專利名稱：利用鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)諾西肽的方法
(一)技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種新的能大量合成諾西肽能力的微生物鏈霉菌，還涉及利用該微生物鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)諾西肽的方法。
背景技術(shù)：
諾西肽是一種含硫多肽類抗生素，最初由一株從阿根廷土壤中分離到的鏈霉菌經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的。后來的研究者又找到了產(chǎn)生諾西肽的其他鏈霉菌菌種。目前諾西肽的產(chǎn)生菌主要有活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosus)、抗生素鏈霉菌(S.antibioticus)和青灰色鏈霉菌(S.glaucogriseus)。其中人們對活躍鏈霉菌的研究最多。諾西肽是一種黃色微細結(jié)晶粉末，熔點為310-320℃，320℃分解， 幾乎無光學(xué)活性。元素組成為C49.6％，H 4.0％，N 14.4％，O 16.7％，S 15.8％。諾西肽的分子式為C51H43N13O12S6，分子量為1222.37。諾西肽易水解，與硫鏈絲菌素相比更易被氧化。諾西肽可溶于DMF、DMSO、吡啶、氯仿、二氧六環(huán)，微溶于甲醇、乙醇、乙酸乙醋，不溶于水，是脂溶性抗生素。諾西肽在體外能有效地抑制革蘭氏陽性菌的生長。和大多數(shù)硫鏈絲菌素族的物質(zhì)一樣，諾西肽能夠通過緊密結(jié)合在23S rRNA的L11蛋白上而阻礙延伸因子Tu和G與50S核糖體的亞基結(jié)合，從而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，達到抑菌的作用確。諾西肽對革蘭氏陽性的球菌、桿菌以及對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素以及其它一些諸如新生霉素、螺旋霉素等的耐藥葡萄球菌有抑菌活性，同時諾西肽對一些革蘭氏陰性菌，如卡他奈必瑟氏菌(Nersseria catarrhalis)出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella mul tooida)有抑菌活性。在體外實驗中，諾西肽對葡萄球菌和鏈球菌的活性與青霉素G相似，或優(yōu)于青霉素G。但在動物體內(nèi)實驗中，諾西肽對經(jīng)過葡萄球菌和鏈球菌感染過的小鼠無作用。
諾西肽的分子結(jié)構(gòu)如下 諾西肽有水溶性差、毒性極低和在動物體內(nèi)無殘留的特點，解決畜禽的肉、蛋、奶中的抗生素殘留問題，而且僅以5-10ppm的濃度加入飼料中就可以提高禽畜的出肉率7％，也可加入魚餌中有預(yù)防魚類的壞死性腸炎和加快其生長的作用，對雞和豬的生長也有很好的效果。還有文獻報道，諾西肽還有抑制乙肝病毒抗原分泌，同時還有促進肝細胞生長的作用。由于它具有用量低、應(yīng)用范圍廣、動物體內(nèi)不殘留等特點。又可明顯促進雞、豬、魚等動物的生長，目前它最大的用途是被開發(fā)成一種商品化的新型非吸收型的飼料添加劑。
80年代法國和日本已正式用此抗生素作飼料添加劑，目前只有少數(shù)幾個國家掌握了其生產(chǎn)工藝。由于其水溶性差尚不能應(yīng)用于臨床，各國抗生素專家都致力于它的生物合成途徑和基因工程的研究(Markus C C，Torsten S，Kevin P F，el al.Pyridinyl polythiazole class peptide antirioticmicrotic micrococcin，Secreted by foodbornh staphylococcus eguorm Ws2733.is biosynthe sized nonribosomally.Eu J Biochem，2001，2686390-6392；周佩，李繼楊，張玲等，諾西肽突變生物合成的研究，中國抗生素雜志，1995，20(3)159-162)，企圖改變其生物合成途徑，獲取結(jié)構(gòu)改變的類似化合物用于臨床。美國Floss實驗室在對諾西肽的結(jié)構(gòu)改造或修飾方面做了大量的工作，并用同位素示蹤等方法對這一天然抗生素的生物合成途徑、分子結(jié)構(gòu)中C、N骨架的來源等加以研究(Floss H G.Biosynthesisof the thiopeptide antibiotic nosiheptide and thiostrepton.InternationalCongress on Natural Products Park City Utah，1988，July，17)，取得了大量的研究成果。例如，通過補加一系列帶有多重標(biāo)記的相同或者不同的穩(wěn)定同位素的前體試驗得到了諾西肽的組成信息。補加L-[1，2-13C2]-Ser和L-[2，3-13C2]-Ser后用13c-13c核磁(NMR)分析結(jié)果表明，Ser作為一個完整的三碳單位摻入到吡啶環(huán)中，兩分子的Ser形成獨特的吡啶環(huán)，同時Ser通過脫水形成脫氫丙氨酸參與諾西肽的合成，Ser衍生成Cys后共同合成噻唑環(huán)部分。13C雙標(biāo)記的色氨酸(Trp)(-COOH和吲哚環(huán)C-2)試驗明確顯示了-COOH經(jīng)過分子內(nèi)重排連接于吲哚環(huán)的C-2上，同時α-C和側(cè)鏈上的氮丟失，亞甲基還原為甲基，只有C-4上的一碳單位來自于蛋氨酸(Met)的甲基。
從九十年代初開始，國內(nèi)周佩等人引入美國華盛頓大學(xué)菌種就諾西肽的發(fā)酵工藝和菌種誘變方面開始進行研究，而國外在八十年代末到九十年代則在進行諾西肽的生物合成，以及諾西肽片段的化學(xué)合成研究。通過放射性物質(zhì)及C標(biāo)記的前體物的補料實驗，對活躍鏈霉菌合成諾西肽進行了研究(周佩，李繼楊，張玲等，諾西肽突變生物合成的研究，中國抗生素雜志，1995，20(3)159-162)，發(fā)現(xiàn)至少有五種氨基酸(Glu、Cys、Thr、Ser、Trp)直接參與了諾西肽的生物合成。根據(jù)參與的能力的強弱依次為絲氨酸、L-甲基甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸、谷氨酸、半胱氨酸。盡管實驗發(fā)現(xiàn)1mmol/L的半胱氨酸已抑制了諾西肽的生物合成，但是在更低的濃度下仍可以檢測到半胱氨酸摻入到諾西肽的分子中。絲氨酸是一個十分有效的前體物，同時它也參與了一碳代謝。丙氨酸雖然是脫氫丙氨酸的可能前體，但它不參與諾西肽的生物合成。放射活性顯示蘇氨酸明顯地參與了諾西肽的生物合成。根據(jù)對已知的含雜環(huán)的抗生素的新生肽鏈合成的機制，Mocek等III推測硫肽類抗生素的合成機制是非核糖體合成。
我國在80年代末期由周佩等開始進行研究(飼料添加劑那西肽的深層培養(yǎng)研究，工業(yè)微生物，1990，20(3)7；含硫多肽類抗生素那西肽的菌種誘變及產(chǎn)量提高，工業(yè)微生物，2000，30(1)50-52)，利用經(jīng)典的方法對菌種進行誘變處理，使產(chǎn)量達到了1500u/ml，是出發(fā)菌株的1.6倍。發(fā)酵工藝主要包括培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH、接種量、培養(yǎng)基組成等方面。周佩等對諾西肽的發(fā)酵工藝進行了比較詳細的研究，獲得了較為適用于工業(yè)生產(chǎn)的搖瓶配方。
Tanaka等發(fā)現(xiàn)諾西肽產(chǎn)生菌Streptomyces antibioticus 8446-CCl后，曾對其發(fā)酵工藝作了初步的研究，所用的培養(yǎng)基配方為糊精(2.5％)、干酵母(2.0％)，NaCl(0.5％)，CaCO3(0.4％)，以上培養(yǎng)基120℃滅菌20分鐘。種子培養(yǎng)基配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。種子用搖瓶培養(yǎng)48小時27℃后以2％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，27℃，300r/min培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)過程中要求良好的通氣效果，每分鐘通入的空氣的體積與發(fā)酵液的體積之比為1∶10。經(jīng)此后再無報道。
目前諾西肽的檢測方法主要有微生物效價測定法(中華人民共和國藥典，二部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，200081)，分光光度法(李霞，吳佩玲，林文彬，等，分光光度法在諾西肽工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999，30(12)548)，薄層色譜法(Claude P，Claude G.MarieM.Indentification of nosiheptide in feeds and detection of residues in animaltissues.J Asoc Off Anal Chem，1979，62(5)976)，高效液相色譜法(HPLC)。其中分光光度法測定諾西肽的含量能快速了解生產(chǎn)水平，對于生產(chǎn)的中間控制有較大意義，并且與微生物效價測定法無顯著性差異。
周佩、李霞等在對那西肽的分離提取和精制的研究結(jié)果表明(飼料添加劑那西肽的分離提取和精制，工業(yè)微生物，1992(6)19-22)，乙醇、丙酮、甲醇以及四氫呋喃對菌絲體內(nèi)那西肽的提取效果較好?？紤]到價格和毒性，采用丙酮和乙醇比較合適。在pH9.0時提取效果最好。精制時，將粗品溶于少量四氫呋喃，過濾，濾液濃縮(必須仍然是清的，如果見混濁需重新過濾)，然后加入正己烷，有少量黃色沉淀析出，放冰箱過夜，離心，得沉淀。再用四氫呋喃溶解，正己烷沉淀，然后真空干燥，即得精品。或者將粗品溶于少量混合溶劑(二氯甲烷∶無水乙醇＝4∶1)中，過濾，濾液加入等體積的乙醚，少量沉淀(絮狀)出現(xiàn)，加塞，靜置，在布氏漏斗上過濾，得濾餅，用乙醚洗兩次，干燥，即得精品。
由上述文獻資料可見，目前關(guān)于諾西肽的生產(chǎn)菌株研究主要集中于活躍鏈霉菌，本菌株Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52是自行從土壤中分離到的，其合成諾西肽的研究尚未見有報道；采用逆流色譜精制諾西肽的研究也未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種能合成諾西肽的微生物菌株，并提供一種利用該新的微生物發(fā)酵生產(chǎn)諾西肽的方法。
本發(fā)明的能合成諾西肽的的微生物新菌株，是鏈霉菌的一個菌種Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52，此菌株是從土壤中培養(yǎng)分離篩選得到。
此菌株已于2005年11月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保存號CCTCC No.M 205133。
此菌株的形態(tài)學(xué)特征如下1、形態(tài)特征菌株菌落呈灰綠色絨狀、表面有皺。在酵母膏麥芽浸汁培養(yǎng)基(ISP2)上培養(yǎng)15天，在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下可以觀察到氣生菌絲和基內(nèi)菌絲多、發(fā)達，菌絲不斷，成熟培養(yǎng)特長有孢子鏈；孢子鏈長，著生于氣生菌絲上，呈螺旋型；在氣生菌絲上形成長螺旋鏈的孢子。孢子卵形，成熟孢子表面可能帶刺。孢子不游動。
2、培養(yǎng)特征在大多數(shù)培養(yǎng)基中，氣生菌絲白色，孢子藍灰色、青灰色，綠灰色等；在其它培養(yǎng)基中為綠色，綠灰色等。
3、生理生化特征參照《伯杰氏細菌分類手冊》第9版的內(nèi)容進行生理生化鑒定。不還原硝酸成亞硝酸鹽；明膠中度液化(10天)；石蕊牛奶微弱胨化(10天)；蛋白胨-酵母膏-鐵瓊脂及酪氨酸培養(yǎng)基上產(chǎn)類黑精素。水解腺嘌呤、次黃嘌呤和酪氨酸，但不水解鳥嘌呤、黃嘌呤(5天)。利用側(cè)金盞花醇、半乳糖、葡萄糖、肌醇、麥芽糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷；中度利用阿拉伯糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、棉子糖、核糖、蔗糖、海藻糖、木糖；微弱利用半乳糖醇；不利用甘油。
4、細胞壁化學(xué)組成細胞壁水解物含有L，L-二氨基庚二酸，細胞壁I型。為典型的鏈霉菌(Streptomyces)。
5、菌種分類依據(jù)形態(tài)特征與胞壁化學(xué)成分定屬的原則，本菌種屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)；依據(jù)培養(yǎng)特征與生理特征定種的原則，確定其與青灰鏈霉菌(Streptomyces glaucogriseus)特征最為接近，故暫定名為青灰鏈霉菌。但該菌種在孢子形態(tài)、顏色及牛奶胨化等方面與青灰鏈霉菌不同，而且有關(guān)該菌種的文獻報導(dǎo)很少，推測其為一種青灰鏈霉菌變種。該菌種產(chǎn)一種諾西肽抗生素。
該新的菌株通常所用的培養(yǎng)基含有碳源(例如葡萄糖、乳糖、淀粉等)，氮源(如黃豆餅、魚粉、硫酸銨、硝酸鹽等)，有機營養(yǎng)物質(zhì)(如酵母抽提物，蛋白胨，胰蛋白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米漿)，無機營養(yǎng)成分(如硫、鎂、鉀、鋅、鐵、鈷和錳)等。培養(yǎng)條件好氧培養(yǎng)，pH7.2至7.6，溫度25℃至30℃，最好在28℃～30℃，培養(yǎng)3～8天。
本發(fā)明所涉及的微生物Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52(CCTCC No.M 205133)是通過以下的程序篩選得到的取分離土樣→加入適當(dāng)濃度制霉菌素和酚進行分離篩選→諾西肽測定→菌種誘變篩選→高產(chǎn)菌種HSC-SN-1-52→菌種保藏。
篩選用的培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，其配方(各重組份重量百分比，g/L)可溶性淀粉2.0；牛肉膏0.1；NaCl 0.05；FeSO47H2O 0.0001；K2HPO40.05；KNO30.1；MgSO47H2O 0.05；Agar 2.2；pH7.2～7.6。
本發(fā)明的另一重要特征是利用該新的微生物Streptomycesglaucogriseus HSC-SN-1-52(CCTCC No.M 205133)制備諾西肽的方法，包括(1)將菌株CCTCC No.M 205133進行斜面活化，菌種在28℃下斜面培養(yǎng)3～5天，然后種子培養(yǎng)2～3天，搖瓶種子培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L可溶性淀粉3.0；酵母粉0.1；黃豆粉2.0；FeSO47H2O 0.0001；K2HPO40.05；MgSO47H2O 0.05；Agar 2.2；pH7.2～7.6；(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后接菌種，發(fā)酵培養(yǎng)基配方，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L玉米淀粉3-4.5，葡萄糖0.5-1.5，黃豆粉3-4.5，酵母粉0.1-0.3，NaCl 0.4，CaCO30.4，自來水配制，調(diào)節(jié)pH7.2～7.6；調(diào)節(jié)pH用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)。
(3)發(fā)酵工藝a.菌種的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的5％～10％(同單位體積之比)；b.發(fā)酵過程中，長菌溫度為28℃～30℃，時間為5～8天；(4)分離提取發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液用等量的95％乙醇浸泡提取，提取液真空濃縮至1/4體積。
(5)精制加等體積正丁醇溶解，上逆流色譜儀進行分離，收集諾西肽餾分濃縮蒸干即可，諾西肽得率為78.2％(測定方法中華人民共和國藥典.二部.北京化學(xué)工業(yè)出版社，200081)。目前諾西肽的檢測方法主要有微生物效價測定法(中華人民共和國藥典，二部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，200081)，分光光度法(李霞，吳佩玲，林文彬等，分光光度法在諾西肽工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999，30(12)548)，薄層色譜法(Claude P，Claude G.Marie M.Indentification ofnosiheptide in feeds and detection of residues in animal tissues.J Asoc OffAnal Chem，1979，62(5)976)，高效液相色譜法(HPLC)。其中分光光度法測定諾西肽的含量能快速了解生產(chǎn)水平，對于生產(chǎn)的中間控制有較大意義，并且與微生物效價測定法無顯著性差異。
本發(fā)明發(fā)酵過程中培養(yǎng)液內(nèi)補充硫源，或補充硫源和特定氨基酸絲素肽，可促進諾西肽的合成，補加方式為間歇補加；補加的硫源是硫酸鉀，間歇三次添加硫酸鉀總量為0.001～0.2克；硫源的提供方式可以是其水溶液，或者是固體粉末直接添加，其水溶液濃度為0.4％；基酸絲素肽分間歇三次添加，總量為0.002～0.4g。
本發(fā)明具有如下特點采用本發(fā)明的菌株Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52(CCTCCNo.M 205133)具有產(chǎn)生諾西肽的能力，搖瓶培養(yǎng)諾西肽產(chǎn)率1700mg/L，10升罐上培養(yǎng)7天諾西肽產(chǎn)率1500mg/L；發(fā)酵72小時、96小時、120小時補加硫源和/或特定氨基酸促進諾西肽的合成；諾西肽的分離提取采用逆流色譜工藝進行，諾西肽的收率達78.2％。
(四)具體實施方案 下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1斜面培養(yǎng)基配方各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L，其配比為可溶性淀粉2.0；牛肉膏0.1；NaCl 0.05；FeSO47H2O 0.0001；K2HPO40.05；KNO30.1；MgSO47H2O 0.05；Agar(即瓊脂粉)2.2；pH7.2～7.6；發(fā)酵培養(yǎng)基配方(各組分的含量均為重量體積百分比，g/L)玉米淀粉3；葡萄糖0.5；黃豆粉3.0；酵母粉0.1；NaCl 0.4；CaCO30.4；pH7.2～7.6；自來水配制；發(fā)酵工藝將菌株CCTCC No.M 205133進行斜面培養(yǎng)活化，斜面菌種培養(yǎng)3-5天；按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制80mL發(fā)酵液于500ml三角瓶中，經(jīng)滅菌后接種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的5％(以斜面孢子懸浮液接種)，即4mL孢子懸浮液；300轉(zhuǎn)/分，25℃～30℃振蕩培養(yǎng)5天；發(fā)酵結(jié)束，分光光度法測定發(fā)酵液諾西肽效價為870mg/L。
實施例2斜面培養(yǎng)基配方同實施例1；發(fā)酵培養(yǎng)基(各組分的含量均為重量體積百分比，g/L)玉米淀粉4.0；葡萄糖1.0；黃豆粉3.5；酵母粉0.3；NaCl 0.4；CaCO30.4；pH7.2～7.6；自來水配制；發(fā)酵工藝將菌株CCTCC No.M 205133進行斜面培養(yǎng)活化，斜面菌種培養(yǎng)3-5天；按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制80mL發(fā)酵液于500ml三角瓶中，經(jīng)滅菌后接種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的7％，即5.6mL孢子懸浮液((以斜面孢子懸浮液接種)；300轉(zhuǎn)/分，28℃～30℃振蕩培養(yǎng)8天；發(fā)酵72小時、96小時、120小時分別進行補加硫源(三次共加入硫酸鉀的量為0.001g，以濃度為0.4％的硫酸鉀溶液方式加入，加入的體積數(shù)，以總量0.001g硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn))及特定氨基酸(三次共加入0.002g絲素肽)；發(fā)酵結(jié)束，分光光度法測定發(fā)酵液諾西肽效價為1700mg/L。
實施例3斜面培養(yǎng)基同實施例1；搖瓶種子培養(yǎng)(各組分的含量均為重量體積百分比，g/L)可溶性淀粉3.0；酵母粉0.1；黃豆粉2.0；FeSO47H2O 0.0001；K2HPO40.05；MgSO47H2O 0.05；Agar 2.2；pH7.2～7.6；
發(fā)酵培養(yǎng)基(各組分的含量均為重量體積百分比，g/L)玉米淀粉4.5；葡萄糖1.5；黃豆粉4.0；酵母粉0.3；NaCl 0.4；CaCO30.4；pH7.2～7.6；自來水配制；硫源的提供方式接種培養(yǎng)72小時、96小時、120小時間歇補加三次；發(fā)酵工藝將菌株CCTCC No.M 205133進行斜面培養(yǎng)活化，斜面菌種培養(yǎng)3-5天；然后接種入搖瓶種子培養(yǎng)基中進行搖瓶菌種培養(yǎng)，搖瓶菌種培養(yǎng)2-3天；按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子液，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的7％，即700mL；在開始培養(yǎng)72小時、96小時、120小時共加入0.2g硫酸鉀(三次共加入硫酸鉀的量為0.2g，以濃度為0.4％的硫酸鉀溶液方式加入，加入的體積數(shù)，以總量0.2g硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn))；發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度28℃～30℃，攪拌轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，通氣量1∶0.8～1.5(vvm)，時間6天；分光光度法測定諾西肽產(chǎn)率為1100mg/L；諾西肽的提取精制發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液采用95％乙醇進行浸泡，離心機進行固液分離收集濾液，真空濃縮至1/4體積；用正丁醇溶解，上逆流色譜分離收集諾西肽組分，逆流色譜轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/分，溶劑體系為正丁醇-水(1∶1)，然后濃縮蒸干，諾西肽收率76％，產(chǎn)品純度86.4％。
實施例4斜面培養(yǎng)基同實施例1；搖瓶種子培養(yǎng)同實施例3；發(fā)酵培養(yǎng)基(各組分的含量均為重量體積百分比，g/L)玉米淀粉4.5；葡萄糖0.5；黃豆粉4.4；酵母粉0.3；NaCl 0.4；CaCO30.4；pH7.2～7.6；自來水配制；硫源的提供方式接種培養(yǎng)72小時、96小時、120小時間歇補加三次；發(fā)酵工藝將菌株CCTCC No.M 205133進行斜面培養(yǎng)活化，斜面菌種培養(yǎng)3-5天；然后接種入搖瓶種子培養(yǎng)基中進行搖瓶菌種培養(yǎng)，搖瓶菌種培養(yǎng)2-3天；按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子液，種子液的接種量為培養(yǎng)基溶液的10％，即1000mL；在開始培養(yǎng)72小時、96小時、120小時共加入0.2g硫酸鉀(粉末固體)和特定氨基酸混合物(絲素肽0.4g)；發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度控制28℃～30℃，攪拌轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，通氣量1∶0.8～1.2(vvm)，時間7天，分光光度法測定諾西肽產(chǎn)率為1500mg/L；諾西肽的提取精制發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液采用95％乙醇進行浸泡，離心機進行固液分離收集濾液，真空濃縮至1/4體積；用正丁醇溶解，上逆流色譜分離收集諾西肽組分，逆流色譜轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/分，溶劑體系為正丁醇-水(1∶1)，然后濃縮蒸干，諾西肽收率78.2％。產(chǎn)品純度86.7％。
權(quán)利要求
1.一種利用鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)諾西肽的方法，其特征是所述的能生產(chǎn)諾西肽的微生物菌株是鏈霉菌Streptomyces glaucogriseus HSC-SN-1-52，CCTCC No.M 205133，該菌株與含碳源、氮源、無機鹽的培養(yǎng)基，進行發(fā)酵，經(jīng)粗提、精制后獲得諾西肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，利用微生物鏈霉菌CCTCC No.M 205133生產(chǎn)諾西肽的方法，包括(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，g/L玉米淀粉3-4.5，葡萄糖0.5-1.5，黃豆粉3-4.5，酵母粉0.1-0.3，NaCl 0.4，CaCO30.4，自來水配制，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6；(2)將菌株CCTCC No.M 205133進行斜面培養(yǎng)活化，搖瓶種子培養(yǎng)，種子液接入上述培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，發(fā)酵工藝a.種子液的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液同單位的5％～10％；b.發(fā)酵過程條件控制溫度為28℃，通風(fēng)量1∶0.8～1.2vvm，時間為5～8天；(3)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液用有機溶劑粗提、精制等得到精制諾西肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟(2)的發(fā)酵過程中，采取補料方式補加硫源和/或特定氨基酸絲素肽，在接種后72h開始，在120h內(nèi)加完。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是發(fā)酵過程補加的硫源是硫酸鉀，分間歇三次添加，總量為0.001～0.2克；硫源的提供方式可以是其水溶液，或者是固體粉末直接添加，其水溶液濃度為0.4％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是補加的特定氨基酸絲素肽，分間歇三次添加，總量為0.002～0.4g。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是發(fā)酵結(jié)束后用乙醇溶劑粗提，發(fā)酵液采用95％乙醇進行浸泡，離心機進行固液分離收集濾液，真空濃縮至1/4體積，獲得諾西肽粗品。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是采用逆流色譜精制，粗提獲得的濃縮諾西肽粗品，用正丁醇溶解，上逆流色譜分離收集諾西肽組分，逆流色譜轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/分，溶劑體系為正丁醇-水(1∶1)，然后濃縮蒸干，獲得精制諾西肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及諾西肽的發(fā)酵制備方法，該方法利用發(fā)明人篩選并保藏的具有生產(chǎn)諾西肽能力的鏈霉菌(Streptomyces glaucogriseus)HSC－SN－1－52，CCTCC No.M 205133，在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)該新菌株，包括發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選，硫源及特定氨基酸的補加發(fā)酵工藝選定，發(fā)酵液采用逆流色譜精制法制得諾西肽制品。本發(fā)明所得菌種諾西肽產(chǎn)率達1500mg/L以上，收率為75％以上。
文檔編號A61P31/04GK1840684SQ20061004937
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者梁新樂, 勵建榮, 張虹, 陳敏, 呂民主 申請人:浙江工商大學(xué)