本發(fā)明涉及醫(yī)藥實驗領(lǐng)域,尤其涉及一種干燥綜合征小鼠模型的造模方法。
背景技術(shù):
干燥綜合征(Sjogren Syndrome,SS)是一種以侵犯唾液腺和淚腺為主要特征的慢性炎癥性自身免疫病。干燥綜合征根據(jù)發(fā)病原因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。原發(fā)性干燥綜合征(primary Sjogren Syndrome,pSS)是一種全球性疾病,好發(fā)于女性和老年人,男女比例約為1:9~1:20??诟伞⒀鄹墒窃摬〉湫偷呐R床癥狀,部分患者還會出現(xiàn)間歇性腮腺炎和后期的猖獗性齲齒;此外包括其他不典型的腺外系統(tǒng)癥狀。
目前國內(nèi)外主要的干燥綜合征動物模型為鼠類,包括兩大類,即自發(fā)型和誘發(fā)型。自發(fā)型動物模型,主要有非肥胖型糖尿病(NOD,non-obese diabetic disease)小鼠、新西蘭黑鼠(NZB,New Zealand black)和新西蘭白鼠(NZW,New Zealand white)雜交F1代小鼠、MRL/lpr小鼠等。自發(fā)型動物模型的選擇一般繼發(fā)于一種彌漫性結(jié)締組織病,因其在發(fā)病前期或者發(fā)病過程都表現(xiàn)出與人類干燥綜合征相似的癥狀而被用于動物模型進(jìn)行研究。誘發(fā)型動物模型是一種主要在局部模擬人類干燥綜合征的方法,主要包括注射抗原、接種病毒或組織勻漿等。目前有用Balb/c小鼠頜下腺勻漿與弗氏完全佐劑混合制成的抗原注射入同種小鼠足墊和背部皮下,并且用百日咳疫苗背部皮下加強(qiáng)免疫,以及用C57BL/6小鼠頜下腺勻漿與弗氏完全佐劑或不完全佐劑混合制成的抗原注射入同種小鼠的背部皮下等。在誘發(fā)型動物模型中,利用涎腺組織勻漿免疫同種或異種小鼠是一種比較常見的模型的構(gòu)建方法。對于自發(fā)型動物模型雖其并發(fā)的許多器官受損與人類的干燥綜合征頗為相似,但其高成本、長周期、不易控制以及成模率較低使得實驗室的研究遇到諸多困難。而目前國內(nèi)外的幾種誘導(dǎo)的動物模型中存在不足,如用大鼠造模需要較高的經(jīng)濟(jì)成本,并且周期較長會導(dǎo)致大鼠的各組織器官功能漸退,從而影響了實驗的準(zhǔn)確性。此外,小鼠抗原誘導(dǎo)的途徑、劑量、時間、次數(shù)以及佐劑的選擇等均會影響模型的成功率。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種較為理想的干燥綜合征動物模型,相比其它模型有較高的成模率,易于掌握,給研究人類干燥綜合征提供更可靠的模型。
本發(fā)明中將C57BL/6小鼠的頜下腺勻漿與弗氏佐劑制成乳化劑,通過皮內(nèi)多點注射進(jìn)入同種小鼠的尾背部,介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng),使小鼠頜下腺產(chǎn)生淋巴細(xì)胞浸潤,干擾其免疫系統(tǒng)。皮內(nèi)多處注射的方式可以產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。抗原的注射分3次進(jìn)行,在第0天和第7天用弗氏完全佐劑調(diào)整抗原濃度,第14天用弗氏不完全佐劑平行操作,加強(qiáng)局部免疫應(yīng)答。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來達(dá)到目的:
一種干燥綜合征小鼠模型的造模方法,包括以下步驟:
步驟一,小鼠頜下腺抗原的制備:按需要取C57BL/6小鼠,脫頸椎處死,新潔爾滅消毒,無菌條件下取出雙側(cè)頜下腺,剝離包膜及結(jié)締組織,用PBS洗凈后放入無菌青霉素小瓶中,按照每個頜下腺加入0.5ml PBS的量,向無菌青霉素小瓶中加入PBS,將瓶內(nèi)的頜下腺剪碎,在冰浴中充分勻漿,3000r/15min/4℃的條件離心,棄去上層脂質(zhì),取上清液,采用BCA蛋白定量法定量頜下腺抗原濃度,用PBS將頜下腺抗原濃度調(diào)整至4mg/ml,加入等量FCA弗氏完全佐劑或FIA弗氏不完全佐劑,將小鼠頜下腺抗原濃度稀釋至2mg/ml,反復(fù)吹打直至兩液相互溶并呈乳白色狀,即制得注射用的2mg/ml小鼠頜下腺抗原;
步驟二,將C57BL/6小鼠隨機(jī)分組,保證各組的小鼠數(shù)量、體重、狀態(tài)盡可能地相近;用剪刀或電動剃須刀將小鼠尾背部的毛剃掉以備注射抗原,正常對照組小鼠不作處理;
步驟三,分別在第0天,第7天于小鼠的尾背部皮內(nèi)多點注射步驟一制備的FCA配制的2mg/ml小鼠頜下腺抗原,注射量為0.1ml/只;在第14天用同樣的方法注射等量的步驟一制備的FIA配制的頜下腺抗原;對照組小鼠用同樣的方法注射等量的生理鹽水;
步驟四,造模6周左右,檢測指標(biāo),篩選造模成功的小鼠。
優(yōu)選的,步驟一中的C57BL/6小鼠為8周齡的雌性C57BL/6小鼠。
優(yōu)選的,步驟四中的檢測指標(biāo)包括:
飲水量檢測:于造模前一周開始檢測,每周測一次;造模后飲水量開始逐漸上升;
小鼠狀態(tài)觀察:在造模后第3周前后開始,小鼠出現(xiàn)搔抓口唇、舔爪現(xiàn)象,隨后這種現(xiàn)象逐漸明顯。
唾液量檢測:在造模第5周進(jìn)行;在造模第5周及此后,模型組小鼠的唾液應(yīng)比正常組低,并且逐漸減少。
頜下腺組織病理學(xué)檢測:在第6周,分別從模型組和正常組中取出2~3只小鼠,處死,取頜下腺做病理檢查,用H&E染色法檢測,模型組頜下腺存在明顯的淋巴細(xì)胞浸潤、成灶,而正常組無明顯浸潤。
優(yōu)選的,所述唾液量檢測:方法是測量前小鼠腹腔注射2.4%的戊巴比妥鈉0.05ml,以呼吸平穩(wěn),眼角膜反射消失,四肢肌群松弛為麻醉標(biāo)準(zhǔn);完全麻醉后使小鼠處于頭低的稍稍傾斜狀態(tài),可以用取暖器給予溫度,腹腔注射0.025mg/mL毛果蕓香堿溶液0.1ml,5min后,將事先稱好的棉花小球塞入小鼠口中,10min后取出;用濕重法求出小鼠唾液重量。
優(yōu)選的,所述頜下腺組織病理學(xué)檢測,在第6周,分別從模型組和正常組中取出2~3只小鼠,處死,取頜下腺做病理檢查,用H&E染色法檢測,頜下腺的處理應(yīng)先放于10%的福爾馬林中浸泡24h后,依次進(jìn)行沖洗、脫水和透明、浸蠟、包埋、石蠟切片以及最終的H&E染色;模型組頜下腺存在明顯的淋巴細(xì)胞浸潤、成灶,而正常組無明顯浸潤。
本發(fā)明的優(yōu)點是:
(1)本發(fā)明的干燥綜合征小鼠模型的造模方法,注射方式為皮內(nèi)注射,因皮內(nèi)注射刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的應(yīng)答強(qiáng)于皮下注射及其他途徑。
(2)本發(fā)明的干燥綜合征小鼠模型的造模方法,以2mg/ml的濃度給予0.1ml/只較適宜,過高或過低易誘導(dǎo)免疫耐受。
(3)本發(fā)明的干燥綜合征小鼠模型的造模方法,注射抗原的次數(shù)和間隔適宜,頻繁注射可能引起小鼠生理和精神狀態(tài)低下,易于死亡。
(4)本發(fā)明的干燥綜合征小鼠模型的造模方法,8周齡的雌性C57BL/6小鼠為較理想的動物。
本發(fā)明的干燥綜合征小鼠模型的造模方法成模率高,造模時間短;理想的動物模型會給研究干燥綜合征提供更好的實驗方法。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
實施例
1頜下腺抗原的制備:
取4只C57BL/6小鼠,脫頸椎處死,置于新潔爾滅中消毒15min,在超凈臺里無菌取出雙側(cè)頜下腺,分離包膜及結(jié)締組織,用PBS洗凈后放入無菌青霉素小瓶中,向瓶中加入2ml PBS,用眼科剪將瓶中的頜下腺剪碎,在冰浴中用電動勻漿器充分勻漿,轉(zhuǎn)入EP管中離心,離心條件為3000r/15min/4℃,棄去上層脂質(zhì),取上清液,進(jìn)行BCA蛋白定量,用PBS將抗原濃度調(diào)整至4mg/ml,加入等量的弗氏完全佐劑(FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA),將抗原濃度稀釋至2mg/ml,反復(fù)吹打直至兩液相互溶并呈乳白色狀即可,若不及時注射,則可放于4℃冰箱保存?zhèn)溆?,使用前仍需反?fù)搖晃均勻。
2分組:
將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分組,保證各組的小鼠數(shù)量、體重、狀態(tài)盡可能地相近;用剪刀或電動剃須刀將小鼠尾背部的毛剃掉以備注射抗原,正常對照組小鼠可不作處理。
3抗原的注射:
分別在第0天,第7天于小鼠的尾背部皮內(nèi)多點注射FCA配制的頜下腺抗原0.1ml/只;在第14天用同樣的方法注射等量的FIA配制的頜下腺抗原。對照組小鼠不作處理或用同樣的方法注射等量的生理鹽水。
4模型的檢測指標(biāo)
4.1觀察:3次造模后,觀察小鼠的狀態(tài),約在第3周前后開始,小鼠出現(xiàn)搔抓口唇、舔爪現(xiàn)象,并且這種現(xiàn)象逐漸明顯;
4.2飲水量:從造模前開始測,每周測一次,造模后飲水量逐漸上升;
4.3唾液量:約在造模第5周進(jìn)行。方法是測量前小鼠腹腔注射2.4%的戊巴比妥鈉0.05ml,以呼吸平穩(wěn),眼角膜反射消失,四肢肌群松弛為麻醉標(biāo)準(zhǔn)。完全麻醉后使小鼠處于頭低的稍稍傾斜狀態(tài),需要時用取暖器給予溫度,腹腔注射0.025mg/mL毛果蕓香堿溶液0.1ml,5min后,將事先稱好的棉花小球置入小鼠口中,10min后取出。用濕重法求出小鼠唾液重量。在造模第5周及此后,模型組小鼠的唾液量比正常組低,并且逐漸減少;
4.4頜下腺組織病理學(xué)檢測:
在第6周,分別從模型組和正常組中取出2~3只小鼠,處死,取頜下腺做病理檢查(H&E染色)。頜下腺的處理應(yīng)先放于10%的福爾馬林中浸泡24h后,依次進(jìn)行沖洗、脫水和透明、浸蠟、包埋、石蠟切片以及最終的H&E染色。模型組頜下腺存在明顯的淋巴細(xì)胞浸潤,成灶,并且正常組無浸潤或存在輕度浸潤。
頜下腺Chisholm和Mason評判標(biāo)準(zhǔn)分級
注:一個淋巴細(xì)胞浸潤灶是指有50個或更多的淋巴細(xì)胞
5.造模完成
造模6周左右,根據(jù)造模組小鼠的唾液量和頜下腺組織病理學(xué)評分分級判斷造模是否成功;將造模組的小鼠唾液量與對照組小鼠唾液量對比,造模組的小鼠唾液量明顯減少的,且頜下腺組織病理學(xué)評分Ⅱ級以上判斷為造模成功的小鼠。