一種海洋真菌傘枝霉菌株培養(yǎng)物的菌絲體提取物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是"一種海洋真菌傘枝霉菌株及其菌絲體提取物和應用"的分案申請，原申 請的申請日為：2014年5月15日，申請?zhí)枮?201410203253. 9,發(fā)明名稱為：一種海洋真菌 傘枝霉菌株及其菌絲體提取物和應用。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及海洋微生物菌種，具體涉及一種海洋真菌傘枝霉菌株及其菌絲體提取 物和應用。
【背景技術】
[0003] 病原細菌和真菌可引起動植物的多種病害，其不僅影響農作物產量和經濟動物生 長生產，造成極大的經濟損失；而且影響人體健康，威脅人類生命安全。為了抑制和消滅病 原細菌和真菌，人們一直致力于從不同環(huán)境中尋找新的有效的抗菌藥物，以緩解越來越嚴 重的耐藥性菌株的出現。
[0004] 在抗真菌藥物的研究上，1939年來自青霉菌（Penilliciliumgriseofulvum)菌 體的灰黃霉素（Griseofulvin)成為發(fā)現的第一個抗真菌抗生素，1955年第一個抗真菌藥 物兩性霉素問世，以后又陸續(xù)開發(fā)了氟胞嘧啶和唑類等抗真菌藥物。但是目前抗真菌藥物 仍然存在種類缺乏、選擇性小、毒副作用大和耐藥性強的缺點，因此研究和開發(fā)新型、高效、 低毒、廣譜的抗真菌藥物十分必要。
[0005] 在抗細菌藥物的研究上，從第一個抗菌藥物青霉素的出現，到后來的四環(huán)素、氯霉 素、卡那霉素、利福平等抗生素，都在人類對抗病原細菌上發(fā)揮了較重要作用，但隨著抗生 素的爛用。越來越多的多耐藥性病原菌開始出現，這是人類面臨的又一挑戰(zhàn)，挖掘新的抗菌 藥物和新的抗菌機制，是人類解決這一問題的有效方法之一。
[0006] 在當今陸地生物資源越來越枯竭的背景下，從海洋微生物中尋找新型的藥物是一 條非常有前景的途徑。其中2010年1月到2013年2月，就從海洋細菌、真菌、放線菌中發(fā)現 895個新的具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤和抗污損的天然活性物質（趙成英，朱統(tǒng)漢，朱 偉明，2010-2013之海洋微生物新天然產物，有機化學，2012, 32, 1-41)。海洋微生物產品 開發(fā)上最為成功的例子是1945年從海洋污泥中分離到頂頭孢霉菌，從中發(fā)現了頭孢菌素， 以后發(fā)展成系列的頭孢類抗菌素。而且有證據表明，原來被認為是來源于海綿等海洋生物 的重要活性物質，如海豚毒素、?？舅?、麻殼魚毒素等，實際上也是由微生物產生，這些都 使利用海洋微生物開發(fā)新型藥物成為了焦點。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種海洋真菌傘枝霉菌株及其菌絲體提取物和 應用。
[0008] 本發(fā)明所述的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsis sp. ) QZ042,該菌株已于2013年8月 19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號中國北京中科院微生物研究所），其保藏編號為CGMCCNo. 8101。
[0009] 本發(fā)明所述的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042是從海洋腐木中分離、純 化得到。其分離純化方法為：取海洋腐木樣品，用無菌玻棒搗碎后加入一定量的無菌生理鹽 水，再加入玻璃珠在搖床上震蕩20~30min(通常在20~30°C條件下進行），靜置分層后 取上層液做10倍梯度稀釋，取原倍液、10倍和100倍稀釋液圖布PDA固體平板，26~30°C 恒溫培養(yǎng)，等菌落長出后，挑取菌落劃線純化得到。
[0010] 本發(fā)明所述的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042的特征為產孢子，在海水 PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落初期為棕色，后期顏色逐漸變淺，呈輪紋狀向外生長，菌落邊緣 輪廓清晰，菌落生長較慢，薄而平坦，緊貼培養(yǎng)基，不易挑取，有較多厚垣孢子，有孢囊孢子 和孢子囊；分生孢子為球型，表面帶有明顯的小突起，球體直徑大小約為18~22um;孢子囊 為球型，球體直徑大小約為54~60um。
[0011] 根據常規(guī)方法提取該菌株的DNA，利用真菌的ITS區(qū)的通用引物ITS1 : 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 和ITS4 :5' -TCCTCCGCTTAITGATATGC-3' 擴增其ITS區(qū)，所得 ITS測序序列如下所示：
[0012] CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAG ATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGC AGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGAT TTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCG AGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCG CCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTT TTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACT TGATCTAAATCAGGAGTTC〇
[0013] 根據常規(guī)方法提取該菌株的DNA，利用通用引物5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'和 NS4 :5'-CTTCCGTCAAITCCTTTAAG-3'擴增真菌 18srRNA基因，所得 18srRNA測序序列如下 所示：
[0014] ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAAT CGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAA TTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCG GCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTG TTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCT GGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCAT GCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCC GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCG ACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCATC CGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTT GATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAA TTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTCC TATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGTT CTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCAA TGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTAT TGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACT CATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAAT TTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCG TTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGCC GGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAAT AAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAA GTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTTo
[0015] 綜合上述形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定結果，可以確定該菌株為Umbelopsis屬 真菌，分子生物學鑒定結果表明其親緣關系與Umbelopsis isabellina最近，但是通過形 態(tài)鑒定可以發(fā)現其分生孢子和產孢器形態(tài)結構和大小都與Umbelopsis isabellina有差 異，可能為Umbelopsis isabellina的一個新的變種，我們將該菌株暫定為Umbelopsis sp.QZ042。
[0016] 本發(fā)明的第二個目的在于提供上述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042培養(yǎng) 物的菌絲體提取物，該提取物是以上述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.)QZ042作為發(fā)酵 菌株，液體發(fā)酵獲得發(fā)酵培養(yǎng)物，分離菌絲體和發(fā)酵液，取菌絲體用由乙酸乙酯、甲醇和乙 酸組成的混合溶劑進行浸提，浸提液濃縮，即得。其中，所述組成混合溶劑的乙酸乙酯、甲醇 和乙酸的體積比優(yōu)選為70~80:15~20:4~8,進一步優(yōu)選為75~80:15~18:5~8 ; 所述的液體發(fā)酵是將海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042菌株接種到液體培養(yǎng)基 中，于25~32°C條件下?lián)u床培養(yǎng)5~7天或靜置培養(yǎng)15~30天，以獲得發(fā)酵培養(yǎng)物；在 搖床培養(yǎng)時，轉速優(yōu)選為130~150r/min。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的在于提供上述海洋真菌傘枝霉（Umbel