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mg/ml。

為了更清楚詳細(xì)地介紹本發(fā)明實(shí)施例所提供的海洋真菌提取物、制備方法及應(yīng)用，以下將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說明。

實(shí)施例1海洋真菌fusariumequisetigly27的培養(yǎng)和發(fā)酵

海洋真菌fusariumequisetigly27的菌種培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，含有馬鈴薯5-6g/l、葡萄糖15-20g/l、瓊脂18-20g/l，其余為水，使用時制成平板培養(yǎng)基，菌株在28℃下培養(yǎng)5-7天；

(2)海洋真菌fusariumequisetigly27的發(fā)酵培養(yǎng)采用大米固體培養(yǎng)基，每500ml錐形瓶中加入大米40g，水30ml，發(fā)酵3瓶，真菌菌株于28℃下培養(yǎng)30-40天。

實(shí)施例2海洋真菌提取物的制備

將所得發(fā)酵物用乙酸乙酯浸泡2遍，再用甲醇：二氯甲烷體積比為1:1的溶液浸泡，減壓濃縮，過濾，將剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物減壓濃縮、干燥后得海洋真菌提取物。

實(shí)施例3海洋真菌提取物抗菌活性測定

測試對6株植物病原細(xì)菌：丁香假單胞桿菌p.syringae、燕麥?zhǔn)乘峋鷄.avenae、稻生黃單胞菌xanthomonasoryzae、胡蘿卜軟腐歐文氏菌e.carotovora、密執(zhí)安棍狀桿菌c.michiganensis和青枯雷爾氏菌ralstoniasolanacearum的抗菌活性。

上述6株植物病原細(xì)菌經(jīng)lb培養(yǎng)基120rpm/min震蕩培養(yǎng)24h。取細(xì)菌培養(yǎng)液制備菌懸液，調(diào)整菌液濃至2-5×10⁵cfu/ml，分別取菌懸液各0.1ml于平板培養(yǎng)基上，涂布均勻。

菌懸液稍干后，用無菌打孔器在離培養(yǎng)基邊緣3cm處打取3個直徑為3mm的小孔，3個小孔呈等邊三角形排列。

將實(shí)施例2的海洋真菌提取物用二甲基亞砜(dmso)溶解，配制成1.0和0.1mg/ml的溶液，在小孔中加入15μl的上述溶液，37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈大小，并與陽性對照藥劑(同等濃度的硫酸鏈霉素)和陰性空白藥劑(dmso)對比。

結(jié)果表明，參見圖1，從左至右，分別為對p.syringae；a.avenae；e.carotovora；c.michiganensis的抑菌效果圖。圖(a)說明在1.0mg/ml的濃度下，本發(fā)明的海洋真菌提取物對4種植物病原細(xì)菌丁香假單胞桿菌p.syringae、燕麥?zhǔn)乘峋鷄.avenae、胡蘿卜軟腐歐文氏菌e.carotovora和密執(zhí)安棍狀桿菌c.michiganensis具有明顯的抑菌活性。圖(b)為陽性對照藥劑，1.0mg/ml硫酸鏈霉素對p.syringae；a.avenae；e.carotovora；c.michiganensis的抑菌效果圖，同等濃度下陽性藥劑也具有殺菌效果；圖(c)為陰性對照藥劑(dmso)處理效果，同等條件下不存在抑菌圈。

參見圖2，從左至右依次為：本發(fā)明的海洋真菌提取物對p.syringae的抗菌效果；硫酸鏈霉素對p.syringae的抗菌效果；本發(fā)明的海洋真菌提取物對a.avenae的抗菌效果；硫酸鏈霉素對a.avenae的抗菌效果。本發(fā)明的海洋真菌提取物對e.carotovora的抗菌效果；硫酸鏈霉素對e.carotovora的抗菌效果。圖2的結(jié)果表明，當(dāng)濃度在0.1mg/ml時，本發(fā)明的海洋真菌提取物對p.syringae和a.avenae的抑菌活性強(qiáng)于陽性藥硫酸鏈霉素，對e.carotovora的抑菌活性與陽性藥硫酸鏈霉素相當(dāng)。上述試驗(yàn)充分說明本發(fā)明的海洋真菌提取物對于上述細(xì)菌抗菌活性優(yōu)異，相比現(xiàn)有的抗細(xì)菌藥劑，低濃度下能夠取得顯著的抗菌效果。