專利名稱：：Prrsv和pcv2共感染小鼠疾病模型的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及非豬的豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環(huán)2型疾病動物模型的構建方法，該構建方法的特征在f，在經濟常用的實驗動物中，通過特定方法促使小鼠產生典型病變，并采用不同方法檢測疾病模型的成功構建，為進--歩的臨床和藥理實驗研究奠定基礎o
背景技術：
：1病原簡介豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)又稱豬繁殖與呼吸綜合征，豬藍耳病，迄今為止，藍耳病仍然是當今養(yǎng)豬業(yè)危害最大的疾病之一。藍耳病的危害不僅表現(xiàn)在疾病本身對豬造成的損傷引起的經濟損失，I-I'l]且還因為藍耳病病毒是豬的主要鑰匙病原，因1-I'l]很多其它病原(:pcv2、鏈球菌、a:p:p和副豬嗜血桿菌等)因為感染藍耳病而發(fā)牛嚴重的繼發(fā)或混合感染，導致很卨的死亡率和持續(xù)的經濟損失。本病主要引起母豬繁殖障礙，仃豬肺炎和斷奶前后仔豬的死亡率增高，自1987年在美國，1990年在歐洲彼發(fā)現(xiàn)后傳播蔓延速度--卜分驚人，病毒分離和血清檢査表明，PRRS現(xiàn)已傳遍世界主要養(yǎng)MW家1995年，我國在北京郊區(qū)首次暴發(fā)了:PRRS，1996年以來，國內---------些單位進行的流行病學和血清學調杳證明，我國大部分省市都已有此病，且血清陽性率都很高，但呈地力'性流行特征。特別是2002年大:丫|-全國一片藍的趨勢。針對PRRS的現(xiàn)狀，各國都已引起高度重視，近年來在流行病學，免疫學及致病機理，實驗室診斷技術，綜合防制等方面開展了大量的調査研究工作，prrs的診斷與防制尤其成為當前獸醫(yī)研究的一個熱點。豬斷奶后衰竭綜合征(PMWS)的主要病原體，已被世界各閨學者確認為圓環(huán)病毒(:PCV2)本病最早發(fā)現(xiàn)丁'加拿大(1991)，1996年暴發(fā)該病，M吋此病很快在美國、西班牙、英國、丹麥、德國、荷^、比利時、立陶宛、奧地利和意大利發(fā)生。除k述國家外，近年來，閂本、韓國、泰國、捷克、墨西哥、匈牙利、中國以及臺灣地區(qū)均有此病發(fā)生和流行，另外PCV2與許多豬相關疾病的發(fā)生有關。除PMWS之外，PDNS(豬皮炎與腎炎綜合征)、PNP(增生性壞死性肺炎)、PRDC(豬叮吸m、fCii:)、繁敏l玲碼、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關聯(lián)。PCV2^其相關収的^的疾lrt已在全世界范閨內發(fā)牛和流行，死亡率i0-30%不等。較嚴重的地卜，豬場汁爭發(fā)本病吋死淘率高達4()%左右，其危害和造成的重大經濟損失顯而易見，現(xiàn)已被世界各閨的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認為本病是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的重耍的豬傳染病。用PRRSV和PCV2作實驗性共同感染，在實驗豬的肺內發(fā)現(xiàn)的PCV2核酸或抗原量比單獨:PCV2感染要多。用:PRRSV/PCV2共同感染的實地病例的肺作免疫組織化學檢驗時一致顯現(xiàn)PCV2抗原，證實了PRRSV誘發(fā)PCV2增殖增加的實驗觀察。有力地證實PCV2在PRDC中的重要作用和加劇了PRRSV和PCV2共同感染的病癥。在PMWS感染豬中，PCV2和PRRSV共同感染的比例很高，在美國高達20-60%。德國學者VE.Ohlinger等對432個:PM:WS樣品的檢査結果表明PCV2與:PR.RS共同感染率高達375.9%。淋巴細胞缺失和淋巴組織的巨噬細胞浸潤，是PMWS病豬的獨特性病理損害和基本特征。2病原檢測技術2,1病毒分離:PR:RSV可以在豬肺泡巨噬細胞(porcinealveolarmacrophages,PAM)、特定的非洲綠猴腎細胞(Marc-145、CL2621等細胞)k復制，然而不是每種細胞系都適合PRRSV的生長，這也就是說，如果可能的話，需要用至少2種細胞系來進行病毒特定的分離培養(yǎng)。但分離歐洲株PRRSV只能用MM細胞。PRRSV可以在多種臨床樣品屮分離得到，其中包括血清、血漿、外周血單核細胞、骨髓、扁桃腺、肺、淋巴結、脾、胸腺、心、腦、肝、睪丸和精液等，其中血清和肺灌洗液最適合病毒分離。PRRSV在血清中存在比組織中穩(wěn)定，而老齡動物由于病毒血癥的時間短，則病毒在組織中存在的時間長。組織必須及時送檢才能保證病毒分離的成功。樣品的選擇同時也要根據感染的階段(急性感染期、康復期和持續(xù)感染期)，在急性感染期，選擇血清、肺、肺灌洗液作為樣品比較好，而持續(xù)感染的動物則選擇口、鼻棉拭及肺灌洗液較好。對于遲發(fā)性流產和早產的病例，樣品選擇弱胎或哺乳仔豬要比木乃伊胎和流產胎兒好。雖然弱胎很可能有病毒血癥，但其存在高滴度的母源抗體對病毒的分離有千擾作用。2,2病毒抗原的檢測冷凍組織切片熒光抗體檢測和免疫組化nj以在組織中檢測病力機fe，這兩種方法的特異性很高，但相對來說敏感性不夠。組織樣品最好采集肺臟、脾臟、淋巴結、胸腺及扁桃體。冷凍切片直接或間接免疫熒光成本較低并且快速，樣品的質量對冷凍組織切片熒光抗體檢測的結果影響很大，組織應該取自最近死—C:的動物而k貨迅速冷凍。相比較而由-，免疫組化法可以檢測在福爾馬林中保存的組織病毒，但費時費力。免疫組化法的敏感性比免疫熒光要高，但檢測費用也相對較高。鑒別診斷可以根據檢查PRRSV微觀病變特征并與免疫組化法或免疫熒光配合檢測。2.3病毒RNA的檢測反轉錄聚合酉每鏈反應(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT畫PCR)已經用于臨床樣品的檢測。由于病毒不需要經細胞培養(yǎng)，而是檢測病毒R:NA，所以RT-PCR技術比病毒分離大大節(jié)省了時間，而且有著較a的特異性和敏感性，此項技術已廣泛應用TPRRSV的鑒定和臨床診斷，并在方法上不斷改進和提高。RT-:PCR技術擴增的目的片段主要是針對PRRSV的N蛋白基岡，原岡是PRRSV基岡組巾ORF7編碼的核衣殼蛋白(N蛋白)中包括所有毒株保守的共同表位和區(qū)別于歐洲型的特異性表位。另外，還可針對病毒某因組的ORF6或ORF1,目前針對ORF1編碼的病毒非結構蛋白2(Nsp2)的基因序列是否缺失，可以從臨床采集的樣品中區(qū)分是弱毒株感染還是高致病性的變異毒株感染所引起。精液、糞便等樣品用傳統(tǒng)方法不易檢測，這樣用RT-PCR的方法就非常有效，而目.它還可以用于胎兒組織和腹水等低含毒量樣品的檢測。近年發(fā)展起來的實時熒光定量PCR檢測技術與傳統(tǒng)診斷方法比較具有很多突出的優(yōu)點，如引物與探針可以大#合成并長期保存，檢測速度快(僅需2h4'h)，結果準確，不易污染，敏感性更高(比常規(guī)RT-PCR高10()倍)，可以區(qū)分不同的毒株亞型。在PRRSV的早期檢測、預防控制、出入境檢疫及基礎研究中發(fā)揮著重要作用。套式:RT-:PCR技術也可以增強檢測的敏感性，4可以區(qū)分美洲型和歐洲型prrsv。但以上兩種檢測技術需要更高的成本，在實用性方面不利f推廣。根據樣品的性質、樣品采集、實驗室技術水平及檢測技術的差異，不同實驗室RT-PCR技術的應用也會有所不同。因此，每個實驗室要根據自身的條件和技術水平，建立起有自己特點RI^PCR的檢測技術。應用核酸探針原位雜交技術和基因芯片技術檢測PRRSV的R:NA也I.....I趨成熟，ChuchL制備了地高辛探針，成功建立了敏感熒光原位雜交技術，結果PRRSV核酸在巨噬細胞內明顯可見，故認為該法對PRRSV常規(guī)臨床診斷及病毒持續(xù)性感染研究有重要意義。高淑霞等報道將PRRSV、豬瘟I內tY、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的保守序列構建重組質粒制備探針，力將各探針按-一定的陣列點加到硝酸纖維膜上并加以固定，制備低密度基因芯片。與RI^PCR方法相比，顯不了較高的靈敏度。該方法的建立，為大批量快速診斷、普査豬病毒性繁殖障礙性疾病提供了有效的鑒別診斷手段，但鑒于成本因素，與實際應用還有一定的距離。3:PRRSV血清抗體檢測PRRSV特異性抗體的診斷方法主要有間接免疫熒光(indirectfluorescenceassay,IFA)、免疫過氧化物酶單層細胞試驗(immunoperoxidasemonolayerassay,I:P:M:A)、酶聯(lián)免疫吸附'試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、病毒屮禾卩試驗(serumvirusneutralization,SVN)和乳膠凝集試驗(latexagglutinationtest,LAT)。其中IFA、SVN和ELISA在美洲診斷實驗室應用較多，rfl]歐洲主要用IPMA檢測PRRSV抗體。血清學試驗的結果受到檢測用分離病毒與感染豬病毒相關性的影響。3.1間接免疫熒光試驗間接免疫熒光試驗(IFA)特異性可達99X，敏感性不是很清楚。IM可以確定抗體的滴度。參照試驗起始時血清的稀釋度，抗體滴度達到16或20的可以判為陽性。在動物感染后2月3月I::FA檢測的結果比較可靠。在試驗感染條件下，通過IFA方法可在感染后5d9d檢測到抗體，抗體在3()d5()d出現(xiàn)高峰，隨后抗體滴度逐漸....F降，在感染后4個5個月消失。3.2免疫過氧化物酶單層細胞試驗i::pm:a具各高特異性和敏感性，其敏感性要比eli:sa高。ipma經常用于感染后7d15dPRRSV的檢測。與IFA—樣，IPMA同樣在感染后2個3個月檢測比較可靠。這種T1991年建立的PRRSV血淸抗體檢測法，至今仍是歐美國家廣泛使用的血清學診斷方法。IPMA在PRRSV感染后9dlld可檢測到抗體，在35d5()d抗體水平達到高峰，在感染后11個12個月抗體消失。譚斌等建立-一種檢測PRRSV血清抗體的IPMA，并組裝成PRRSVIPMA抗體檢測試劑盒，檢測臨床屮的血清樣本，與IDEXXELISA試劑盒的符合率為83.3%。3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA同樣也有著很好的特異性和敏感性，對于早期抗休的檢測比用IPMA更為敏感。ELISA檢測方法有多種形式，即間接ELISA、捕捉ELISA、阻斷ELISA、夾心ELISA等。美國I::D:EXX公司的商品化ELISA試劑盒檢測的特異性能達到98%99%，現(xiàn)在又推出檢測性能更好的第2代產品。商品化的試劑盒有高度的一致性，自動化程度高等特點，現(xiàn)己成為國際上血清學檢測的主要標準，許多新建血清學檢測方法都與此為標準檢測符"t的可以同時檢測出美洲型和歐洲型，而且快速簡便。SVN也線f!W度Tj異性，但其敏感性不如ELISA。其低的敏感|斗+要由于中和抗體要在敏感后1個2個月后才能產生。SVN只能說是一種較好的研究/j法，它非常費時費力，不適用T1...i常的PRRSV的診斷，但在所有血淸學檢測方法中，此法是評價豬群的免疫保護水平的惟一客觀可信的方法。有研究表明，當豬群巾巾和抗體的平均水平人于l:24才能免受:PRRSV的攻擊，否則將促進病毒在豬群中的增殖和擴散。3.5乳膠凝集試驗王忠田等利用純化的PRRSV重組M蛋O致毒乳膠制成乳膠抗原，成功地將LAT用fPRRSV血清抗體的檢測，具有良好的特異性。用LAT與IDEXX公司抗體檢測試劑盒同時對76份豬血淸樣本進行檢領U，結果表明LAT的特異性和敏感性均為95X，與IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒的總符合率為87%，檢出率基本一致。因LAT具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強、價格低廉且可用T現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，故是-,中適合基層獸醫(yī)申.位檢測PRRSV血清抗體的新方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的主要是采用經濟常用的小鼠為實驗動物，通過特殊方法建模，并采用多種檢測方法確證疾病模型的制備。i實驗器材1.1主要試劑病毒基因組:DNA/R:NA提取試劑購自TIANGEN公司，PCR檢測試劑購自Takara公司。PRRSV和PCV2抗體快速檢測試劑盒，購自深圳綠詩源生物技術有限公司。1.2毒株和實驗動物PCV2和PRRSV為本實驗室保存毒株，TCID5。=106/mL。Marc-145、PK-15細胞，購自于中國獸藥監(jiān)察所。清潔級6周齡昆明小鼠，購自f中國軍事醫(yī)學科學院獸醫(yī)研究所實驗動物中心[SCXK-(軍)2007-004]。1.3主要實驗儀器(l)ABI:Mx3005p定量:PCR儀(2)Bio-rad680酶標儀(3)EG1150組織包埋機(4)萊卡2135切片機2實驗設計將昆明小鼠27只隨機分為3組對照組12只，第ld接種細胞培養(yǎng)液，接種途徑和接種劑量分別為腹腔注射0.5mL、肌肉注射0.2mL、背部皮下多點注射0.3mL。一次攻毒組12只，第ld接種PRRSV和PCV2，接種途徑和接種劑y:同對照組。連續(xù)攻毒組3只，第丄、7、丄4、2丄、28、35d分別接種PRRSV和:PCV2，毎次接種途徑及接種劑量均與對照組相同。攻毒后第7、14、21和28d分別從對照組和一次攻毒組中隨機選擇3只小鼠采血并處死，連續(xù)攻毒組在攻毒后第35d采血處死。2.1體重測量實驗小鼠分別于第l、7、14、21、28、35d測量體重，釆用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，進行方差分析和t檢驗。2.2病理學檢測脫頸椎處死小鼠后進行剖檢。無菌采集腫、肝、脾、腹股溝淋巴結，用于PCR檢測和病理組織學檢測。臟器標本用福爾馬林溶液固定，HE染色，鏡下觀察。2.3PCR檢澳U首先，分別針對PCV2ORF2和PRRSVORF7序列，利用primer5.0軟件設計引物(見表1)。然后，從攻毒各時間組凍存組織中提取總RNA和DNA，釆用RT-PCR和熒光定量PCR方法進行定性及定量分析。最后，取PCR產物于1.5X瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。表1擴增PRRSV、PCV2和看家基因片段的引物和PCR條件擴增基因Genbank登陸號引物序列(5'—3')產物(bp)退火溫度。CP欣SVAY262352Fo醒rd:CMATMCMCGGCAAGCAGReverse:AMCTCCACAGCGTMCTTATC30855PCV2AF538325Forward:AGTGAGCGGGAAMTGC溫Reverse:TCCTCCGTGGATTGTTCTGT41755P-actinNM007393Forward:TGCTGTCCCTGTATGCCTCTReverse:GGTCTTTACGGATGTCMCG46256血清樣品按i:2()稀2.4抗體檢測試驗小鼠采用眼球摘除法取血，分離血清檢測抗體效價，釋，按照PRRSV和:PCV2抗體快速檢測試劑盒中操作進行檢測。3結果與分析3.1體重增長比率各組之間在l，7，14，21，28，35d的體重增K速率差異明顯，正常對照組(C組)增長最快，--次攻毒組(A組)次之，連續(xù)攻毒組(B組)最低，A組、B組與C組差異顯著(P<說明PRRSV和PCV2對小鼠增重存在抑制作用。(表2)表2各組體重變化(x±s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與l下:常對照組比較，*P<().01。3,2病理學觀察連續(xù)攻毒組能夠觀察到nj見的臨床癥狀和病理變化，主要表現(xiàn)為消瘦、淋巴結腫大，其他組實驗小鼠沒有產牛肉眼可見的臨床癥狀和病理變化。腫臟攻毒7d后，有漿液性滲出，淺色染色。攻毒14d、21d后，肺泡里有紅細胞、巨噬細胞滲出，胞漿淡紅色。攻毒28d、35d后，肺泡中紅細胞、巨噬細胞，漿液性滲出更明.M。腹股溝淋巴結攻毒7d、14d后，淋巴細胞壞死增多。攻毒21d、28d、35d后，淋巴細胞數減少，細胞內出現(xiàn)空泡，漿液。肝臟攻毒7d、14d后，肝臟表面有局灶性壞死。21d、28d、35d肝細胞屮有空泡，脂肪變性，核溶解，部分肝細胞壞死(只有胞質，無核)，肝動脈有淤血。脾臟攻毒7d、14d后，在O髓中出現(xiàn)淋巴細胞的壞死。攻毒21d、28d、35d后，白髓區(qū)淋巴細胞壞死較多，被膜分散性出血。(見附圖1-4)3.3PCR檢測對照組小鼠體內未檢出PRRSV和PCV2。一次攻毒組小鼠在肝、脾、月市、淋巴結中發(fā)現(xiàn)了病毒復制并呈現(xiàn)-一定的規(guī)律性。病毒進入機休后，首先在肝臟中復制，隨后呈現(xiàn)l()d的全身病毒血癥，7-l()d后轉歸為局部的病灶血癥(主要存在于淋巴結)，而淋巴結的病灶血癥可以持續(xù)至35d以后，全身病毒血癥W部器官病灶增重抑制免疫抑制?？梢娫诠ザ竞?，病毒在k述組織中均有發(fā)現(xiàn)，但最后的轉歸都是淋巴結。連續(xù)攻毒組在第35d進行剖殺，剖檢發(fā)現(xiàn)僅淋巴結內存在病毒復制，此結果進--步證實了-一次攻毒組的結論PRRSV和PCV2共感染的最終結果是病毒在淋巴結的集屮復制，從而對整個機體的免疫系統(tǒng)造成嚴重破壞，使機體更易受其他致病因子的感染。(見附圖5、6、7)3/1抗體檢測所有攻毒小鼠抗休檢測均呈陽性(00值>0.4)，連續(xù)攻毒組抗休水平明顯高于一次攻毒組。(見附圖8、9)圖1值；圖3圖5圖7本發(fā)明的肺臟切片圖；圖2:本發(fā)明的淋巴結切片圖；本發(fā)明的肝臟切片圖；圖4:本發(fā)明的脾臟切片本發(fā)明的PCR鑒定圖；圖6:本發(fā)明的一次攻毒組PRRSV病毒載量；本發(fā)明的一次攻*組PCV2病辨載量；圖8:本發(fā)明的PRRSV抗體OD圖9:本發(fā)明的PCV2抗體OD值.具體實施例方式1PCV2、PRRSV的繁殖(1.)PCV2的繁殖當培養(yǎng)瓶中PK15細胞呈40%50%融合狀態(tài)時，加入病毒液1mL/瓶，吸附lh,吸棄病錄液，用PBS洗滌2次，加入新的10%的MEM培養(yǎng)基，在37°C5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等細胞長滿瓶底時，傳代培養(yǎng)，每代細胞收集-一瓶，用于檢測細胞的增殖情況，做D-氨基葡萄糖處理組作對照。(2)PRRSV的繁殖當培養(yǎng)瓶中Marc-145細胞呈50%60%融合狀態(tài)時，加入病毒液lmL/瓶，吸附lh，吸棄病毒液，用PBS洗滌2次，加入新的10X的MEM培養(yǎng)基，在37。C5XC02的培養(yǎng)箱屮培養(yǎng)，等細胞長滿瓶底時收集，-80t:凍存?zhèn)?1J。2病理切片的制備(—)切片的制作(i)取材與固定切取組織時應使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時，從刀的根部開始向后拉動切開組織。組織塊的厚度約為().2().3cm，大小為1.5cmxl.5cmx().3cm為宜。取好的組織塊用10%福爾馬林溶液固定24481!。然后取固定好的組織，在流水--R巾洗lh后，進行梯度脫水50%酒精，lh;70%酒精，lh;80%酒精，lh;90%酒精，30min;無水乙醇8I，30min;無水乙醇H，20min;二甲苯無水乙醇(l:1),20min。(2)包埋經梯度乙醇脫水后再依次用二甲苯I,20min;二甲苯II，2()min透明，然后順序放入溶融的石蠟I、石蠟II、石蠟III中浸透每次ih，共3次；再包埋。(3)切片包埋好的石蠟塊即可進行切片；切片的厚度為5lim左右。(二)蘇木精-伊紅(hematoxylinandeosin，HE)染色方法(l.)脫蠟。主要用二甲苯脫蠟。依次用二甲苯I，l()min;二甲苯II，5min;二甲苯無水乙醇(l:1)，5min。(2)梯度乙醇水化。無水乙醇I，5min;無水乙醇II，4min;95%酒精，4min;90%酒精，4min;80%酒精，4min;70%酒精，4mm;50%酒精，4min。(3)蘇木精染色。水化后的切片放入蘇木精染液中浸lmin，染細胞核。自來水沖洗imin。(4)1%鹽酸乙醇分化3()s。自來水沖洗1h。(6)伊紅染色。充分水化后的切片直接入伊紅染色液中，染細胞質lmin左右。(7)梯度乙醇脫水。7()%酒精，2min;8()%酒精，2min;9()%酒精，2min;無水乙醇L2min;無水乙醇II，2mm;二甲苯無水乙醇(l:1)，2min。(8)二甲苯透明。二甲苯I，5min;二甲苯II，5min。(9)中性樹膠封片。3組織總RNA的提取將凍存組織從液氮罐中取出，在已經i8(TC處理過的研缽中，加液氮研磨至粉未狀，加入TRIzolReagent5()-1()()mg/ml組織，繼續(xù)研磨成勻漿，再轉移到組織研磨器中研磨，充分混勻后，室溫5min;加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫5min，4"C12000r/min離心15min，吸取l:層水相；加入等體積異丙醇，—2()。C靜置1..5h，4°C12()()()r/min離心10mfn;小心傾棄上清，加入75%乙醇1m:L，4°C7500r/min離心5min漂洗后，棄上清，室溫風千15min,用40uLDEPC水溶解備用。最后，進行RNA純度與濃度檢測，提取的樣品OD26。/OD28。吸光度比值均在1.82.0之間，表明RNA純度較高，蛋O質及酚去除比較'I:凈，濃度在().5-1.2pg/ii1之間。4總RNA反轉錄(reversetranscriptiomRT)反應參照AMV禽源反轉錄酶使用說明書，cDNA合成方法具體為取適量總RNA，加入01igo(dT)18，7(TC作用5min后，冰浴5min，補加5X反轉錄緩沖液、反轉錄酶、RNasin禾ndNTPs至2()pL，室溫反轉錄5min后，50°Clh，72°Cl()min。具體反應體系如下反轉錄反應總體系為20uL5XRT'buffer10mmol/LdNTPs0.33ug/uL01igo(dT)18丄u:Lamv反轉錄酶(1()u/pl)ip:lRNasin(30U/'u:l)iu:l總rna5組織總DNA的提取9將凍存組織從液氮罐中取出，在己經180t;處理過的研缽中，加液氮研磨至粉末狀，加入等體積的組織裂解液及IOUL的蛋白酶K(10mg/mL),50。C消化2h,4"1200()r/min離心iOmin;取上淸，加入等休積的Tris飽和酚，充分振蕩，i2000r/min離心l()min;上層水相加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)，混勻后，12()()()r/min離心10min;取上^水相加入2倍體積預冷的無水乙醇和1/10體積的3mol/:L醋酸鈉，在-20。C放置1h2h，12000r/min4。C離心15min;小心傾棄i:清，沉淀用70%乙醇1mL于4。C8500r/mfn離心5mfn漂洗后，傾棄上清，室溫風干15min，用40uL含R:NaseA(終濃度為20ug/mL)的TE緩沖液溶解備用。6PCV2、PRRSV和actin基因片段的擴增PCR的反應體系如卜'2XPCRmix25u:L25pmol/uL上、下游引物各0,5PLcD畫DNA3.75u:L加三蒸水至50PL反應程序如下94.°C5min(預變性)；94。C30s，55°C-56°C30s，72°C30s，共35個循環(huán);72°Cl()min(延伸)。反應結束后，取2.5u:L擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證產物是否與預期大小相符。7:PRRSV、PCV2熒光定量PCR標準曲線的建立與病毒載量的確定[cnos](1)目的岡子質粒的提取純化PCR產物并從凝膠中切下來，用TIANGEN公司膠回收試劑盒回收產物，1UL產物與1uLT3載體輕輕混合，室溫反應5min，反應結束立刻將離心管置于冰上。取-8(TC凍存的感受態(tài)細胞置冰浴中融化后，吸取連接物加入到50uL的感受態(tài)細胞中；輕彈離心管壁混勻，冰浴25min;42'C水浴中熱激3()s，快速將離心管轉移至冰浴中2min;加入250uL:L:B液休培養(yǎng)基(Amp-)37°C丄50r/min振蕩培養(yǎng)60min;吸取200uL菌液涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG平板....匕，待表面吸千后，37。C倒置平板培養(yǎng)過夜(1216h)，觀察菌落生長情況，根據藍白斑篩選重組轉化體。最后，取lml菌液送上海生工進行測序，取5ml茼液用TIANGEN公司質粒小提試劑盒提取菌液質粒。提取后的質粒進行濃度與純度鑒定，0:026。/0028。吸光度比值均在1.82.0之間，表明質粒純度較高，蛋白質及酚去除比較千凈，濃度在2-4ug/ml之間。并根據濃度值，計算質?？截悢?。拷貝數/ul=6,02*1023(copies/mol)/MW(g/mol)*質粒濃度(g/ul)。(2)目的因了質粒模板l()倍梯度稀釋，和各時間點樣品模板，分別進行熒光定S:PCR，休系如下2*qPC:RMixl()ul:Primerl(5uM〕lulPrimer2(5uM)lulTemplate<0,2ug10Rox0,2ulddH20補至2()ul反應程序如下94°C5min;94。C30s，55。C30s，72。C30s，共40個循環(huán)；融解曲線分析如下65°C-95°C，每0,2。C讀板1次，1s/次。反應結束后，取2uL擴增產物與0.5uL6氣oudingBuffbr混勻后，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證產物是否與預期大小相符。(3)分析結果根辨惡'-脊^量PCR儀輸出的標準曲線公式，由樣品的CT值，訃算樣品中的病毒拷貝數(即l)。8:PRRSV和PCV2抗體檢測步驟(l.)取預包被的微孔板，用樣品稀釋液將待檢樣品40倍稀釋后加入板空中，每孔加100liL。并且3倍稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照各設2L，每孔100liL。另設一空白對照孔，空白對照孔加l()()PL稀釋液。輕輕振勻孔屮樣品(勿溢出)，置37t:溫育30分鐘。(2)甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，300liL/孔，每次靜置3分鐘倒掉，最后-一次在不掉屑干凈吸水紙上拍干。(3)每孔加酶標二抗(抗小鼠IgG-HRP結合物)1()()UL,置37°C溫育60分鐘(:PCV2檢測是30分鐘)。(4)洗滌3次，方法同2。(5)每孔加底物A、B液各1滴(50uL)，混勻，室溫避光顯色10分鐘。(6)每孔加終止液l滴(50uL)，l()分鐘內測定結果。PRRSV檢測結果判定標準以空白孔調零，在酶標儀上測各孔0063。值。試驗成立的條件是陽性對照孔平均OD63。值大于或等于0.6，陰性對照孔平均OD63。值必須小于O.i。樣品OD63。值大于().32，判為陽性；樣品OD③值小于().32,判為陰性。:PCV2檢測結果判定標準1.肉眼判定"++++"深藍色，液體不透光；"+++"藍色，液體微透光；"++"中度藍色，液體透光；"+"淺藍色，液體透明；"無色，液體完全透明。以顯色"++"以上判為陽性。2.酶標儀判定以空白孔調零，在酶標儀上測各孔0063。值。試驗成立的條件是陽性對照孔平均0063。值大于或等于0.6，陰性對照孔平均0063。值必須小于0.2。樣品0063。值大于0.42，判為陽性；樣品0063。值在0.38到0.42之間，判為可疑樣品O:D630值小于().:詔，判為陰性。引物序列表<1.10>北京農學院<120>:PRRSV和PCV2共感染小鼠疾病模型<16()>6<i70>PatentI:nVersion3.3<2.1()>1<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220><22l>misc—feature<222>(1)...(20)<400>丄c咖HcMcggcaagc3g<210>2<211>22<212>:DNA<213>人工序列(Artificial)<220><22l>misc—feature<222>(丄)...(22)<4()()>2驢actccacagcgteactt站c<21()>3<211>20<213>人丁.序列(Artificial)<22丄>miisc—feature<400>3agtgagcgggaaaatgcaga<210>4<211>2()<210>5<211>20<2i2>DNA<213>人工序列(Artificial)<220><221>misc—feature<222>(1)..,(20)<4()()>5tgctgtccctgtatgcctct<21()>6<2丄丄>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<22()><22l>misc—feature<222>(1)...(2("。4.權利要求3所述的小鼠，其特征在于，所述的小鼠能夠感染PRRSV和PCV2兩種病毒，而PRRSV禾UPCV2兩種病毒分別用Marc-145、PK-15細胞培養(yǎng)。5.四種能夠檢測小鼠感染PRRSV和PCV2的指標，它包括(1)體重變化測量(2)病理切片檢測(3)PCR檢測(4)ELISA抗休檢測。6.權利要求6所述的病理切片檢測，其特征在于，所檢測的組織包括肺臟、淋巴結、肝臟、脾臟。7.權利要求5或6所述的一種PRRSV和PCV2共感染小鼠疾病模型的建立，其步驟包括1)培養(yǎng)Marc-145、PK-15細胞；2)分別擴繁PRRSV和PCV2兩種病毒；3)給小鼠多途徑分組接種PRRSV和PCV2細胞培養(yǎng)毒；4)攻毒甜后稱重記錄，并做統(tǒng)計學分析；5)采所檢測組織和血清，制作石蠟切片和ELISA抗體檢測；6)提取凍存檢測組織的R:NA,進行熒光定量PCR檢測。8.權利要求7所述的方法，在權利要求3所述的小鼠k建立共感染PRRSV和PCV2疾病模型能夠成功。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于獸醫(yī)傳染病學、病理學和藥理學研究領域，涉及非豬的豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環(huán)2型疾病模型動物的構建方法。本發(fā)明的特征在于，在經濟常用的實驗動物中，通過特定攻毒方法促使小鼠產生典型病變，并采用體重稱量、病理切片制作、PCR檢測和ELISA抗體檢測方法來證實該疾病模型的成功構建，將為這兩種病毒共感染相關體內實驗研究做了進一步的鋪墊，以及為藥理實驗研究奠定一定的基礎。本發(fā)明的疾病模型穩(wěn)定性高、操作簡便、廣泛實用。由于豬體試驗周期長、費用高、陰性豬難于篩選，更重要的是在豬體本身并不能復制該病，因此，建立完善的小型動物感染模型，對疫苗免疫效果評價和病毒致病機理的研究都十分必要。文檔編號A61K35/76GK101690736SQ20091016967公開日2010年4月7日申請日期2009年8月31日優(yōu)先權日2009年8月31日發(fā)明者吳國娟,張中文,楊明,郭瑋,馬元元申請人:北京農學院