opsissp. )QZ042培養(yǎng) 物的菌絲體提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0018] 1)種子培養(yǎng)：挑取海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042菌絲接種于PDA固體 培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)5~7天，溫度控制在26~30°C;
[0019] 2)發(fā)酵培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)好的真菌接種于液體培養(yǎng)基上，于25~32°C條件下 搖床培養(yǎng)5~7天或靜置培養(yǎng)15~30天，得到發(fā)酵培養(yǎng)物；
[0020] 3)過(guò)濾：將發(fā)酵培養(yǎng)物過(guò)濾，分離出菌絲體和發(fā)酵液；
[0021] 4)提?。喝【z體用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸組成的混合溶劑進(jìn)行浸提，浸提液 濃縮，即得到海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.)QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物。
[0022] 上述方法的步驟2)中，搖床培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)速優(yōu)選為130~150r/min;步驟4)中，所 述組成混合溶劑的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的體積比優(yōu)選為70~80:15~20:4~8,浸提的 溫度優(yōu)選為〇~8°C，浸提的時(shí)間優(yōu)選為3~4天。
[0023] 申請(qǐng)人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042培 養(yǎng)物的菌絲體提取物在50yg/ml時(shí)，對(duì)大腸桿菌（E.Coli)、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus)、煙 草節(jié)桿菌（Arthrobacternicotianae)、克雷伯氏桿菌（Klebsiellapeneumoniae)、副溶血 弧菌（Vibrioparahaemolyticus)等細(xì)菌的抑制圈直徑d分別為 12. 3mm、14.7mm、17. 2mm、 13. 4mm和22. 5mm，表明海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物對(duì) 細(xì)菌具有抗細(xì)菌活性，可以用來(lái)制備抗細(xì)菌藥物。
[0024] 因此，本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供上述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.) QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物在制備抗大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、煙草節(jié)桿菌、克雷伯氏桿 菌或副溶血弧菌藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明的第五個(gè)目的則在于提供一種抗大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、煙草節(jié)桿菌、 克雷伯氏桿菌或副溶血弧菌的藥物，該藥物包含上述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.) QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物作為活性成分。
[0026] 申請(qǐng)人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.) QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物在lOOyg/ml時(shí)，對(duì)散囊菌（Eurotiumrubrum)、鏈格孢 霉（Alternariasp.)、毛雙抱霉（Lasiodiplodiapseudotheobromae)、莖潰瘍病菌 (Diaporthephaseolorum)等真菌具有明顯的抑菌作用，表明海洋真菌傘枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物對(duì)真菌具有抗真菌活性，可以用來(lái)制備抗真菌藥物。
[0027]因此，本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供上述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.) QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取物在制備抗散囊菌、鏈格孢霉、毛雙孢霉或莖潰瘍病菌藥物中的 應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明的第七個(gè)目的則在于提供一種抗散囊菌、鏈格孢霉、毛雙孢霉或莖潰瘍病 菌的藥物，該藥物包含上述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.)QZ042培養(yǎng)物的菌絲體提取 物作為活性成分。
[0029] 本申請(qǐng)中，所述的液體培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、50%人工海 水1000mL;所述的PDA固體培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、50%人工 海水 1000mL。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種新的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.) QZ042菌株，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)該菌株培養(yǎng)物的菌絲體提取物具有廣譜的抗細(xì)菌、抗真菌活性，其 活性物質(zhì)和抑菌機(jī)制可能不同于已有的抗菌藥物，存在新藥研發(fā)的潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 本發(fā)明所涉及的海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042,已于2013年8月19日 保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)北京中科院微生物研究所），其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 8101。
[0032] 圖1為本發(fā)明所述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042菌株在培養(yǎng)基上的形 態(tài)，其中，A表示PDA培養(yǎng)基上的菌落照片，B表示在光學(xué)顯微鏡下的孢子照片（放大倍數(shù) 10X10)，C表示電鏡下的厚垣孢子，D表示電鏡下的孢子囊，E表示電鏡下的分生孢子梗和 菌絲；
[0033] 圖2為本發(fā)明所述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042的ITS序列進(jìn)化樹(shù)；
[0034] 圖3為本發(fā)明所述海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp.)QZ042的18srRNA序列進(jìn) 化樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
[0036] 實(shí)施例1 :海洋真菌傘枝霉（Umbelopsissp. )QZ042的分離和鑒定
[0037] 1?真菌的分離
[0038] 用無(wú)菌三角瓶取海洋腐木樣品，稱(chēng)取5g，采用無(wú)菌玻棒搗碎后加入50ml無(wú)菌生理 鹽水，加入玻璃珠在搖床上震蕩20min，靜置分層后取上層液做10倍梯度稀釋?zhuān)≡兑骸?10倍和100倍稀釋液圖布PDA固體培養(yǎng)基，26~30°C恒溫培養(yǎng)，等菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落劃 線純化得到。
[0039] 2.真菌的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察
[0040] 培養(yǎng)特征觀察：將菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，26°C恒溫培養(yǎng)獲得菌落。記錄初生 菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特征、有無(wú)色素產(chǎn)生。
[0041] 制片及鏡檢：挑取各菌株產(chǎn)孢器及菌絲制成水封片，棉藍(lán)溶液染色，進(jìn)行鏡下觀 察，記錄菌絲特征及分枝情況、孢子和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)，并拍照記錄。
[0042] 結(jié)果：真菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落初期為棕色，后期顏色逐漸變淺，呈輪 紋狀向外生長(zhǎng)，菌落邊緣輪廓清晰，菌落生長(zhǎng)較慢，薄而平坦，緊貼培養(yǎng)基，不易挑取，有較 多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊，真菌的菌落及孢子如圖1所示（a表示PDA培養(yǎng)基上的 菌落照片，b表示在光學(xué)顯微鏡下的孢子照片（放大倍數(shù)10X10)，c表示電鏡下的厚垣孢 子，d表示電鏡下的孢子囊，e表示電鏡下的分生孢子梗和菌絲）。孢囊孢子、孢子囊、菌絲 的電鏡圖像見(jiàn)圖1，從圖1可以看出QZ042的分生孢子為球型，表面帶有明顯的小突起，球 體直徑大小約為18~22um;孢子囊為球型，球體直徑大小約為54~60um。
[0043] 3.真囷總DNA的提取
[0044] 將分離得到的內(nèi)生真菌接種到ro液體培養(yǎng)基中，于26°C搖瓶培養(yǎng)4d。過(guò)濾收集 菌絲體。菌絲體采用液氮凍融2次，滅菌玻璃棒研磨后用USAOmegaBio-Tek公司的"真菌 基因組DNA小量提取試劑盒"提取真菌的基因組。
[0045] 4.真菌的ITS分子鑒定
[0046]用通用引物ITS1 :5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQIDN0 :1)和ITS4 : 5'-TCCTCCGCTTAITGATATGC-3'（SEQIDN0:2)擴(kuò)增真菌rDNA的間隔序列（含ITS1 區(qū)、5.8S 區(qū)、ITS2 區(qū)）序列。PCR反應(yīng)條件為：94°C變性 5min，然后 94°C，30s-55°C，40s-72°C， 1.Omin進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后72°C延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物純化后直接送上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司，用引物ITS1測(cè)序，所得ITS測(cè)序序列如下所示：
[0047]CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAG ATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGC AGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGAT TTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCG AGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCG CCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTT TTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACT TGATCTAAATCAGGAGTTC(SEQIDNO：3)〇
[0048] 所得的ITS測(cè)序序列在GenBank中采用Blastn進(jìn)行相似性分析，從核酸序列數(shù)據(jù) 庫(kù)中找到與其相似度最高的菌株為Umbelopsis isabellina(AJ876493.1)，相似性達(dá)97%。
[0049] 通過(guò)對(duì)菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)分離的菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系非常獨(dú)特，在系統(tǒng)進(jìn) 化關(guān)系上與Umbelopsisisabellina、Umbelopsisramanniana等在同一個(gè)分支，所得ITS 序列進(jìn)化樹(shù)如圖2所示。
[0050] 5?海洋腐木真菌的18srRNA基因分子鑒定
[0051] 用引物NS1 :5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'（SEQIDN0 :4)和NS4 : 5'-CTTCCGTCAAirCCITTAAG-3'（SEQIDN0:5)擴(kuò)增真菌 18srRNA基因序列。PCR反應(yīng)條 件為：94°C變性5min，然后94°C，30s- 50°C，40s- 72°C，2min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后 72°C延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物純化后直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，用引物 NS1測(cè)序，所得18srRNA測(cè)序序列如下所示：
[0052] ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAAT CGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAA TTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCG GCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTG TTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCT GGCTATTTAGCAGAGTA