技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于動物模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種人急性胰腺炎小鼠模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：
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急性胰腺炎(acutepancreatitis，ap)是一種臨床上常見，且具有潛在致命危險的急腹癥。盡管對ap的診治取得了很大進(jìn)展，但病死率仍在10％左右，重癥患者達(dá)50％。其中最重要的原因在于，ap的初始化的具體機(jī)制并未被完全認(rèn)識，也就無從指導(dǎo)新的、更有效的治療胰腺炎藥物的開發(fā)。近20多年來，大量的、基于實(shí)驗(yàn)性胰腺炎動物模型的研究發(fā)現(xiàn)腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原(trypsingen)過早激活在ap初始化過程中起到了關(guān)鍵作用。但是關(guān)于trypsingen活化的具體機(jī)制及其在胰腺炎發(fā)展過程中的作用地位尚未得到明確解釋。造成目前胰腺炎領(lǐng)域研究遲滯不前的重要原因在于：缺乏理想的實(shí)驗(yàn)動物模型來完成體內(nèi)試驗(yàn)。

目前，有以下幾種實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎的動物模型被廣泛使用，包括雨蛙素注射、胰管結(jié)扎、膽鹽胰管逆行灌注、乙硫氯酸飲食以及精氨酸注射等方法。這些動物模型在很大程度上加深了我們對急性胰腺炎早期腺泡損傷機(jī)制的認(rèn)識。然而，這些動物模型在誘發(fā)胰腺炎的過程中往往會產(chǎn)生非特異性的表現(xiàn)，而不是針對胰蛋白酶原特異性的激活。并且在過去40年里，超過70例的臨床試驗(yàn)并沒有發(fā)現(xiàn)明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：抑制胰蛋白酶(trypsin，為trypsingen活化產(chǎn)生)激活可以改善胰腺炎的發(fā)病過程。針對臨床與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致性的最大可能就是現(xiàn)有的動物模型并不適合研究腺泡內(nèi)胰蛋白酶原的激活在胰腺炎起始發(fā)病階段中的作用，以及檢測潛在性的藥物對于胰腺炎治療和保護(hù)的作用。因此，新型的動物模型亟需構(gòu)建用來研究胰腺炎起始過程中胰蛋白酶的作用，而轉(zhuǎn)基因動物為基礎(chǔ)研究及新藥的開發(fā)帶來了可能。

saluja等利用基因敲除的方法建立了敲除trypsingen異質(zhì)體表達(dá)基因(為小鼠的基因)的轉(zhuǎn)基因小鼠，并進(jìn)行了初步研究。與傳統(tǒng)觀點(diǎn)不同在于，他們認(rèn)為：腺泡內(nèi)胰蛋白酶原的活化導(dǎo)致了ap早期腺泡的壞死，這些損傷占到了ap50％的損傷。但是，ap局部及全身的炎癥反應(yīng)，以及慢性胰腺炎的進(jìn)展并不需要trypsingen的活化。n等人制作了表達(dá)人野生型prss1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究，他們認(rèn)為：prss1基因的表達(dá)促進(jìn)了小鼠腺泡細(xì)胞的凋亡，并且可以存進(jìn)自發(fā)性胰腺炎的發(fā)生。上述兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)論部分相悖，分析其原因在于所使用的轉(zhuǎn)基因小鼠存在缺陷：用于表達(dá)目的基因的啟動子都是大鼠源性的彈性蛋白酶，而不是人源性的彈性蛋白酶，因此從根本上對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性存在質(zhì)疑。理想狀態(tài)的ap轉(zhuǎn)基因動物模型除了要將人陽離子胰蛋白酶原基因定位表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞，同時必須使用人源性的彈性蛋白酶作為啟動子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種人急性胰腺炎小鼠模型的構(gòu)建方法，利用本發(fā)明的方法構(gòu)建得到的人急性胰腺炎小鼠模型，符合人陽離子胰蛋白酶原基因定位表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞，同時必須使用人源性的彈性蛋白酶作為啟動子，并且其表型與人急性胰腺炎的發(fā)病過程十分相似，因而是一種非常好的人急性胰腺炎的疾病模型。

本發(fā)明的人急性胰腺炎小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

構(gòu)建含有prss1基因(humancationictrypsingen，人陽離子胰蛋白酶原基因)的打靶載體質(zhì)粒，將含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞，得到攜帶有重組prss1基因的小鼠胚胎干細(xì)胞；將攜帶有重組prsss1基因的小鼠胚胎干細(xì)胞顯微注射入白化的小鼠囊胚期細(xì)胞中，將注射完畢后的囊胚期細(xì)胞移入假孕母鼠子宮內(nèi)待產(chǎn)，移植后獲得嵌合鼠；將嵌合率>50％的雄性嵌合體小鼠與野生型c57bl/6j雌性小鼠合籠，繁殖產(chǎn)生下一代小鼠，篩選攜帶有prss1基因的小鼠，即為模擬人急性胰腺炎的小鼠模型。

所述的含有prss1基因(humancationictrypsingen，人陽離子胰蛋白酶原基因)的打靶載體質(zhì)粒，其核苷酸序列優(yōu)選如seqidno.1所示。

進(jìn)一步，含有prss1基因(humancationictrypsingen，人陽離子胰蛋白酶原基因，genbankaccessionnumber:nm_002769.4)的打靶載體質(zhì)粒構(gòu)建方法如下：

以prss1-bac質(zhì)粒為模板，在引物pcr1f和pcr1r、pcr2f和pcr2r、pcr3f和pcr3r的作用下進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別獲得擴(kuò)增產(chǎn)物prss1-pcr1、擴(kuò)增產(chǎn)物prss1-pcr2和擴(kuò)增產(chǎn)物prss1-pcr3；將prss1-pcr1與載體pl253連接形成質(zhì)粒prss1-pcr1-pl253，再將擴(kuò)增產(chǎn)物prss1-pcr2與質(zhì)粒prss1-pcr1-pl253通過雙酶切后進(jìn)行連接，形成質(zhì)粒prss1-pcr1-pcr2-pl253，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物prss1-pcr3與質(zhì)粒prss1-pcr1-pcr2-pl253經(jīng)雙酶切后進(jìn)行連接，形成質(zhì)粒prss1-pcr1-pcr2-pcr3-pl253。

所述的攜帶有重組prss1基因的小鼠胚胎干細(xì)胞構(gòu)建方法如下：

(1)用noti處理含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒，使之線性化，調(diào)整質(zhì)粒載體的dna濃度約為1-5μg/μl；

(2)受精卵的準(zhǔn)備：篩選3-4周c57bl/6j雌鼠，分別注射孕馬血清(pmsg)與絨毛膜促性腺激素(hcg)，兩者時間間隔46-48h。注射hcg后將雌鼠與成年的可育成年雄鼠交配，使雌鼠受精。次日將雌鼠安樂死后，從輸卵管內(nèi)收集受精卵，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

(3)原核顯微注射：制備顯微注射注射針和固定針。將已線性化和純化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒稀釋為1-5ng/ul的注射液，將注射液加樣到顯微注射針內(nèi)。篩選形態(tài)正常的受精卵置于注射皿內(nèi)進(jìn)行顯微注射。在200-400倍的倒置顯微鏡下，將外源的dna溶液(注射液)通過顯微注射的方式注射到受精卵細(xì)胞核內(nèi)。將注射完畢的受精卵轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1h后進(jìn)行移植；或者培養(yǎng)至2cell，待第二天進(jìn)行移植。

(4)代孕鼠制備及胚胎移植：

準(zhǔn)備假孕母鼠：選取適齡的可育與輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配，剌激雌鼠發(fā)生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠，作為受精卵轉(zhuǎn)基因后的代孕鼠。將已經(jīng)注射了外源基因的受精卵移植入見栓當(dāng)天的代孕母鼠的輸卵管內(nèi)。將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養(yǎng)。輸卵管移植成功后，母鼠一般會在手術(shù)后19-20天產(chǎn)仔。小鼠出生1周后，可對小鼠進(jìn)行剪爪編號，同時進(jìn)行pcr鑒定；小鼠出生3周后，可分籠獨(dú)立飼養(yǎng)。

(5)出生f0小鼠的鑒定：采集1-2周齡的幼鼠組織(尾巴或者腳趾組織)，對組織進(jìn)行裂解和提取基因組。用針對目的基因的特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增及電泳檢測，篩選出外源基因整合的后代。有整合的鼠稱為首建鼠(founder)，可進(jìn)行傳代和建系，同時有需要可進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的鑒定。

(6)轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代和建系:將帶有外源基因的小鼠與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的小鼠交配、傳代；每只首建鼠都需要獨(dú)立進(jìn)行傳代。對出生的f1小鼠進(jìn)行鑒定，能正常生殖系傳遞的f0，其后代有50％機(jī)率帶有整合的目的基因?？蓪@得的f1陽性小鼠用于實(shí)驗(yàn)和繼續(xù)傳代。如果需要獲得純合子，可能來源相同的陽性f1進(jìn)行同胞交配，出生的f2代小鼠，會有25％的概率為純合子。將篩選出目的基因有表達(dá)的小鼠，建系穩(wěn)定的傳代，同時記錄傳代情況和譜系。由此得到prss1基因敲入小鼠，即人急性胰腺炎小鼠模型。

prss1基因敲入小鼠表型鑒定：本發(fā)明構(gòu)建的prss1基因敲入小鼠(12-16周)注射雨蛙素24小時后，即可出現(xiàn)急性胰腺炎的表現(xiàn)；反復(fù)注射雨蛙素4周后可出現(xiàn)慢性胰腺炎的表現(xiàn)。迄今，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道、專利數(shù)據(jù)庫和包括世界最大的小鼠資源中心美國jackson研究所在內(nèi)的動物模型目錄中，均未見相關(guān)野生型prss1基因敲入小鼠的信息。因此，本發(fā)明的小鼠模型可廣泛用于人急、慢性胰腺炎的致病病因、病理機(jī)制等研究。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生、篩選到了國際上首個prss1基因敲入(knock-in)的小鼠品系。模型小鼠的表型與人胰腺炎的發(fā)病過程非常吻合，從而得到一個從基因到表型完全模仿人胰腺炎的特異動物模型，可進(jìn)一步廣泛用于人prss1的致病病因、病理機(jī)制等研究，以及對胰腺炎治療藥物的篩選和基因治療試驗(yàn)等。

附圖說明：

圖1是含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖2是引物f2/r2和引物f3/r3擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。

圖3是酶draiii和酶nrui的酶切產(chǎn)物電泳圖。

圖4是酶bg1i的酶切產(chǎn)物電泳圖。

圖5是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉(zhuǎn)基因的pcr鑒定結(jié)果(引物f1和r1)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型小鼠，water為水。

圖6是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉(zhuǎn)基因的pcr鑒定結(jié)果(引物f2和r2)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。

圖7是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉(zhuǎn)基因的pcr鑒定結(jié)果(引物f3和r3)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。

圖8是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉(zhuǎn)基因的pcr鑒定結(jié)果(引物f4和r4)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。

圖9是prss1基因敲入小鼠中鑒定prss1轉(zhuǎn)基因的pcr鑒定結(jié)果(引物f5和r5)，10為prss1基因敲入小鼠，m為marker，positive為陽性對照，wt為野生型，water為水。

圖10是prss1蛋白在prss1基因敲入小鼠胰腺組織中的表達(dá)。在野生型(wt)小鼠中，prss1幾乎無表達(dá)，而prss1基因敲入小鼠中prss1蛋白的表達(dá)量幾乎占正常人的50％，說明該轉(zhuǎn)基因小鼠與人相比有可比性，可以用來模擬人急性胰腺炎的發(fā)病過程。

圖11是prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素(cerulein)后(24h后)誘發(fā)急性胰腺炎(ap)表型及胰腺組織he染色圖片。與野生型小鼠相比，prss1基因敲入小鼠注射cerulein后胰腺組織水腫明顯伴炎性細(xì)胞浸潤。

圖12是與野生型小鼠相比，prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素24h后，胰腺淀粉酶、組織評分、組織水腫程度以及trypsin活性明顯升高。說明prss1可以很好的模擬出人急性胰腺炎的發(fā)病過程。

圖13是prss1基因敲入小鼠反復(fù)注射雨蛙素(cerulein)后(40min后)microsome酶的活性明顯升高，而zymogen及l(fā)ysome活性無明顯改變。這些改變在野生型小鼠中都無明顯改變。

圖14是prss1基因敲入小鼠反復(fù)注射雨蛙素(cerulein)后(4周后)誘發(fā)慢性胰腺炎(cp)表型及胰腺組織he及mason染色圖片。prss1小鼠還可以很好地模擬慢性胰腺炎的發(fā)病過程，即反復(fù)發(fā)作的急性胰腺炎可以演變?yōu)槁砸认傺住?/p>

圖15是野生型小鼠與prss1基因敲入小鼠慢性胰腺炎相關(guān)指標(biāo)的對比?？梢悦黠@看出prss1小鼠在胰腺比重、組織評分、血糖方面在注射完雨蛙素后改變明顯。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是本發(fā)明的限制。

小鼠的飼養(yǎng)和繁育：c57bl/6j購自jackson實(shí)驗(yàn)室(美國)，飼養(yǎng)在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動物研究所的spf級的動物房里。所有的小鼠操作得到了南方醫(yī)科大學(xué)動物研究所動物管理委員會的批準(zhǔn)和監(jiān)督。

實(shí)施例1含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒的構(gòu)建

一、載體的構(gòu)建：構(gòu)建示意圖如圖1所示。

1、構(gòu)建中間載體，將目的片段構(gòu)建進(jìn)pstart-k骨架上；

2、擴(kuò)增待重組片段；

3、將擴(kuò)增片段與bac進(jìn)行同源重組；

4、篩選正確克?。?/p>

5、將bac上的目的片段擴(kuò)增送測；

6、將測序正確的bac進(jìn)行環(huán)測。

7、驗(yàn)證獲得載體的正確性。

8、載體質(zhì)粒(即為含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒，其核苷酸序列如seqidno.1所示)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化有載體質(zhì)粒的大腸桿菌菌液。

二、質(zhì)粒制備

1、將菌液進(jìn)行平板劃線，挑取單克隆

將步驟一的轉(zhuǎn)化有載體質(zhì)粒的大腸桿菌菌液進(jìn)行平板劃線，然后隨機(jī)挑取8個克隆進(jìn)行pcr驗(yàn)證

所用引物：

f2:ggaagactgatttttgcatatcatg

r2:ggttctttaatctaacatatcccct

擴(kuò)增產(chǎn)物為314bp。

f3:agcacatagagacaaaatatgc

r3:ggtcatcagtatatcgaactattct

擴(kuò)增產(chǎn)物為364bp。

如果都能擴(kuò)增到上述兩個擴(kuò)增產(chǎn)物，則該克隆是陽性克隆，命名為攜帶含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒的大腸桿菌。pcr產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。

2、從上述陽性克隆中挑取一個克隆進(jìn)行搖菌培養(yǎng)

將上述攜帶含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒的大腸桿菌接種到100ml已加抗生素的lb培養(yǎng)基里，后放置到振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司，貨號：zqly-300s)培養(yǎng)，參數(shù)設(shè)定37℃225rpm/min，培養(yǎng)時間16h。

3、質(zhì)粒抽提

待搖菌時間到后，用qiagen質(zhì)粒dna純化試劑盒(凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司，貨號：12145)進(jìn)行質(zhì)粒抽提，得到質(zhì)粒，具體方法如下：

a)收獲lb培養(yǎng)過夜的細(xì)菌，在6000g，4℃條件下離心15min。

b)加入10mlbufferp1重懸細(xì)菌。

c)加10mlbufferp2，劇烈晃動離心管4-6次使其徹底混勻，室溫放置5min。如果使用了lyseblue試劑，溶液應(yīng)該變成均勻藍(lán)色。

d)在孵育期間，打開針口的密封蓋.并把過濾器放到合適的架子上。

e)加入10ml冰浴的bufferp3到此溶菌產(chǎn)物中，劇烈晃動離心管4-6次使其混勻。如果加入了lyseblue試劑，混勻試劑直到?jīng)]有顏色。

f)將溶菌產(chǎn)物倒入針口密封的過濾器中，室溫放置10min，不要插入活塞。打開針口的密封蓋，輕輕擠壓活塞將溶菌產(chǎn)物過濾到一新的50ml離心管中。

g)加2.5mlbufferer到過濾的溶菌液中，充分混勻10次后冰上孵育30min。

h)將qiagen-tip500的柱子掛在另一離心管上，加入10mlbufferqbt，讓管中溶液通過重力滴下排空。

i)將第7步冰上孵育的溶菌液加入qiagen-tip柱子中讓其透過樹脂慢慢滴下。

j)10用2×30mlbufferqc洗qiagen-tip柱。

k)11再用15mlbufferqn洗脫dna，用離心管收集dna洗脫液。

l)12加入10.5ml異丙醇到洗脫液中使dna沉淀下來，混勻。大于15000×g，4℃離心30min，離心后小心倒出上清液。

m)13洗dna用5ml無內(nèi)毒素-70％乙醇(添加40ml96％-100％乙醇到試劑盒的無內(nèi)毒素水中)，15000g，4℃離心10min。小心倒出上清液不要碰到質(zhì)粒。

n)14烘干離心管底部的質(zhì)粒5-10min。用合適體積的bufferpa重新溶解dna。

o)15檢測dna質(zhì)粒的濃度并記錄。

4、質(zhì)粒的檢測

將步驟3提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切時間1h

酶切體系：20ul

dna500ng

buffer2ul

酶(draiii或nrui)1ul

水補(bǔ)齊至20ul

酶切方案：

draiii12.514/9.181/6.336/3.557/3.132/1.740(kbp)

nrui36.460(kbp)

酶切產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。由此得到含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒，經(jīng)測序，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

5、質(zhì)粒的線性化

將上述含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒進(jìn)行線性化酶切，酶切體系

dna30ug

酶(nrui)70u

buffer25ul

水補(bǔ)齊至250ul

37℃酶切時間16h

酶切方案nrui36.460kbp

由此得到線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒。

6、dna片段(線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒)的回收

將上述步驟5的含線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖膠回收，使用的試劑盒是qiaquickgelextractionkit(250)貨號是28706，方法如下：

a)紫外燈下小心地把包含有的大小約36.460kbp的dna的片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。

b)稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積，并加入700μlbufferqg，50℃孵化10min。

c)10min后待凝膠塊徹底溶化后，密切觀察混合溶液的顏色是不是黃色，若顏色為黃色，則繼續(xù)下步操作。

d)向混合溶液中加入230μl異丙醇并充分混勻。

e)將qiaquick離心柱(qiaquickspincolumn)裝在一個干凈的2ml收集管中。

f)把③中的所得溶液放入qiaquick吸附柱中，13,000rpm離心1min。棄掉廢液，并把qiaquick離心柱重新套回2ml收集管中。

g)在離心柱中加0.5mlbufferqg，13,000rpm離心1min。

h)把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1min，離心管中的溶液就是純化回收的dna產(chǎn)物，保存于-20度備用用于酶連用。在離心柱中再次加0.75mlbufferpe，13,000rpm離心1min。

i)棄去液體，再次13,000rpm離心1min。

j)取出離心柱，把離心柱裝在一個干凈的1.5ml微量離心管上。

k)在吸附柱的中間部位加50μlbuffereb(10mmtris·cl,ph8.5)，溫室放置1min，再次13,000rpm離心1min，取上清液，-20度保存?zhèn)溆谩Ｓ纱说玫骄€性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒。

7、回收片段的鑒定

將上述的回收片段(線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒)進(jìn)行酶切鑒定，

酶切體系：20ul

dna500ng

buffer2ul

酶1ul

水補(bǔ)齊至20ul

酶切方案：bgli11/10/6.4/5/3.2/0.8

酶切產(chǎn)物電泳圖如圖4所示，由此得到線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒。

8、交付下游

以上檢測完成后，再將線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒打標(biāo)簽分裝給下游進(jìn)行注射。

二、受精卵的準(zhǔn)備

1、受精卵的準(zhǔn)備：篩選3-4周c57bl/6雌鼠，分別注射孕馬血清(pmsg)與絨毛膜促性腺激素(hcg)，兩者時間間隔46-48h。

2、注射hcg后將雌鼠與成年的可育成年雄鼠交配，使雌鼠受精。

3、次日上午9點(diǎn)將雌鼠使用二氧化碳安樂死后，準(zhǔn)備取受精卵的培養(yǎng)皿(將2mlm2(試劑廠商sigma)培養(yǎng)基放置37度預(yù)熱臺預(yù)熱半小時)，將小鼠卵巢取出放置預(yù)熱后的培養(yǎng)皿，加入60微升透明質(zhì)酸(試劑廠商sigma),進(jìn)行從輸卵管內(nèi)收集受精卵，取完放置在(平衡12小時的m16(試劑廠商sigma)培養(yǎng)皿中培養(yǎng))c02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

三、原核顯微注射

1、制備顯微注射注射針和固定針。

2、將已線性化和純化的質(zhì)粒(線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒)稀釋為1-5ng/ul的注射液，將注射液使用加樣器加樣到顯微注射針內(nèi)。

3、篩選形態(tài)正常的受精卵待用，制作m2注射滴，將篩選好受精卵放入注射滴，使用石蠟油(試劑廠商sigma)進(jìn)行覆蓋，放置顯微鏡下注射。

4、在200-400倍的倒置顯微鏡下，將外源的dna溶液(線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒)通過顯微注射的方式注射到受精卵細(xì)胞核內(nèi)。注射用氣體采用氮?dú)?，注射前將氣體壓力調(diào)至使核區(qū)膨脹2至3倍左右大小。

5、將注射完畢，將注射皿移到培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1h后進(jìn)行移植；或者將受精卵移至m16培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)至2cell，待第二天進(jìn)行移植。

四、代孕鼠制備及胚胎移植

1、準(zhǔn)備假孕母鼠：選取適齡的可育與輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配，剌激雌鼠發(fā)生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠，作為受精卵轉(zhuǎn)基因后的代孕鼠。

2、移植前使用麻藥(每次測試合適的麻藥劑量進(jìn)行腹腔注射)將代孕鼠麻倒，再進(jìn)行右側(cè)背部開1cm口，開口之前使用酒精棉球進(jìn)行擦拭開口部位，使用高溫高壓滅菌的實(shí)驗(yàn)器材剪刀鑷子拉出輸卵管并暴露在視野里，將已注射外源基因(線性化的含有prss1基因的打靶載體質(zhì)粒)的受精卵移植入輸卵管內(nèi)，使用不銹鋼傷口夾縫合。

3、將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養(yǎng)。第二天觀察做完實(shí)驗(yàn)的代孕鼠是否有異常。

4、輸卵管移植成功后，母鼠一般會在手術(shù)后19-20天產(chǎn)仔。

5、小鼠出生1周后，可對小鼠進(jìn)行剪爪編號，同時進(jìn)行pcr鑒定；小鼠出生3周后，可分籠獨(dú)立飼養(yǎng)。

五、小鼠鑒定

1：對采集到的1-2周齡的幼鼠組織(尾巴或者腳趾組織)進(jìn)行裂解和提取基因組。

2、用針對目的基因(prss1基因)的特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增及電泳檢測，篩選出外源基因整合的后代。

具體使用的引物如下：

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用上述五對pcr引物擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖5-9所示，從上面可以看出，能用五對pcr引物擴(kuò)增后都能擴(kuò)增得到目的片段的小鼠為prss1基因整合的后代。有整合的鼠稱為首建鼠(founder)，可進(jìn)行傳代和建系，同時有需要可進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的鑒定。

六、轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代和建系:

將帶有外源基因(prss1基因)的小鼠(首建鼠)與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的小鼠交配、傳代；每只首建鼠都需要獨(dú)立進(jìn)行傳代。對出生的f1小鼠進(jìn)行鑒定(同步驟五)，能正常生殖系傳遞的f0，其后代有50％機(jī)率帶有整合的目的基因?？蓪@得的f1陽性小鼠用于實(shí)驗(yàn)和繼續(xù)傳代。如果需要獲得純合子，可能來源相同的陽性f1進(jìn)行同胞交配，出生的f2代小鼠，會有25％的概率為純合子。將篩選出目的基因有表達(dá)的小鼠，建系穩(wěn)定的傳代，同時記錄傳代情況和譜系。由此得到prss1基因敲入小鼠，即人急性胰腺炎小鼠模型。

七、prss1基因敲入小鼠表型鑒定：

1、檢測prss1蛋白在人急性胰腺炎小鼠模型組織中的表達(dá)。如圖10所示，在野生型(wt，control)小鼠中，prss1幾乎無表達(dá)，而prss1基因敲入小鼠(transgene)prss1蛋白的表達(dá)量幾乎占正常人(human)的50％，說明該轉(zhuǎn)基因小鼠與人相比有可比性，可以用來模擬人急性胰腺炎的發(fā)病過程。

2、如圖11所示，圖11是prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素(cerulein)后(24h后)誘發(fā)急性胰腺炎(ap)表型及胰腺組織he染色圖片。與野生型小鼠相比，prss1小鼠注射cerulein后胰腺組織水腫明顯伴炎性細(xì)胞浸潤。

3、圖12是prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素(cerulein)后(24h后)，與野生型小鼠相比，prss1基因敲入小鼠注射雨蛙素24h后，胰腺淀粉酶、組織評分、組織水腫程度以及trypsin活性明顯升高。說明prss1可以很好的模擬出人急性胰腺炎的發(fā)病過程。

4、圖13是prss1基因敲入小鼠反復(fù)注射雨蛙素(cerulein)后(40min后)microsome酶的活性明顯升高，而zymogen及l(fā)ysome活性無明顯改變。這些改變在野生型小鼠中都無明顯改變。

5、圖14是prss1基因敲入小鼠反復(fù)注射雨蛙素(cerulein)后(4周后)誘發(fā)慢性胰腺炎(cp)表型及胰腺組織he及mason染色圖片。prss1基因敲入小鼠還可以很好地模擬慢性胰腺炎的發(fā)病過程，即反復(fù)發(fā)作的急性胰腺炎可以演變?yōu)槁砸认傺住?/p>

6、圖15野生型小鼠與prss1小鼠慢性胰腺炎相關(guān)指標(biāo)的對比?？梢悦黠@看出prss1小鼠在胰腺比重、組織評分、血糖方面在注射完雨蛙素后改變明顯。

綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建的prss1基因敲入小鼠(12-16周)注射雨蛙素24小時后，即可出現(xiàn)急性胰腺炎的表現(xiàn)；反復(fù)注射雨蛙素4周后可出現(xiàn)慢性胰腺炎的表現(xiàn)。迄今，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道、專利數(shù)據(jù)庫和包括世界最大的小鼠資源中心美國jackson研究所在內(nèi)的動物模型目錄中，均未見相關(guān)野生型prss1基因敲入小鼠的信息。因此，本發(fā)明的小鼠模型可廣泛用于人急、慢性胰腺炎的致病病因、病理機(jī)制等研究。

本發(fā)明所獲得的prss1小鼠通過表型驗(yàn)證，可廣泛用于人急性胰腺炎的致病病因、病理機(jī)制研究，以及對急性胰腺炎治療藥物的篩選和基因治療試驗(yàn)等。

除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。

序列表

<110>南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

<120>一種人急性胰腺炎小鼠模型的構(gòu)建方法

<160>1

<210>1

<211>36500

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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