本申請(qǐng)要求2010年5月21日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/347,136號(hào)及2009年7月27日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/228,828號(hào)的權(quán)益，全部申請(qǐng)以全文引用的方式并入本文中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的材料和方法。

背景技術(shù)：

治療性多肽例如凝血蛋白(包括因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威利布蘭德因子(Von Willebrand Factor，VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶)，會(huì)被蛋白水解酶快速降解并被抗體中和。這會(huì)縮短其半衰期及循環(huán)時(shí)間，從而限制其治療效果。必需相對(duì)較高劑量及頻繁施用來達(dá)到并維持這些凝血蛋白的期望治療或預(yù)防效果。因此，難以實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膭┝空{(diào)節(jié)，且對(duì)頻繁靜脈內(nèi)施用的需要給患者的生活方式造成限制。

多肽藥物的聚乙二醇化在循環(huán)中對(duì)所述藥物進(jìn)行保護(hù)，且改善其藥效學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)特性(Harris和Chess，Nat Rev Drug Discov.2003：2:214-21)。聚乙二醇化過程使乙二醇重復(fù)單元(聚乙二醇(PEG))連接至多肽藥物。PEG分子具有大流體動(dòng)力學(xué)體積(球狀蛋白大小的5-10倍)，具有高度水溶性且為水合的、無毒性、非免疫原性的，并快速自身體內(nèi)清除。分子的聚乙二醇化可增強(qiáng)藥物對(duì)酶促降解的抗性，增加體內(nèi)半衰期、減少給藥頻率、降低免疫原性、增強(qiáng)物理及熱穩(wěn)定性、增強(qiáng)溶解性、增強(qiáng)液體穩(wěn)定性及減少聚集。第一種聚乙二醇化藥物在20世紀(jì)90年代早期獲得FDA批準(zhǔn)。此后，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了數(shù)種聚乙二醇化藥物用于口服、注射及局部施用。

聚唾液酸(PSA)(也稱為多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸(colominic acid，CA))為天然存在的多糖。其為含α(2→8)酮苷鍵合的N-乙?；窠?jīng)氨糖酸的同聚物且在其非還原末端含有鄰二醇基團(tuán)。其帶負(fù)電且為人體的天然組成部分。其可容易地由細(xì)菌以大量及預(yù)定生理特征制造(美國專利第5,846,951號(hào))。因?yàn)榧?xì)菌產(chǎn)生的PSA在化學(xué)及免疫方面與人體所產(chǎn)生的PSA相同，所以細(xì)菌PSA即使與蛋白質(zhì)偶聯(lián)也是非免疫原性的。不同于某些聚合物，聚唾液酸為生物可降解的。多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸與過氧化氫酶及天門冬酰胺酶的共價(jià)偶聯(lián)已顯示增強(qiáng)在蛋白水解酶或血漿存在下的酶穩(wěn)定性。用聚唾液酸化天門冬酰胺酶與未經(jīng)修飾的天門冬酰胺酶進(jìn)行的體內(nèi)比較研究揭示聚唾液酸化增加酶的半衰期(Femandes和Gregoriadis，Int Biochimica Biophysica Acta 1341:26-34，1997)。

通過在水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵聯(lián)來制備綴合物可利用多種化學(xué)方法進(jìn)行。舉例而言，Roberts等人(Adv Drug Deliv Rev 2002：54:459-76)回顧了PEG衍生物與肽或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)偶聯(lián)的方法為使聚合物經(jīng)由蛋白質(zhì)的碳水化合物部分綴合?？扇菀椎赜眠^碘酸鈉(NaIO₄)氧化蛋白質(zhì)中碳水化合物的鄰羥基(OH)以形成活性醛基(Rothfus和Smith，J Biol Chem 1963：238:1402-10；van Lenten和Ashweli，J Biol Chem 1971：246:1889-94)。接著，可通過使用含有例如活性酰肼基的試劑使聚合物與碳水化合物的醛基偶聯(lián)(Wilchek M和Bayer EA，Methods Enzymol 1987：138:429-42)。新近技術(shù)為使用含有與醛反應(yīng)形成肟鍵合的氨氧基的試劑(WO 96/40662、WO2008/025856)。

描述使水溶性聚合物綴合于治療性蛋白質(zhì)的其它實(shí)例描述于以下文獻(xiàn)中：WO 06/071801，教導(dǎo)氧化馮威利布蘭德因子中的碳水化合物部分，并接著使用酰肼化學(xué)與PEG偶聯(lián)；美國公開第2009/0076237號(hào)，教導(dǎo)氧化rFVIII，并接著使用酰肼化學(xué)與PEG及其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶聯(lián)；WO 2008/025856，教導(dǎo)氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII及FVIIa)，并接著使用氨氧基化學(xué)經(jīng)由形成肟鍵合與例如PEG偶聯(lián)；及美國專利第5,621,039號(hào)，教導(dǎo)氧化FIX，并接著使用酰肼化學(xué)與PEG偶聯(lián)。

最近，描述了一種改良方法，所述方法包括以過碘酸鹽適度氧化唾液酸以產(chǎn)生醛，接著在催化量的苯胺存在下與含氨氧基的試劑反應(yīng)(Dirksen A和Dawson PE，Bioconjugate Chem.2008：19，2543-8；及Zeng Y等人，Nature Methods 2009：6:207-9)。苯胺催化作用顯著加速肟連接，從而允許使用極低濃度的所述試劑。

縱使存在可用于使水溶性聚合物綴合于治療性蛋白質(zhì)的方法，但仍需要開發(fā)改良蛋白質(zhì)的藥效學(xué)和/或藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)同時(shí)使與各種試劑相關(guān)的成本降至最低的使水溶性聚合物綴合于蛋白質(zhì)的材料和方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供使聚合物綴合于蛋白質(zhì)的材料和方法，其改善蛋白質(zhì)的藥效學(xué)和/或藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)同時(shí)使與各種試劑相關(guān)的成本降至最低。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分的方法包括使氧化的碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物在允許綴合的條件下接觸；所述凝血蛋白選自由以下所組成的組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威利布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶或其生物活性片段、衍生物或變異體；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且選自由以下所組成的組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭(pullulane)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)；且所述碳水化合物部分通過用包含氧化劑的緩沖液孵育而氧化，所述氧化劑選自由以下所組成的組：過碘酸鈉(NaIO₄)、四乙酸鉛(Pb(OAc)₄)及過釕酸鉀(KRuO₄)；其中肟鍵合在氧化的碳水化合物部分與水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法的水溶性聚合物為PSA。在相關(guān)實(shí)施方案中，PSA包含約5-500或10-300個(gè)唾液酸單元。在又一實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白為FIX。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白為FVIIa。在又一實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白為FVIII。在又一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中氧化劑為過碘酸鈉(NaIO₄)。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法的凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中所述PSA通過使活化的氨氧基連接基團(tuán)與氧化的PSA反應(yīng)來制備；

其中所述氨氧基連接基團(tuán)選自由以下所組成的組：

下式的3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺連接基團(tuán)：

及

下式的3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二羥基胺連接基團(tuán)：

其中所述PSA通過用氧化劑孵育來氧化以在PSA的非還原末端形成末端醛基。在又一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中活化的氨氧基連接基團(tuán)包含1-50個(gè)乙二醇單元。

在又一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中氨氧基連接基團(tuán)為3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺。在相關(guān)實(shí)施方案中，氧化劑為NaIO₄。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中所述氧化的碳水化合物部分與所述活化的水溶性聚合物的接觸在包含選自由苯胺和苯胺衍生物所組成的組的親核性催化劑的緩沖液中進(jìn)行。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其進(jìn)一步包括通過在包含選自由氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)和抗壞血酸(維生素C)所組成的組的還原化合物的緩沖液中孵育綴合的凝血蛋白來還原綴合的凝血蛋白中的肟鍵合的步驟。在相關(guān)實(shí)施方案中，還原化合物為氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種由上述方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾凝血蛋白。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供一種經(jīng)修飾FIX，其包含F(xiàn)IX分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及至少一個(gè)結(jié)合至FIX分子的氨氧基PSA，其中所述氨氧基PSA經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分連接至FIX。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種經(jīng)修飾FVIIa，其包含F(xiàn)VIIa分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及至少一個(gè)結(jié)合至FVIIa分子的氨氧基PSA，其中所述氨氧基PSA經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分連接至FVIIa。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供一種經(jīng)修飾FVIII，其包含F(xiàn)VIII分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及至少一個(gè)結(jié)合至FVIII分子的氨氧基PSA，其中所述氨氧基PSA經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分連接至FVIII。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供一種經(jīng)修飾FIX，其包含F(xiàn)IX分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及至少一個(gè)結(jié)合至FIX分子的氨氧基PEG，其中所述氨氧基PEG經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分連接至FIX。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種經(jīng)修飾FVIIa，其包含F(xiàn)VIIa分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及至少一個(gè)結(jié)合至FVIIa分子的氨氧基PEG，其中所述氨氧基PEG經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分連接至FVIIa。

在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供一種經(jīng)修飾FVIII，其包含F(xiàn)VIII分子或其生物活性片段、衍生物或變異體；及至少一個(gè)結(jié)合至FVIII分子的氨氧基PEG，其中所述氨氧基PEG經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分連接至FVIII。

在又一實(shí)施方案中，提供一種包含活性氨氧基連接基團(tuán)的水溶性聚合物；所述水溶性聚合物選自由以下所組成的組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)；所述活性氨氧基連接基團(tuán)選自由以下所組成的組：下式的3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺連接基團(tuán)：

及

下式的3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二羥基胺連接基團(tuán)：

在又一實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中活化的氨氧基連接基團(tuán)包含1-50個(gè)乙二醇單元。

附圖

圖1顯示凝血因子IX的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖2顯示氧化的rFIX與氨氧基-PSA的偶聯(lián)。

圖3顯示水溶性二氨氧基連接基團(tuán)3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺和3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二羥基胺的合成。

圖4顯示氨氧基-PSA的制備。

圖5顯示采用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)PSA-rFIX綴合物進(jìn)行的分析性表征。

圖6顯示采用利用抗FIX和抗PSA抗體進(jìn)行檢測(cè)對(duì)PSA-rFIX綴合物進(jìn)行的分析性表征。

圖7顯示天然rFIX和PSA-rFIX綴合物相對(duì)于輸注后時(shí)間的活性。

圖8顯示PSA-rFVIII和Advate相對(duì)于輸注后時(shí)間的含量。

發(fā)明詳述

治療性蛋白質(zhì)的藥理學(xué)和免疫性質(zhì)可通過化學(xué)修飾及與聚合化合物綴合來改善，所述聚合化合物為例如聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。所得綴合物的性質(zhì)一般高度取決于聚合物的結(jié)構(gòu)及大小。因此，在本領(lǐng)域中，通常優(yōu)選具有確定且狹窄大小分布的聚合物。合成聚合物例如PEG可容易地制成具有狹窄大小分布，而PSA可以使得產(chǎn)生具有狹窄大小分布的最終PSA制劑的方式純化。另外，具有確定聚合物鏈及狹窄大小分布的聚乙二醇化試劑市場(chǎng)有售且可以合理的價(jià)格購得。

例如通過聚唾液酸化來添加可溶性聚合物為一種改善凝血蛋白例如FIX以及其它凝血蛋白(例如VWF、FVIIa(參見例如US 2008/0221032A1，以引用的方式并入本文中)及FVIII)的性質(zhì)的方法。

凝血蛋白

如本文所述，本發(fā)明涵蓋以下凝血蛋白，包括(但不限于)因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威利布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。如本文所使用的術(shù)語“凝血蛋白(blood coagulation protein)”是指展現(xiàn)與特定天然凝血蛋白相關(guān)的生物活性的任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威利布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。

凝血級(jí)聯(lián)分為三個(gè)不同的部分：內(nèi)源途徑、外源途徑及共同途徑(Schenone等人，Curr OpinHematol.2004：11:272-7)。所述級(jí)聯(lián)涉及一系列絲氨酸蛋白酶(酶原)及蛋白質(zhì)輔因子。需要時(shí)，非活性酶原前體轉(zhuǎn)化為活性形式，從而轉(zhuǎn)化級(jí)聯(lián)中的后續(xù)酶。

內(nèi)源途徑需要凝血因子VIII、IX、X、XI及XII。當(dāng)前激肽釋放酶、高分子量激肽原、因子XI(FXI)及因子XII(FXII)暴露于帶負(fù)電的表面時(shí)，發(fā)生內(nèi)源途徑的引發(fā)。還需要自血小板分泌的鈣離子及磷脂。

當(dāng)血管的血管內(nèi)腔受損時(shí)，引發(fā)外源途徑。膜糖蛋白組織因子暴露，并隨后結(jié)合于循環(huán)的因子VII(FVII)及少量預(yù)先存在的其活化形式FVIIa。這種結(jié)合有利于FVII完全轉(zhuǎn)化成FVIIa，及接著在鈣和磷脂存在下因子IX(FIX)轉(zhuǎn)化成因子IXa(FIXa)，及因子X(FX)轉(zhuǎn)化成因子Xa(FXa)。FVIIa與組織因子的締合通過使FVII的基質(zhì)(FIX和FX)結(jié)合位點(diǎn)更靠近且誘導(dǎo)構(gòu)型變化(這增強(qiáng)FVIIa的酶促活性)來增強(qiáng)蛋白水解活性。

FX的活化為兩個(gè)途徑的共點(diǎn)。因子Va(FVa)和Xa連同磷脂和鈣一起使凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶(凝血酶原酶復(fù)合物)，凝血酶隨后裂解纖維蛋白原形成纖維蛋白單體。所述單體聚合形成纖維蛋白鏈。因子XIIIa(FXIIIa)使這些鏈相互共價(jià)鍵合以形成剛性網(wǎng)狀物。

FVII轉(zhuǎn)化成FVIIa也受若干蛋白酶催化，所述蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)及因子XIIa(FXIIa)。為對(duì)級(jí)聯(lián)的早期進(jìn)行抑制，組織因子途徑抑制劑靶向FVIIa/組織因子/FXa產(chǎn)物復(fù)合物。

A.多肽

在一個(gè)方面，本發(fā)明的起始物質(zhì)為可來源于人類血漿或由如專利中所述的重組工程改造技術(shù)制備的凝血蛋白，所述專利為美國專利第4,757,006號(hào)；美國專利第5,733,873號(hào)；美國專利第5,198,349號(hào)；美國專利第5,250,421號(hào)；美國專利第5,919,766號(hào)；及EP 306 968。如本文所述，術(shù)語凝血蛋白是指展現(xiàn)與天然凝血蛋白相關(guān)的生物活性的任何凝血蛋白分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，凝血蛋白分子為全長凝血蛋白。

預(yù)期的凝血蛋白分子包括全長蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì)的前體、全長蛋白質(zhì)的生物活性次單元或片段以及任何這些凝血蛋白形式的生物活性衍生物及變異體。因此，凝血蛋白包括滿足以下條件者：(1)具有在至少約25個(gè)、約50個(gè)、約100個(gè)、約200個(gè)、約300個(gè)、約400個(gè)或更多氨基酸的區(qū)域內(nèi)與本文所述的參考核酸或氨基酸序列編碼的多肽的氨基酸序列具有大于約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％或更高同一性的氨基酸序列；和/或(2)特異性結(jié)合于針對(duì)包含如本文所述的參考氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段和/或其保守性修飾變異體產(chǎn)生的抗體，例如多克隆或單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“重組凝血蛋白”包括經(jīng)由重組DNA技術(shù)獲得的任何凝血蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述術(shù)語涵蓋如本文所述的蛋白質(zhì)。

如本文所使用的“內(nèi)源性凝血蛋白”包括起源于意欲接受治療的哺乳動(dòng)物的凝血蛋白。所述術(shù)語還包括自所述哺乳動(dòng)物中所存在的轉(zhuǎn)基因或任何其它外來DNA轉(zhuǎn)錄的凝血蛋白。如本文所使用的“外源性凝血蛋白”包括并非起源于意欲接受治療的哺乳動(dòng)物的凝血蛋白。

如本文所使用的“血漿來源的凝血蛋白”或“血漿性(plasmatic)”包括自哺乳動(dòng)物獲得的血液中可見的具有參與凝血途徑的性質(zhì)的蛋白質(zhì)的所有形式。

如本文所使用的“生物活性衍生物”或“生物活性變異體”包括分子的與所述分子具有實(shí)質(zhì)上相同的功能和/或生物性質(zhì)(例如結(jié)合性質(zhì))和/或相同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(例如肽主鏈或基礎(chǔ)聚合單元)的任何衍生物或變異體。

“類似物”、“變異體”或“衍生物”為與天然存在的分子在結(jié)構(gòu)上實(shí)質(zhì)上類似且具有相同生物活性的化合物，但在某些情況下，程度不同。舉例而言，多肽變異體是指與參考多肽共享實(shí)質(zhì)上類似的結(jié)構(gòu)且具有相同的生物活性的多肽。變異體或類似物與衍生出所述類似物的天然存在多肽相比基于一個(gè)或多個(gè)突變而在氨基酸序列組成方面不同，所述一個(gè)或多個(gè)突變涉及(i)多肽的一個(gè)或多個(gè)末端處和/或天然存在多肽序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域(例如片段)中缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，(ii)在多肽的一個(gè)或多個(gè)末端處(典型地為“添加”或“融合”)和/或天然存在多肽序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域(典型地為“插入”)中插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或(iii)天然存在多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代成其它氨基酸。舉例而言，“衍生物”是指已經(jīng)修飾(例如化學(xué)修飾)的與參考多肽共享相同或?qū)嵸|(zhì)上類似的結(jié)構(gòu)的多肽。

變異體或類似物多肽包括插入變異體，其中向本發(fā)明的凝血蛋白氨基酸序列添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可位于蛋白質(zhì)的任一個(gè)或兩個(gè)末端，和/或可位于凝血蛋白氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域中。任一個(gè)或兩個(gè)末端具有額外殘基的插入變異體包括例如融合蛋白及包括氨基酸標(biāo)簽或其它氨基酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。在一個(gè)方面，凝血蛋白分子視情況含有N末端Met，尤其當(dāng)分子重組表達(dá)于例如大腸桿菌(E.coli)的細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)。

在缺失變異體中，在如本文所述的凝血蛋白多肽中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)移除。缺失可在凝血蛋白多肽的一個(gè)或兩個(gè)末端實(shí)現(xiàn)，和/或移除凝血蛋白氨基酸序列內(nèi)部的一個(gè)或多個(gè)殘基。因此，缺失變異體包括凝血蛋白多肽序列的片段。

在取代變異體中，凝血蛋白多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)移除并用替代殘基置換。在一個(gè)方面，取代在性質(zhì)上為保守性的，且所述類型的保守性取代在本領(lǐng)域?yàn)槭熘?。或者，本發(fā)明包涵也是非保守性的取代。示例性保守性取代描述于Lehninger[Biochemistry，第2版；Worth Publishers公司，New York(1975)，第71-77頁]中，且緊接著陳述如下。

保守性取代

或者，示例性保守性取代緊接著陳述如下。

保守性取代II

B.聚核苷酸

本發(fā)明的編碼凝血蛋白的核酸包括例如(但不限于)基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多態(tài)性變異體、等位基因、合成及天然存在的突變體。

本發(fā)明的編碼凝血蛋白的聚核苷酸還包括(但不限于)滿足以下條件者：(1)在嚴(yán)格雜交條件下與編碼本文所述的參考氨基酸序列的核酸及其保守性修飾變異體特異性雜交；(2)具有在至少約25個(gè)、約50個(gè)、約100個(gè)、約150個(gè)、約200個(gè)、約250個(gè)、約500個(gè)、約1000個(gè)或更多核苷酸的區(qū)域(至多成熟蛋白質(zhì)的1218個(gè)核苷酸的全長序列)內(nèi)與本文所述的參考核酸序列具有大于約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高核苷酸序列同一性的核酸序列。示例性“嚴(yán)格雜交”條件包括在42℃下于50％甲酰胺、5×SSC、20mM Na·PO4，pH 6.8中雜交；及在55℃下以1×SSC洗滌30分鐘。應(yīng)了解，此等示例性條件的變化可基于待雜交的序列的長度及GC核苷酸含量進(jìn)行。本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)式適于確定適當(dāng)雜交條件。參見Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)§§9.47-9.51。

“天然存在的”聚核苷酸或多肽序列典型地來自哺乳動(dòng)物，包括(但不限于)靈長類動(dòng)物，例如人類；嚙齒動(dòng)物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)可為重組分子(例如為異源的且編碼野生型序列或其變異體，或?yàn)榉翘烊淮嬖诘?。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，上述多肽和聚核苷酸例如為以下凝血蛋白。

因子VIIa

FVII(也稱為穩(wěn)定因子或前轉(zhuǎn)化素)為在止血及凝血中具有關(guān)鍵作用的維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶糖蛋白(Eigenbrot，Curr Protein Pept Sci.2002：3:287-99)。

FVII在肝臟中合成且以48kD的單鏈糖蛋白形式分泌。FVII與所有維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶糖蛋白共享類似的由以下組成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)：具有9-12個(gè)殘基負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)與脂膜交互作用的氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域、羧基端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(催化結(jié)構(gòu)域)、及兩個(gè)含有介導(dǎo)與組織因子交互作用的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域。γ-谷氨酰羧化酶催化分子氨基端部分中Gla殘基的羧化。羧化酶的作用依賴于維生素K的還原形式，所述維生素K被氧化成環(huán)氧化物形式。需要維生素K環(huán)氧化物還原酶使維生素K的環(huán)氧化物形式轉(zhuǎn)化成還原形式。

大比例的FVII以酶原形式在血漿中循環(huán)，且此形式的活化導(dǎo)致精氨酸152與異亮氨酸153之間的肽鍵裂解。所得活化的FVIIa由經(jīng)由單個(gè)二硫鍵(Cys 135與Cys 262)連接的NH₂衍生的輕鏈(20kD)及COOH端衍生的重鏈(30kD)組成。輕鏈含有膜結(jié)合Gla結(jié)構(gòu)域，而重鏈含有催化結(jié)構(gòu)域。

遺傳和環(huán)境因素決定的FVII血漿濃度為約0.5mg/mL(Pinotti等人，Blood.2000：95:3423-8)。不同F(xiàn)VII基因型的平均FVII含量可相差數(shù)倍。健康女性的血漿FVII含量在妊娠期間升高，而且血漿FVII含量會(huì)隨年齡而增加，且在女性及患高甘油三酯血癥者中較高。FVII在所有促凝血因子中半衰期最短(3-6h)。健康個(gè)體的平均FVIIa血漿濃度為3.6ng/mL，且FVIIa的循環(huán)半衰期與其它凝血因子相比相對(duì)較長(2.5h)。

遺傳性FVII缺陷為一種罕見常染色體隱性出血病癥，據(jù)估算總?cè)后w的發(fā)病率為每500,000個(gè)人1例(Acharya等人，J Thromb Haemost.2004：2248-56)。抑制劑所致的后天性FVII缺陷也極罕見。還已報(bào)導(dǎo)缺陷的發(fā)生與例如頭孢菌素、青霉素及口服抗凝血?jiǎng)┑乃幬锵嚓P(guān)的病例。此外，已報(bào)導(dǎo)后天性FVII缺陷自發(fā)發(fā)生，或伴隨其它病狀(例如骨髓瘤、敗血癥、再生障礙性貧血)、伴隨白細(xì)胞介素-2及抗胸腺細(xì)胞球蛋白療法而發(fā)生。

參考聚核苷酸和多肽序列包括例如GenBank登錄號(hào)J02933(基因組序列)、M13232(cDNA)(Hagen等人，PNAS 1986：83:2412-6)及P08709(多肽序列)(參考文獻(xiàn)全文并入本文中)。已描述FVII的多種多態(tài)性現(xiàn)象，例如參見Sabater-Lleal等人(Hum Genet.2006：118:741-51)(參考文獻(xiàn)全文并入本文中)。

因子IX

FIX為通過在鈣離子、磷脂和FVIIIa存在下將FX轉(zhuǎn)化成其活性形式來參與凝血內(nèi)源途徑的維生素K依賴性血漿蛋白質(zhì)。FIX的主要催化能力為作為對(duì)FX內(nèi)的特定精氨酸-異亮氨酸鍵具有特異性的絲氨酸蛋白酶。FIX的活化經(jīng)由FXIa發(fā)生，F(xiàn)XIa引起自FIX切除活化肽，從而產(chǎn)生包含兩個(gè)經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵保持在一起的鏈的活化FIX分子。FIX的缺陷為隱性X連鎖B型血友病的病因。

A型和B型血友病分別為以FVIII和FIX多肽的缺陷為特征的遺傳性疾病。缺陷的基礎(chǔ)病因經(jīng)常為FVIII和FIX基因突變的結(jié)果，F(xiàn)VIII與FIX基因兩者均位于X染色體上。血友病的傳統(tǒng)療法通常涉及靜脈內(nèi)施用來自正常個(gè)體的匯集血漿或半純化凝血蛋白。這些制劑可能受病原體或病毒污染，所述病原體或病毒為例如感染性朊病毒、HIV、細(xì)小病毒、A型肝炎及C型肝炎。因此，迫切需要不需要使用人類血清的治療劑。

FIX活性降低的程度與B型血友病的嚴(yán)重程度成正比。B型血友病的當(dāng)前治療由以下組成：用血漿來源的FIX或重組FIX置換缺陷的蛋白質(zhì)(所謂的FIX替代或置換治療或療法)。

FIX的聚核苷酸和多肽序列可見于例如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P00740、美國專利第6,531,298號(hào)和圖1中。

因子VIII

凝血因子VIII(FVIII)以極低濃度在血漿中循環(huán)且非共價(jià)結(jié)合于馮威利布蘭德因子(VWF)。止血期間，F(xiàn)VIII與VWF分離且通過在鈣和磷脂或細(xì)胞膜存在下增強(qiáng)活化速率而充當(dāng)由活化因子IX(FIXa)介導(dǎo)的FX活化的輔因子。

FVIII可以具有結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)A1-A2-B-A3-C1-C2的約270-330kD的單鏈前體形式合成。當(dāng)自血漿純化(例如“血漿來源”或“血漿性”)時(shí)，F(xiàn)VIII由重鏈(A1-A2-B)和輕鏈(A3-C1-C2)構(gòu)成。輕鏈的分子質(zhì)量為80kD，而歸因于B結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在蛋白水解，重鏈的分子質(zhì)量在90-220kD范圍內(nèi)。

FVIII還以重組蛋白質(zhì)形式合成以在治療上用于止血病癥。已設(shè)計(jì)各種體外測(cè)定來測(cè)定重組FVIII(rFVIII)作為治療性藥品的潛在功效。這些測(cè)定模擬內(nèi)源性FVIII的體內(nèi)作用。FVIII的體外凝血酶處理使得其促凝血活性快速增加，接著降低，如體內(nèi)測(cè)定所測(cè)量。此活化及失活與重鏈與輕鏈中的特異性受限蛋白水解一致，所述蛋白水解改變FVIII中不同結(jié)合抗原決定基的可用性，例如允許FVIII自VWF解離并結(jié)合于磷脂表面或改變與某些單克隆抗體的結(jié)合能力。

FVIII的缺陷或功能異常導(dǎo)致最常見的出血病癥，A型血友病。管理A型血友病的所選治療為血漿來源或rFVIII濃縮物的替代療法，F(xiàn)VIII含量低于1％的重度A型血友病患者一般采用防治性療法，目的在于在各劑量之間保持FVIII高于1％?？紤]到各種FVIII產(chǎn)物在循環(huán)中的平均半衰期，此結(jié)果通?？赏ㄟ^每周給予FVIII兩至三次來達(dá)成。

參考聚核苷酸和多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等人，Characterization of the human Factor VIII gene，Nature，312(5992):326-30(1984)；Vehar GH等人，Structure of human Factor VIII，Nature，312(5992):337-42(1984)；Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIII gene and protein，Semin Thromb Hemost，2003:29：11-29(2002)。

馮威利布蘭德因子

馮威利布蘭德因子(VWF)為在血漿中循環(huán)的呈一系列大小在約500kD至20,000kD范圍內(nèi)的多聚體的糖蛋白。VWF的多聚形式由經(jīng)由二硫鍵鍵合在一起的250kD多肽次單元構(gòu)成。VWF介導(dǎo)最初的血小板于受損血管壁內(nèi)皮下層上的黏附。僅較大多聚體展現(xiàn)止血活性。假定內(nèi)皮細(xì)胞分泌大型多聚形式的VWF，且具有低分子量的那些VWF形式(低分子量VWF)由蛋白水解裂解而產(chǎn)生。具有大分子質(zhì)量的多聚體儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞的韋伯潘力氏小體(Weibel-Pallade body)內(nèi)且在受刺激后釋放。

VWF由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成為在很大程度上由重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成的原VWF前體。信號(hào)肽裂解后，原VWF經(jīng)由其C端區(qū)的二硫鍵合二聚化。所述等二聚體充當(dāng)多聚化的原聚體，所述多聚化受自由端末端之間的二硫鍵合控制。組裝成多聚體之后，通過蛋白水解移除前肽序列(Leyte等人，Biochem.J.274(1991)，257-261)。

自VWF的克隆cDNA預(yù)測(cè)的初級(jí)轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物為含2813個(gè)殘基的前體多肽(原VWF前體)。原VWF前體由含22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和含741個(gè)氨基酸的前肽組成，其中成熟VWF包含2050個(gè)氨基酸(Ruggeri Z.A.和Ware，J.，F(xiàn)ASEB J.，308-316(1993))。

VWF的缺陷為特征在于明顯程度不同的出血表型的馮威利布蘭德病(Von Willebrand disease，VWD)的病因。第3型VWD為最嚴(yán)重的形式，其中VWF完全缺陷，且第1型VWD與VWF的定量損失相關(guān)且其表型可能極輕。第2型VWD與VWF的定性缺陷相關(guān)且可能與第3型VWD一樣嚴(yán)重。第2型VWD具有許多亞形式，其中一些與高分子量多聚體的損失或減少相關(guān)。第2a型馮威利布蘭德病(VWD-2A)的特征在于損失中型與大型多聚體。VWD-2B的特征在于損失最高分子量的多聚體。本領(lǐng)域已知其它與VWF相關(guān)的疾病和病癥。

原VWF前體的聚核苷酸和氨基酸序列分別可以GenBank登錄號(hào)NM_000552和NP_000543獲得。

本領(lǐng)域描述了根據(jù)本發(fā)明的其它凝血蛋白，例如Mann KG，Thromb Haemost，1999：82:165-74。

C.凝血蛋白的制備

凝血蛋白的制備包括本領(lǐng)域已知的用于以下的任何方法：(i)通過遺傳工程改造制備重組DNA，(ii)通過例如(但不限于)轉(zhuǎn)染、電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核生物或真核生物細(xì)胞中，(iii)孵育所述經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，(iv)表達(dá)凝血蛋白，例如組成性表達(dá)或在誘導(dǎo)后表達(dá)，及(v)分離所述凝血蛋白，例如自培養(yǎng)基中分離或通過收集經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以獲得經(jīng)純化的凝血蛋白。

在其它方面，通過于以產(chǎn)生藥理學(xué)上可接受的凝血蛋白分子為特征的適合原核生物或真核生物宿主系統(tǒng)中表達(dá)來制備凝血蛋白。真核生物細(xì)胞的實(shí)例為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2。

多種載體可用于制備凝血蛋白且選自真核生物和原核生物表達(dá)載體。用于原核生物表達(dá)的載體的實(shí)例包括質(zhì)體，例如(但不限于)pRSET、pET及pBAD，其中用于原核生物表達(dá)載體的啟動(dòng)子包括(但不限于)以下中的一個(gè)或多個(gè)：lac、trc、trp、recA或araBAD。用于真核生物表達(dá)的載體的實(shí)例包括：(i)用于在酵母中表達(dá)時(shí)，載體為例如(但不限于)pAO、pPIC、pYES或pMET，使用的啟動(dòng)子為例如(但不限于)AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，載體為例如(但不限于)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，使用的啟動(dòng)子為例如(但不限于)PH、p10、MX、Ac5、OpIE2、gp64或polh，及(iii)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，載體為例如(但不限于)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，且在一個(gè)方面，載體來源于病毒系統(tǒng)，所述等病毒系統(tǒng)為例如(但不限于)痘苗病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒，使用的啟動(dòng)子為例如(但不限于)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動(dòng)蛋白。

D.施用

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合的凝血蛋白可通過注射(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)施用。

給人類或測(cè)試動(dòng)物施用包含本發(fā)明的綴合的凝血蛋白的組合物，在一個(gè)方面，所述組合物包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上”或“藥理學(xué)上可接受”是指分子實(shí)體和組合物當(dāng)如下文所述使用本領(lǐng)域熟知的途徑施用時(shí)為穩(wěn)定的，抑制蛋白質(zhì)降解(例如聚集和裂解產(chǎn)物)，且另外不產(chǎn)生過敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)?！八帉W(xué)上可接受的載體”包括任何及所有臨床上有用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑及其類似物，包括以上所公開的那些藥劑。

如本文所使用的“有效量”包括適于治療患有如本文所述的出血病癥的哺乳動(dòng)物的劑量。

組合物可如下施用：口服、局部、經(jīng)皮、腸胃外、通過吸入噴霧、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸或通過顱內(nèi)注射。如本文所使用的術(shù)語腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。還涵蓋如下施用：靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、乳房內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)注射和/或外科手術(shù)植入特定部位。一般而言，組合物基本上不含致熱原以及可能對(duì)接受者有害的其它雜質(zhì)。

通過治療醫(yī)師選擇的劑量水平和方式進(jìn)行組合物的單次或多次施用。預(yù)防或治療疾病時(shí)，適當(dāng)劑量將視以下因素而定：如上所述的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度及病程、施用藥物是用于預(yù)防性目的或治療性目的、先前療法、患者的臨床病史及對(duì)藥物的反應(yīng)及主治醫(yī)師的判斷。

本發(fā)明還涉及一種包含有效量的如本文所定義的綴合的凝血蛋白的藥物組合物。藥物組合物可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、鹽、緩沖劑或賦形劑。藥物組合物可用于治療以上定義的出血病癥。本發(fā)明的藥物組合物可為溶液或凍干產(chǎn)品?？蓪?duì)藥物組合物的溶液進(jìn)行任何適合的凍干過程。

作為另一方面，本發(fā)明包括包含以有利于本發(fā)明組合物用于施用個(gè)體的方式包裝的本發(fā)明組合物的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括包裝于容器(例如密封瓶或容器)中的本文所述的化合物或組合物(例如包含綴合的凝血蛋白的組合物)，以及附著于容器上或包括在包裝中的描述化合物或組合物在實(shí)施所述方法中的用途的標(biāo)簽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒含有具有包含綴合的凝血蛋白的組合物的第一容器和具有用于第一容器中的組合物的生理學(xué)上可接受的復(fù)原溶液的第二容器。在一個(gè)方面，化合物或組合物以單位劑型包裝。該試劑盒可進(jìn)一步包括適于根據(jù)特定施用途徑施用組合物的裝置。優(yōu)選地，該試劑盒含有描述治療性蛋白質(zhì)或肽組合物的使用的標(biāo)簽。

水溶性聚合物

在一個(gè)方面，所提供的凝血蛋白衍生物(即，綴合的凝血蛋白)分子結(jié)合于水溶性聚合物，包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，水溶性聚合物由分子量范圍為以下的唾液酸分子組成：350至120,000Da、500至100,000Da、1000至80,000Da、1500至60,000Da、2,000至45,000Da、3,000至35,000Da及5,000至25,000Da。水溶性聚合物的偶聯(lián)可通過與蛋白質(zhì)直接偶聯(lián)或經(jīng)由連接分子偶聯(lián)來進(jìn)行?；瘜W(xué)連接基團(tuán)的一個(gè)實(shí)例為含碳水化合物選擇性酰肼和硫氫基反應(yīng)性順丁烯二酰亞氨基的MBPH(4-[4-N-順丁烯二酰亞氨基苯基]丁酸酰肼)(Chamow等人，J Biol Chem 1992：267:15916-22)。其它示例性及優(yōu)選的連接基團(tuán)描述如下。

在一個(gè)實(shí)施方案中，衍生物保留天然治療性凝血蛋白產(chǎn)物的全部功能活性，且與天然治療性凝血蛋白產(chǎn)物相比，提供延長的體內(nèi)半衰期。在另一實(shí)施方案中，相對(duì)于天然凝血蛋白，衍生物保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(％)的生物活性。在相關(guān)方面中，以顯色活性與凝血因子抗原值的比率(凝血因子Chr：凝血因子Ag)測(cè)定衍生物和天然凝血蛋白的生物活性。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，相對(duì)于天然凝血蛋白的體內(nèi)半衰期，構(gòu)建體的半衰期降至或增至0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

A.唾液酸和PSA

如本文所使用的“唾液酸部分”包括可溶于水溶液或懸浮液中且在施用藥物有效量的PSA-凝血蛋白綴合物之后對(duì)哺乳動(dòng)物幾乎不產(chǎn)生負(fù)面影響(例如副作用)的唾液酸單體或聚合物(“多糖”)。在一個(gè)方面，聚合物的特征在于具有1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500個(gè)唾液酸單元。在某些方面中，不同唾液酸單元組合于一條鏈中。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多糖化合物的唾液酸部分具有高親水性，且在另一實(shí)施方案中，整個(gè)化合物具有高親水性。親水性主要由唾液酸單元的側(cè)接羧基以及羥基賦予。糖單元可含有其它官能基，例如胺、羥基或硫酸酯基或其組合。這些基團(tuán)可存在于天然存在的糖化合物上或引入衍生的多糖化合物中。

天然存在的聚合物PSA可以顯示寬大小分布(例如Sigma C-5762)及高多分散性(PD)的多分散制劑形式獲得。因?yàn)槎嗵峭ǔＴ诰哂泄布兓瘍?nèi)毒素的固有風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)菌中產(chǎn)生，所以長唾液酸聚合物鏈的純化可使內(nèi)毒素含量增加的機(jī)率升高。具有1-4個(gè)唾液酸單元的短PSA分子還可合成制備(Kang SH等人，Chem Commun.2000：227-8；Ress DK及Linhardt RJ，Current Organic Synthesis.2004：1:31-46)，從而將高內(nèi)毒素水平的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。然而，目前可制造大小分布狹窄且多分散性低而且亦無內(nèi)毒素的PSA制劑。在一個(gè)方面，特別可用于本發(fā)明的多糖化合物為由細(xì)菌產(chǎn)生的多糖化合物。這些天然存在多糖中的一些稱為糖脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，多糖化合物實(shí)質(zhì)上不含末端半乳糖單元。

B.聚乙二醇(PEG)和聚乙二醇化

在某些方面中，凝血因子(例如FVIII、FVIIa、FIX或其它凝血因子分子)通過多種化學(xué)方法中的任一種綴合于水溶性聚合物(Roberts JM等人，Advan Drug Delivery Rev 2002：54:459-76)。舉例而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用N-羥基丁二酰亞胺(NHS)酯使PEG綴合于FVIII、FVIIa或FIX的自由氨基來修飾所述蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，使用順丁烯二酰亞胺化學(xué)或PEG酰肼或PEG胺與事先氧化之后的FVIII、FVIIa或FIX的碳水化合物部分的偶聯(lián)，來使水溶性聚合物(例如PEG)與自由SH基團(tuán)偶聯(lián)。

在一個(gè)方面，通過使水溶性聚合物與凝血因子(例如FVIII、FVIIa或FIX)在形成穩(wěn)定鍵下直接偶聯(lián)(或經(jīng)由連接系統(tǒng)偶聯(lián))進(jìn)行綴合。另外，在本發(fā)明的某些方面中，使用可降解的、可釋放的或可水解的連接系統(tǒng)(Tsubery等人，J Biol Chem 2004：279:38118-24/Greenwald等人，J Med Chem 1999：42:3657-67/Zhao等人，Bioconj Chem 2006：17:341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用含活性N-羥基丁二酰亞胺酯(NHS)(例如丁二酸丁二酰亞胺酯、戊二酸丁二酰亞胺酯或丙酸丁二酰亞胺酯)的聚乙二醇衍生物經(jīng)由賴氨酸殘基修飾凝血因子(例如FVIII、FVIIa或FIX)。這些衍生物與FVIII、FVIIa或FIX的賴氨酸殘基在溫和條件下通過形成穩(wěn)定的酰胺鍵而反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PEG衍生物的鏈長為5,000Da。各種實(shí)施方案中使用鏈長為500至2,000Da、2,000至5,000Da、5,000以上至10,000Da或10,000以上至20,000Da、或20,000以上至150,000Da的其它PEG衍生物，包括線性和分支結(jié)構(gòu)。

氨基聚乙二醇化的替代方法為(但不限于)通過形成氨基甲酸乙酯鍵與PEG碳酸酯化學(xué)綴合，或通過還原胺化與醛或酮反應(yīng)從而形成仲酰胺鍵。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用可購得的PEG衍生物對(duì)凝血因子(例如FVIII、FVIIa、FIX或其它凝血因子)分子進(jìn)行化學(xué)修飾。在替代方面中，這些PEG衍生物具有線性或分支結(jié)構(gòu)。含NHS基團(tuán)的PEG衍生物的實(shí)例列于下文。

以下PEG衍生物為可自Nektar Therapeutics(Huntsville，Ala.；參見www.nektar.com/PEG試劑目錄；Nektar Advanced PEGylation，價(jià)格表2005-2006)購得的PEG衍生物的非限制性實(shí)例：

mPEG-丙酸丁二酰亞胺酯(mPEG-SPA)

mPEG-α-甲基丁酸丁二酰亞胺酯(mPEG-SMB)

mPEG-CM-HBA-NHS(CM＝羧甲基；HBA＝羥基丁酸)

分支PEG衍生物(Nektar Therapeutics)的結(jié)構(gòu)：

分支PEGN-羥基丁二酰亞胺(mPEG2-NHS)

Kozlowski等人(BioDrugs 2001：5:419-29)詳細(xì)描述具有分支結(jié)構(gòu)的這種試劑。

可自NOF Corp.(Tokyo，Japan；參見www.nof.co.jp/english：目錄2005)購得PEG衍生物的其它非限制性實(shí)例。

線性PEG衍生物(NOF Corp.)的一般結(jié)構(gòu)：

X＝羧甲基

X＝羧戊基

x＝丁二酸酯基

x＝戊二酸酯基

分支PEG衍生物(NOF Corp.)的結(jié)構(gòu)：2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(1,5-二氧代-5-丁二酰亞氨基氧基戊氧基)丙烷

2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(丁二酰亞氨基羧基戊氧基)丙烷

這些丙烷衍生物顯示1,2取代型甘油主鏈。在本發(fā)明中，還涵蓋基于1,3取代甘油結(jié)構(gòu)或US2003/0143596A1中所述的其它分支結(jié)構(gòu)的分支PEG衍生物。

還涵蓋Tsubery等人(J Biol Chem 2004：279:38118-24)和Shechter等人(WO04089280A3)所述的含可降解(例如可水解)連接基團(tuán)的PEG衍生物。

令人驚訝的是，本發(fā)明的聚乙二醇化FVIII、FVIIa、FIX或其它凝血因子展現(xiàn)功能活性以及延長的體內(nèi)半衰期。另外，聚乙二醇化rFVIII、FVIIa、FIX或其它凝血因子似乎更能抵抗凝血酶失活。

C.連接方法

凝血蛋白可經(jīng)由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的各種技術(shù)中的任一種共價(jià)連接至多糖化合物。在本發(fā)明的各個(gè)方面中，唾液酸部分可例如通過美國專利第4,356,170號(hào)(以引用的方式并入本文中)中所述的方法結(jié)合至凝血蛋白(例如FIX、FVIII、FVIIa或VWF)。

本發(fā)明還已知且涵蓋用于使PSA與多肽偶聯(lián)的其它技術(shù)。舉例而言，美國公開第2007/0282096號(hào)描述使例如PSA的胺或酰肼衍生物綴合于蛋白質(zhì)。另外，美國公開第2007/0191597號(hào)描述含有用于與基質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的還原末端反應(yīng)的醛基的PSA衍生物。這些參考文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。

美國專利第5,846,951號(hào)(其以全文引用的方式并入本文中)第7欄第15列至第8欄第5列公開了各種方法。示例性技術(shù)包括經(jīng)由凝血蛋白或多糖中的任一個(gè)上的羧基與凝血蛋白或多糖的胺基之間的肽鍵，或凝血蛋白或多糖的羧基與凝血蛋白或多糖的羥基之間的酯鍵的鍵合。凝血蛋白共價(jià)鍵結(jié)至多糖化合物的另一鍵合是經(jīng)由凝血蛋白上的自由氨基與通過過碘酸鹽氧化在多糖的非還原末端形成的醛基之間反應(yīng)所形成的希夫堿(Jennings HJ和Lugowski C，J Immunol.1981：127:1011-8；Fernandes AI和Gregoriadis G，Biochim Biophys Acta.1997：1341：26-34)。在一個(gè)方面，所產(chǎn)生的希夫堿系經(jīng)用NaCNBH3特異性還原形成仲胺而穩(wěn)定。替代方法為在事先氧化之后通過用NH4Cl還原胺化在PSA中產(chǎn)生末端自由氨基。雙官能試劑可用于連接兩個(gè)氨基或兩個(gè)羥基。舉例而言，用試劑如BS3(辛二酸雙(磺基丁二酰亞氨基)酯/Pierce，Rockford，IL)使含氨基的PSA與蛋白質(zhì)的氨基偶聯(lián)。另外，使用異雙官能交聯(lián)試劑如磺基-EMCS(N-ε-順丁烯二酰亞氨基己酰氧基)磺基丁二酰亞胺酯/Pierce)來例如連接氨基與硫醇基。

在另一方法中，制備PSA酰肼且使之與事先氧化且產(chǎn)生醛官能團(tuán)之后的蛋白質(zhì)的碳水化合物部分偶聯(lián)。

如上所述，治療性蛋白質(zhì)的自由氨基與唾液酸殘基的1-羧基反應(yīng)形成肽鍵，或在1-羧酸基團(tuán)與凝血蛋白上的羥基或其它適合活性基團(tuán)之間形成酯鍵合?；蛘撸然c去乙?；?-氨基形成肽鍵合，或凝血蛋白分子的醛基與唾液酸殘基的N-去乙?；?-氨基形成希夫堿。

或者，多糖化合物以非共價(jià)方式與凝血蛋白締合。舉例而言，在一個(gè)方面，多糖化合物和藥物活性化合物經(jīng)由疏水性相互作用連接。其它非共價(jià)締合包括帶相反電荷的離子相互吸引的靜電相互作用。

在各種實(shí)施方案中，凝血蛋白與多糖化合物以化學(xué)計(jì)算量(例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9或1:10等)連接或締合。在各種實(shí)施方案中，1-6、7-12或13-20個(gè)多糖連接至凝血蛋白。在其它實(shí)施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多個(gè)多糖連接至凝血蛋白。

在各種實(shí)施方案中，對(duì)凝血蛋白進(jìn)行修飾以引入糖基化位點(diǎn)(即除天然糖基化位點(diǎn)以外的位點(diǎn))。所述修飾可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)完成。此外，凝血蛋白可在經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分綴合于水溶性聚合物之前在體內(nèi)或體外糖基化。這些糖基化位點(diǎn)可充當(dāng)使蛋白質(zhì)與水溶性聚合物綴合的靶點(diǎn)(美國專利申請(qǐng)第20090028822號(hào)、美國專利申請(qǐng)第2009/0093399號(hào)、美國專利申請(qǐng)第2009/0081188號(hào)、美國專利申請(qǐng)第2007/0254836號(hào)、美國專利申請(qǐng)第2006/0111279號(hào)及DeFrees S.等人，Glycobiology，2006，16，9，833-43)。

D.氨氧基鍵合

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用羥胺或羥胺衍生物與醛(例如由過碘酸鈉氧化后的碳水化合物部分上的醛)形成肟基的反應(yīng)來制備凝血蛋白綴合物。舉例而言，首先用氧化劑(例如過碘酸鈉(NaIO₄))氧化糖蛋白(例如本發(fā)明的凝血蛋白)(Rothfus JA和Smith EL.，J Biol Chem 1963，238，1402-10；及Van Lenten L和Ashwell G.，J Biol Chem 1971，246，1889-94)。糖蛋白的過碘酸鹽氧化是基于1928年描述的經(jīng)典馬拉普拉德反應(yīng)(Malaprade reaction)，即用過碘酸鹽氧化鄰二醇以形成活性醛基(Malaprade L.，Analytical application，Bull Soc Chim France，1928，43，683-96)。這種氧化劑的其它實(shí)例為四乙酸鉛(Pb(OAc)₄)、乙酸錳(MnO(Ac)₃)、乙酸鈷(Co(OAc)₂)、乙酸亞鉈(TlOAc)、硫酸鈰(Ce(SO₄)₂)(US 4,367,309)或過釕酸鉀(KRuO₄)(Marko等人，J Am Chem Soc 1997，119，12661-2)?！把趸瘎笔侵改軌蛟谏矸磻?yīng)條件下氧化碳水化合物中的鄰二醇從而產(chǎn)生活性醛基的適度氧化劑。

第二步為使含氨氧基的聚合物與氧化的碳水化合物部分偶聯(lián)以形成肟鍵合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，此步驟可在催化量的親核性催化劑苯胺或苯胺衍生物存在下進(jìn)行(Dirksen A和Dawson PE，Bioconjugate Chem.2008；Zeng Y等人，Nature Methods 2009：6:207-9)。苯胺催化作用顯著加速肟連接，從而允許使用極低濃度的試劑。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述肟鍵合可因經(jīng)NaCNBH3還原形成烷氧基胺鍵合而穩(wěn)定(圖2)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使水溶性聚合物綴合于凝血蛋白的各反應(yīng)步驟分別且依次進(jìn)行(即在個(gè)別反應(yīng)步驟之間分離起始物質(zhì)(例如凝血蛋白、水溶性聚合物等)、試劑(例如氧化劑、苯胺等)及反應(yīng)產(chǎn)物(例如凝血蛋白上氧化的碳水化合物、活化的氨氧基水溶性聚合物等))。

關(guān)于氨氧基技術(shù)的其它信息可見于以下參考文獻(xiàn)中，各參考文獻(xiàn)全文并入本文中：EP1681303A1(HAS化的促紅細(xì)胞生成素)；WO 2005/014024(聚合物與蛋白質(zhì)經(jīng)由肟連接基團(tuán)連接的綴合物)；WO96/40662(含氨氧基連接化合物及其在綴合物中的應(yīng)用)；WO 2008/025856(經(jīng)修飾蛋白質(zhì))；Peri F等人，Tetrahedron 1998，54，12269-78：Kubler-Kielb J和Pozsgay V.，J Org Chem 2005，70，6887-90；Lees A等人，Vaccine 2006，24(6)，716-29；及Heredia KL等人，Macromoecules 2007，40(14)，4772-9。

在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，根據(jù)本文所述的氨氧基技術(shù)連接至凝血蛋白(例如FVIII、FVIIa或FIX)的氧化的碳水化合物部分的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚亞烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥基甲基亞乙基-羥基甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。

以下實(shí)施例不旨在限制，而僅示例本發(fā)明的特定實(shí)施方案。

實(shí)施例

實(shí)施例1

制備同雙官能連接基團(tuán)NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂

根據(jù)Boturyn等人(Tetrahedron 1997：53:5485-92)在兩步驟有機(jī)反應(yīng)中采用伯胺的經(jīng)改進(jìn)的加百利合成(Gabriel-Synthesis)合成含有兩個(gè)活性氨氧基的同雙官能連接基團(tuán)NH₂[OCH₂CH₂]₂ONH₂

(3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺)(圖3)。在第一步驟中，使一分子2,2-氯二乙基醚與兩分子內(nèi)式-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺在二甲基甲酰胺(DMF)中反應(yīng)。通過在乙醇中肼解自所得中間物制備所需同雙官能產(chǎn)物。

實(shí)施例2

制備同雙官能連接基團(tuán)NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂

根據(jù)Boturyn等人(Tetrahedron 1997：53:5485-92)在兩步驟有機(jī)反應(yīng)中采用伯胺的經(jīng)改進(jìn)的加百利合成來合成含有兩個(gè)活性氨氧基的同雙官能連接基團(tuán)NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂

(3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二羥基胺)(圖3)。在第一步驟中，使一分子雙-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚與兩分子內(nèi)式-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺在DMF中反應(yīng)。通過在乙醇中肼解自所得中間物制備所需同雙官能產(chǎn)物。

實(shí)施例3

制備氨氧基-PSA

將500mg自印度血清研究所(Serum Institute of India)(Pune，India)獲得的氧化PSA(MW＝18.8kD)溶解于8ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.5)中。接著，添加100mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺。在室溫下振蕩2小時(shí)后，添加44mg氰基硼氫化鈉。再在4℃下振蕩4小時(shí)后，將反應(yīng)混合物裝載于Slide-A-Lyzer(Pierce，Rockford，IL)透析盒(3.5kD膜，再生纖維素)中并用PBS(pH 7.2)透析4天。在-80℃下冷凍產(chǎn)物。圖4圖解根據(jù)此程序制備氨氧基-PSA。

制備氨氧基PSA的替代程序

將1000mg自印度血清研究所(Pune，India)獲得的氧化PSA(MW＝20kD)溶解于16ml 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中。隨后，向反應(yīng)混合物中添加170mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺。在室溫下振蕩2小時(shí)后，添加78.5mg氰基硼氫化鈉且使反應(yīng)進(jìn)行18小時(shí)過夜。隨后使用由再生纖維素制成的截留值為5kD的膜(Millipore)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行超濾/透濾程序(UF/DF)。

實(shí)施例4

使氨氧基-PSA與rFIX偶聯(lián)并純化綴合物

向溶解于6.3ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的12.6mg rFIX中添加289μl過碘酸鈉水溶液(10mM)。在4℃下在黑暗中振蕩混合物1小時(shí)并在室溫下通過添加6.5μl 1 M甘油淬滅15分鐘。通過超濾/透濾(UF/DF)采用Vivaspin(Sartorius，Goettingen，Germany)濃縮器(30kD膜，再生纖維素)移除低分子量污染物。接著，向UF/DF滲余物中添加43mg氨氧基-PSA，且在4℃下振蕩混合物18小時(shí)。利用疏水性相互作用層析(HIC)移除過量PSA試劑。冷卻的反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的5ml HiTrap Butyl FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)HIC柱(1.6×2.5cm)上。用2.4柱體積(CV)的50mM HEPES、6.7mM氯化鈣、0.005％Tween80(pH 7.4)以5ml/min的流動(dòng)速率洗脫綴合物。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FIX顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PSA-rFIX綴合物，測(cè)定出每毫克蛋白質(zhì)的比活性為80.2IU(與天然rFIX相比為其56.4％)。結(jié)果概述于表1中。

表1

圖5圖解通過SDS-PAGE利用考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)PSA-rFIX綴合物進(jìn)行的分析性表征。圖6顯示SDS-PAGE及隨后采用抗FIX和抗PSA抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡法。

實(shí)施例5

氨氧基-PSA與rFIX在苯胺作為親核性催化劑存在下的偶聯(lián)

向溶解于1.4ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的3.0mg rFIX中添加14.1μl過碘酸鈉水溶液(10mM)。在4℃下在黑暗中振蕩混合物1小時(shí)并在室溫下通過添加1.5μl 1M甘油淬滅15分鐘。借助于尺寸排阻層析(SEC)采用PD-10脫鹽柱(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)移除低分子量污染物。混合1.2mg溶解于1.33ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的氧化rFIX與70μl苯胺(200mM儲(chǔ)備水溶液)并在室溫下振蕩45分鐘。接著，添加4.0mg氨氧基-PSA，且在室溫下振蕩混合物2小時(shí)并再在4℃下振蕩16小時(shí)。在1小時(shí)后、2小時(shí)后和18小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束時(shí)抽取樣品。接著，借助于HIC移除過量PSA試劑和游離rFIX。冷卻的反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的5ml HiTrap Butyl FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)HIC柱(1.6×2.5cm)上。用20CV達(dá)到50mM HEPES、6.7mM氯化鈣、0.005％Tween 80(pH 7.4)的線性梯度以5ml/min的流動(dòng)速率洗脫綴合物。

實(shí)施例6

使氨氧基-PSA與rFIX偶聯(lián)且用NaCNBH₃還原

向溶解于5.25ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的10.5mg rFIX中添加53μl過碘酸鈉水溶液(10mM)。在4℃下在黑暗中振蕩混合物1小時(shí)并在室溫下通過添加5.3μl 1M甘油淬滅15分鐘。借助于UF/DF采用Vivaspin(Sartorius，Goettingen，Germany)濃縮器(30kD膜，再生纖維素)移除低分子量污染物。接著，向UF/DF滲余物中添加35.9mg氨氧基-PSA，且在室溫下振蕩混合物2小時(shí)。隨后添加53μl氰基硼氫化鈉水溶液(5M)，且反應(yīng)再進(jìn)行16小時(shí)。隨后，借助于HIC移除過量PSA試劑。冷卻的反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的5ml HiTrap Butyl FF HIC(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)柱(1.6×2.5cm)上。用2.4CV的50mMHEPES、6.7mM氯化鈣、0.005％Tween 80(pH 7.4)以5ml/min的流動(dòng)速率洗脫綴合物。

實(shí)施例7

使氨氧基-PSA(連接基團(tuán)：NH₂[OCH₂CH₂]₄ONH₂)與rFIX偶聯(lián)且純化綴合物

向溶解于2.8ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的5.6mg rFIX中添加102μl過碘酸鈉水溶液(10mM)。在4℃下在黑暗中振蕩混合物1小時(shí)并在室溫下通過添加2.9μl 1M甘油淬滅15分鐘。借助于UF/DF采用Vivaspin(Sartorius，Goettingen，Germany)濃縮器(30kD膜，再生纖維素)移除低分子量污染物。隨后，向UF/DF滲余物中添加19mg氨氧基-PSA，且在4℃下振蕩混合物18小時(shí)。借助于HIC移除過量PSA試劑。冷卻的反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH6.9)預(yù)平衡的5ml HiTrap Butyl FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)HIC柱(1.6×2.5cm)上。用2.4CV的50mM HEPES、6.7mM氯化鈣、0.005％Tween 80(pH 7.4)以5ml/min的流動(dòng)速率洗脫綴合物。

實(shí)施例8

使氨氧基-PSA與rFVIII偶聯(lián)

向溶解于11ml Hepes緩沖液(pH 6)(50mM Hepes，5mM CaCl₂，150mM NaCl，0.01％Tween)中的11mg rFVIII中添加57μl 10mM過碘酸鈉。在4℃下在黑暗中振蕩混合物30分鐘并在4℃下通過添加107μl 1M甘油水溶液淬滅30分鐘。隨后，添加19.8mg氨氧基-PSA(18.8kD)，且在4℃下振蕩混合物過夜。通過添加含有8M乙酸銨的緩沖液(8M乙酸銨、50mM Hepes、5mM CaCl₂、350mM NaCl、0.01％Tween 80，pH 6.9)來增加離子強(qiáng)度以得到2.5M乙酸銨的最終濃度。接著，將反應(yīng)混合物裝載于經(jīng)平衡緩沖液(2.5M乙酸銨，50mMHepes，5mM CaCl₂，350mM NaCl，0.01％Tween 80，pH 6.9)平衡的HiTrap Butyl FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)柱上。用洗脫緩沖液(50mM Hepes，5mM CaCl₂，0.01％Tween 80，pH 7.4)洗脫產(chǎn)物，且通過離心過濾使用MWCO為30,000的Vivaspin(Sartorius，Goettingen，Germany)裝置濃縮洗出液。

實(shí)施例9

血友病小鼠中的PK研究

用每公斤體重10ml體積劑量的含rFIX或PSA-rFIX(根據(jù)實(shí)施例4制備)的調(diào)配緩沖液(10mM組氨酸、260mM甘氨酸、29mM蔗糖、0.005％Tween 80，pH 6.8)注射FIX缺陷小鼠。物質(zhì)注射后5分鐘、3小時(shí)、9小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)處死各組的6只小鼠，且通過心臟穿刺收集血液。制備含檸檬酸鹽的血漿，且冷凍儲(chǔ)存直至分析FIX活性。

用顯色FIX測(cè)定(Biophen FIX測(cè)定，Hyphen Biomed，Neuville-sur-Oise，F(xiàn)rance)測(cè)定FIX活性，且構(gòu)筑消除曲線(圖7)。PSA-rFIX的實(shí)際FIX活性劑量為123IU FIX/kg，且rFIX的實(shí)際FIX活性劑量為143IU FIX/kg。用程序R(The R Foundation for Statistical Computing，2008)計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。rFIX的體內(nèi)回收率為13％，且PSA-rFIX的體內(nèi)回收率為29％。PSA-rFIX的劑量調(diào)節(jié)的AUC相對(duì)于rFIX增至6.4倍，終端半衰期增至1.2倍，且相比于rFIX，PSA-rFIX的MRT為1.7倍長(表2)。

表2

實(shí)施例10

使凝血蛋白聚唾液酸化

如本文所述的聚唾液酸化可擴(kuò)展至其它凝血蛋白。舉例而言，在本發(fā)明的各個(gè)方面中，對(duì)凝血蛋白例如FVIII、FVIIa和VWF重復(fù)用氨氧基-PSA進(jìn)行如以上實(shí)施例5、6和9中所述的聚唾液酸化。

實(shí)施例11

制備同雙官能連接基團(tuán)NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂

根據(jù)Boturyn等人(Tetrahedron 1997：53:5485-92)在兩步驟有機(jī)反應(yīng)中采用伯胺的經(jīng)改進(jìn)的加百利合成來合成含有兩個(gè)活性氨氧基的同雙官能連接基團(tuán)NH₂[OCH₂CH₂]₆ONH₂

(3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二羥基胺)。在第一步驟中，使一分子二氯化六乙二醇(hexaethylene glycol dichloride)與兩分子內(nèi)式-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺在DMF中反應(yīng)。通過在乙醇中肼解自所得中間物制備所需同雙官能產(chǎn)物。

實(shí)施例12

采用順丁烯二酰亞氨基/氨氧基連接系統(tǒng)使rFIX聚唾液酸化

A.制備修飾試劑

通過使用順丁烯二酰亞氨基/氨氧基連接系統(tǒng)制備氨氧基-PSA試劑(Toyokuni等人，Bioconjugate Chem 2003：14，1253-9)。使用兩步驟程序制備含自由末端SH-基團(tuán)的PSA-SH(20kD)：a)根據(jù)WO05016973A1通過用NH₄Cl對(duì)氧化的PSA進(jìn)行還原胺化制備PSA-NH₂，及b)如US7645860所述通過使末端伯氨基與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(尤特奇試劑(Traut'sreagent)/Pierce，Rockford，IL)反應(yīng)引入硫氫基。使用10倍摩爾過量的連接基團(tuán)及50mg/ml的PSA-SH濃度使PSA-SH與連接基團(tuán)的順丁烯二酰亞氨基在pH 7.5下在PBS緩沖液中偶聯(lián)。在室溫下在平緩振蕩下孵育反應(yīng)混合物2小時(shí)。隨后，移除過量連接試劑，且通過透濾將氨氧基-PSA緩沖液更換至氧化緩沖液(50mM磷酸鈉，pH 6.0)中。采用Pellicon XL5kD再生纖維素膜(Millipore，Billerica，MA)更換緩沖液25次。

B.在用NaIO₄事先氧化之后修飾rFIX

在50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中采用該緩沖液中的100μM過碘酸鈉對(duì)rFIX進(jìn)行氧化。在4℃下在黑暗中振蕩混合物1小時(shí)并在室溫下通過添加甘油至最終濃度為5mM來淬滅15分鐘。借助于尺寸排阻層析(SEC)采用PD-10脫鹽柱(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)移除低分子量污染物。隨后，在氧化的rFIX中摻入苯胺以獲得10mM的最終濃度，并與氨氧基-PSA試劑混合以達(dá)成5倍摩爾過量的PSA。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下保溫反應(yīng)混合物2小時(shí)。

C.純化綴合物

借助于HIC移除過量的PSA試劑和游離rFIX。反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的填充有48ml丁基-瓊脂糖FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)的柱上。接著，用40CV的線性梯度的60％洗脫緩沖液(50mM Hepes，6.7mM氯化鈣，pH 7.4)洗脫綴合物。最后，收集含PSA-rFIX的洗脫份，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Millipore)進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FIX顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于由兩種變異體制備的PSA-rFIX綴合物，測(cè)定到比活性大于天然rFIX的50％。

實(shí)施例13

制備氨氧基-PSA試劑

根據(jù)實(shí)施例3制備氨氧基-PSA試劑。使用5kD膜(再生纖維素，Millipore)用緩沖液(pH7.2)(50mM Hepes)透濾最終產(chǎn)物，在-80℃下冷凍并凍干。凍干后，將所述試劑溶解于適當(dāng)體積的水中且用于經(jīng)由碳水化合物修飾來制備PSA-蛋白質(zhì)綴合物。

實(shí)施例14

聚唾液酸化的rFVIII在FVIII缺陷敲除小鼠模型中的藥物動(dòng)力學(xué)

根據(jù)實(shí)施例8制備PSA-FVIII綴合物。綴合物顯示比活性為6237IU/mg(FVIII活性由顯色測(cè)定法測(cè)定；總蛋白質(zhì)由Bradford測(cè)定法測(cè)定)，且聚唾液酸化度為6.7(摩爾PSA/摩爾FVIII)，如由間苯二酚測(cè)定(Svennerholm L，Biochim Biophys Acta 1957：24:604-11)所測(cè)量。

使用Bi等人(Nat Genet 1995：10:119-21)詳細(xì)描述的FVIII缺陷小鼠作為重度人類A型血友病的模型。各組(每組6只小鼠)經(jīng)由尾靜脈接受劑量為每公斤體重200IU FVIII的根據(jù)實(shí)施例8制備的PSA-rFVIII或天然rFVIII(ADVATE，Baxter Healthcare公司)的快速注射(200IU FVIII/kg)。注射后5分鐘、3小時(shí)、6小時(shí)、9小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、32小時(shí)及42小時(shí)，通過麻醉后心臟穿刺自各別組制備含檸檬酸鹽的血漿。通過使用顯色測(cè)定測(cè)量血漿樣品中的FVIII活性程度。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概述于表3中且圖解于圖8中。用2.10.1版本R(一種統(tǒng)計(jì)計(jì)算用語言和環(huán)境。R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria.http://www.R-project.org.)進(jìn)行所有計(jì)算。結(jié)果，平均滯留時(shí)間(MRT)自5.4小時(shí)(Advate對(duì)照組)增至11.1小時(shí)(PSA-rFVIII綴合物)。

表3:

實(shí)施例15

氨氧基-PSA試劑的詳細(xì)合成

根據(jù)Botyryn等人(Tetrahedron 1997：53:5485-92)在實(shí)施例1中概述的兩步驟有機(jī)合成中合成3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺。

步驟1：

向內(nèi)式-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺(59.0g；1.00當(dāng)量)于700ml無水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中添加無水K₂CO₃(45.51g；1.00當(dāng)量)及2,2-二氯二乙基醚(15.84ml；0.41當(dāng)量)。在50℃下攪拌反應(yīng)混合物22小時(shí)。在減壓下蒸發(fā)混合物至干燥。將殘余物懸浮于2L二氯甲烷中，并用飽和NaCl水溶液萃取兩次(每次1L)。二氯甲烷層經(jīng)Na₂SO₄干燥，并隨后在減壓下蒸發(fā)至干燥并在高真空中干燥，得到64.5g呈黃白色固體狀的3-氧雜戊烷-1,5-二氧基-內(nèi)式-2’,3’-二羧基二酰亞胺降冰片烯(中間物1)。

步驟2：

向中間物1(64.25g；1.00當(dāng)量)于800ml無水乙醇中的溶液中添加31.0ml水合肼(4.26當(dāng)量)。隨后使反應(yīng)混合物回流2小時(shí)。通過在減壓下蒸發(fā)溶劑濃縮混合物至起始體積的一半。濾掉出現(xiàn)的沉淀。在減壓下蒸發(fā)剩余乙醇層至干燥。在真空中干燥含粗產(chǎn)物3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺的殘余物，得到46.3g。通過柱層析(硅膠60；用二氯甲烷/甲醇混合物9+1進(jìn)行等度洗脫)進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物，得到11.7g純最終產(chǎn)物3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺。

實(shí)施例16

使用PSA酰肼使rFIX聚唾液酸化

通過使用使氧化PSA與己二酸二酰肼(ADH)反應(yīng)制備的PSA酰肼試劑使rFIX聚唾液酸化。

步驟1：制備PSA酰肼

將500mg自印度血清研究所(Pune，India)獲得的氧化PSA(MW＝20kD)溶解于8ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.5)中。隨后添加100mg己二酸二酰肼(ADH)。平緩振蕩溶液2小時(shí)。隨后添加44mg氰基硼氫化鈉。再在4℃下孵育反應(yīng)物4小時(shí)后，將反應(yīng)混合物裝載于Slide-A-Lyzer(Pierce，Rockford，IL)透析盒(3.5kD膜，再生纖維素)中并用PBS(pH 7.2)透析4天。在-80℃下冷凍產(chǎn)物。

步驟2：使PSA酰肼與rFIX反應(yīng)且純化綴合物

通過使用如步驟1中所述的PSA酰肼試劑使rFIX聚唾液酸化。在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下用NaIO₄(濃度：80μM)氧化rFIX(濃度：1mg/ml)1小時(shí)。通過添加甘油終止反應(yīng)，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Vivaspin)對(duì)氧化的FIX進(jìn)行UF/DF。隨后使用200倍摩爾過量的試劑及1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度在pH 6.5下使氧化的rFIX聚唾液酸化。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下保溫rFIX及聚唾液酸化試劑2小時(shí)。最后，利用HIC純化PSA-rFIX綴合物。通過添加含乙酸銨的緩沖液(50mM Hepes，350mM NaCl，5mM氯化鈣，8M乙酸銨，0.01％Tween 80，pH 6.9)使反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至130mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM Hepes、2.5M乙酸銨、350mM氯化鈉、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的HiTrap Butyl FF柱(5ml，GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)上。接著，用50mM Hepes、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 7.4)洗脫綴合物。最后，收集含PSA-rFIX的洗脫份，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Vivaspin)進(jìn)行UF/DF。對(duì)于PEG-rFIX綴合物，測(cè)定到比活性大于天然rFIX的50％(顯色測(cè)定)。

實(shí)施例17

使用PSA酰肼在苯胺作為親核性催化劑存在下使rFIX聚唾液酸化

將123mg rFIX溶解于60ml磷酸鹽緩沖液(50mM NaPO₄，pH 6.5)緩沖液中。隨后添加1.2ml過碘酸鈉水溶液(10mM)，且在4℃下在黑暗中在平緩攪拌下保溫混合物1小時(shí)。接著，通過添加600μl 1M甘油水溶液在室溫下淬滅反應(yīng)15分鐘。接著采用Pellicon XL Ultracel 30 kD膜對(duì)混合物進(jìn)行UF/DF。

用59.6ml磷酸鹽緩沖液(50mM NaPCU，pH 6.0)進(jìn)一步稀釋含氧化的rFIX的UF/DF滲余物(63.4ml)，且與6.5ml苯胺水溶液(200mM)混合并在室溫下保溫30分鐘。隨后添加12.3ml PSA-酰肼試劑(根據(jù)實(shí)施例16制備)，得到5倍摩爾試劑過量。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下孵育此混合物2小時(shí)。

借助于HIC移除過量的PSA-酰肼試劑和游離rFIX。反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的填充有48ml丁基-瓊脂糖FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)的柱上。接著，用50mMHepes、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 7.4)洗脫綴合物。最后，收集含PSA-rFIX的洗脫份，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Millipore)進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FIX顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PSA-rFIX綴合物，測(cè)定到比活性大于天然rFIX的50％。

實(shí)施例18

使rFIX聚唾液酸化并使用兩步驟程序純化

將140mg rFIX溶解于62ml磷酸鹽緩沖液(50mM NaPO₄，pH 6.0)緩沖液中。隨后添加1.92ml過碘酸鈉水溶液(10mM)，且在4℃下在黑暗中在平緩攪拌下保溫混合物1小時(shí)，且在室溫下通過添加64μl 1M甘油水溶液淬滅15分鐘。接著采用Pellicon XL Ultracel 30kD膜對(duì)混合物進(jìn)行UF/DF。

用73.8ml磷酸鹽緩沖液(50mM NaPCU，pH 6.0)進(jìn)一步稀釋含氧化的rFIX的UF/DF滲余物(69.4ml)，與8.2ml苯胺水溶液(200mM)混合并在室溫下保溫30分鐘。隨后添加12.3ml氨氧基試劑(根據(jù)實(shí)施例3制備)，得到2.5倍摩爾試劑過量。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下保溫此混合物2.5小時(shí)。

借助于陰離子交換層析(AIEC)移除游離rFIX。用20ml緩沖液A(50mM Hepes，5mMCaCl₂，pH 7.5)稀釋反應(yīng)混合物，且裝載于經(jīng)緩沖液A預(yù)平衡的Q-瓊脂糖FF 26/10柱(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)上。隨后用緩沖液B(50mM Hepes，1M NaCl，5mM CaCl₂，pH 7.5)洗脫柱。游離rFIX在導(dǎo)電率介于12-25mS/cm之間時(shí)洗脫，且綴合物在導(dǎo)電率介于27-45mS/cm之間時(shí)洗脫。接著通過添加緩沖液C(50mM Hepes，5M NaCl，5mM CaCl₂，pH 6.9)使含綴合物的洗脫份的導(dǎo)電率上升至190mS/cm，且將其裝載于經(jīng)緩沖液D(50mM Hepes，3M NaCl，5mM CaCl₂，pH 6.9)預(yù)平衡的丁基瓊脂糖FF 26/10柱(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)上。用5CV緩沖液D洗除游離PSA-試劑。接著，用100％緩沖液E(50mM Hepes，5mM CaCl₂，pH 7.4)洗脫綴合物。使用由再生纖維素制成的10kD膜(88cm²，截留值為10kD/Millipore)進(jìn)行UF/DF來濃縮含綴合物的洗脫份。用含有150mM NaCl和5mM CaCl₂的組氨酸緩沖液(pH7.2)進(jìn)行最后的透濾步驟。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FIX顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PSA-rFIX綴合物，測(cè)定到比活性大于天然rFIX的50％。

實(shí)施例19

使氨氧基-PSA與rFVIIa偶聯(lián)且純化綴合物

混合10mg rFVIIa于5ml反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH6.0)中的溶液與NaIO₄水溶液(最終濃度：100μM)，且在4℃下在黑暗中在平緩攪拌下保溫1小時(shí)，且通過添加半胱氨酸水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物(10ml)中添加30倍摩爾過量的氨氧基試劑(根據(jù)實(shí)施例1制備)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。通過HIC移除過量氨氧基試劑。通過添加含乙酸銨的緩沖液(50mM Hepes，350mM NaCl，5mM氯化鈣，8M乙酸銨，0.01％Tween 80，pH 6.9)使反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至130mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM Hepes、2.5M乙酸銨、350mM氯化鈉、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的HiTrap Butyl FF柱(5ml，GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)上。接著，用50mM Hepes、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH7.4)通過20CV的100％洗脫緩沖液的線性梯度洗脫綴合物。最后，收集含PSA-rFVIIa的洗脫份，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Vivaspin)進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FVIIa顯色活性(Staclot測(cè)定，Diagnostica Stago，Asnieres，F(xiàn)rance)對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征，且顯示比活性大于rFVIIa起始物質(zhì)的20％。

實(shí)施例20

氨氧基-PSA與rFVIIa在苯胺作為親核性催化劑存在下的偶聯(lián)

向溶解于1.4ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的3.0mg rFVIIa中添加14.1μl過碘酸鈉水溶液(10mM)。在4℃下在黑暗中振蕩混合物1小時(shí)并在室溫下通過添加1.5μl 1M甘油淬滅15分鐘。借助于尺寸排阻層析(SEC)采用PD-10脫鹽柱(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)移除低分子量污染物?；旌先芙庥?ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的3mg氧化rFVIIa與苯胺(一種親核性催化劑，最終濃度：10mM)并在室溫下振蕩30分鐘。接著，添加氨氧基-PSA以得到5倍摩爾過量，且在室溫下振蕩混合物2小時(shí)。接著，借助于HIC移除過量PSA試劑和游離rFIX。冷卻的反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至180mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mM HEPES、3M氯化鈉、6.7mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的5ml HiTrap Butyl FF(GEHealthcare，F(xiàn)airfield，CT)HIC柱(1.6×2.5cm)上。用20CV的50mM HEPES、6.7mM氯化鈣、0.005％Tween 80(pH 7.4)的線性梯度以5ml/min的流動(dòng)速率洗脫綴合物。

實(shí)施例21

制備氨氧基-PEG試劑

使用分支PEG-醛(MW 40kD)與如實(shí)施例1所述制備的二氨氧基連接基團(tuán)偶聯(lián)。此PEG-醛試劑可獲自NOF(NOF Corp.，Tokyo，Japan)。將500mg PEG-醛溶解于8ml 50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.5)中。隨后，添加100mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二羥基胺。在室溫下振蕩2小時(shí)后，添加44mg氰基硼氫化鈉。再在4℃下振蕩4小時(shí)后，將反應(yīng)混合物裝載于Slide-A-Lyzer(Pierce，Rockford，IL)透析盒(3.5kD膜，再生纖維素)中并用PBS(pH 7.2)透析4天。在-80℃下冷凍產(chǎn)物。

實(shí)施例22

用氨氧基PEG試劑使rFIX聚乙二醇化

通過使用含氨氧基的線性20kD聚乙二醇化試劑使rFIX聚乙二醇化。此類型試劑的實(shí)例為來自NOF的CA系列(NOF Corp.，Tokyo，Japan)。在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下在反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.0)中在2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度下用NaIO₄(最終濃度：100μM)氧化rFIX 1小時(shí)且通過添加甘油水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物中添加3倍摩爾過量的氨氧基試劑和苯胺(親核性催化劑，最終濃度：10mM)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。最后，通過在Q-瓊脂糖FF上進(jìn)行的離子交換層析純化PEG-rFIX綴合物。將每毫升凝膠1.5毫克蛋白質(zhì)加載于經(jīng)50mM Tris(pH 8.0)預(yù)平衡的柱上。用20CV 50mM Tris和1M氯化鈉(pH 8.0)洗脫綴合物，并隨后使用30kD膜進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FIX顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PEG-rFIX綴合物，測(cè)定到比活性大于天然rFIX的75％。

實(shí)施例23

用氨氧基PEG試劑使rFVIII聚乙二醇化

通過使用含氨氧基的線性20kD聚乙二醇化試劑使rFVIII聚乙二醇化。此類型試劑的實(shí)例為來自NOF的CA系列(NOF Corp.，Tokyo，Japan)。在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下在反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.0)中在1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度下用NaIO₄(最終濃度：100μM)氧化rFVIII 1小時(shí)且通過添加半胱氨酸水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物中添加20倍摩爾過量的氨氧基試劑和苯胺(親核性催化劑，最終濃度：10mM)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。最后，通過在Q-瓊脂糖FF上進(jìn)行的離子交換層析純化PEG-rFVIII綴合物。將每毫升凝膠1.5mg蛋白質(zhì)加載于經(jīng)含5mM CaCl₂的50mM Hepes緩沖液(pH 7.4)預(yù)平衡的柱上。用含5mM CaCl₂和500mM氯化鈉的50mM Hepes緩沖液(pH 7.4)洗脫綴合物，并隨后使用30kD膜進(jìn)行UF/DF。通過FVIII顯色測(cè)定對(duì)綴合物進(jìn)行的分析性表征和測(cè)定總蛋白質(zhì)(BCA測(cè)定)顯示比活性大于rFVIII起始物質(zhì)的60％。

實(shí)施例24

用氨氧基PEG試劑使rFVIIa聚乙二醇化

通過使用含氨氧基的線性20kD聚乙二醇化試劑使rFVIIa聚乙二醇化。此類型試劑的實(shí)例為來自NOF的CA系列(NOF Corp.，Tokyo，Japan)。在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下在反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.0)中在2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度下用NaIO₄(最終濃度：100μM)氧化rFVIIa 1小時(shí)且通過添加甘油水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物中添加5倍摩爾過量的氨氧基試劑和苯胺(親核性催化劑，最終濃度：10mM)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。最后，通過在Q-瓊脂糖FF上進(jìn)行的離子交換層析純化PEG-rFVIIa綴合物。將每毫升凝膠1.5毫克蛋白質(zhì)加載于經(jīng)含1mM CaCl₂的20mM Hepes緩沖液(pH 7.4)預(yù)平衡的柱上。用含1mM CaCl₂和500mM氯化鈉的20mM Hepes緩沖液(pH 7.4)洗脫綴合物，并隨后使用30kD膜進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量FVIIa活性(Staclot測(cè)定，Diagnostica Stago，Asnieres，F(xiàn)rance)和總蛋白質(zhì)(BCA測(cè)定)對(duì)綴合物進(jìn)行的分析性表征顯示比活性大于rFVIIa起始物質(zhì)的25％。

實(shí)施例25

用PEG-酰肼試劑使rFIX聚乙二醇化

通過使用含酰肼基的線性20kD聚乙二醇化試劑使rFIX聚乙二醇化。此類型試劑的實(shí)例為來自NOF的HZ系列(NOF Corp.，Tokyo，Japan)。在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下在反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.0)中在2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度下用NaIO₄(最終濃度：100μM)氧化rFIX 1小時(shí)且通過添加甘油水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物中添加50倍摩爾過量的酰肼試劑和苯胺(親核性催化劑，最終濃度：10mM)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。最后，通過在Q-瓊脂糖FF上進(jìn)行的離子交換層析純化PEG-rFIX綴合物。將反應(yīng)混合物裝載于經(jīng)50mM Tris緩沖液(pH 8.0)預(yù)平衡的柱(每毫升凝膠1.5mg蛋白質(zhì))上。用20CV Tris緩沖液(pH 8.0)(50mM Tris，1M NaCl)洗脫綴合物，并隨后使用30kD膜進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FIX顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PEG-rFIX綴合物，測(cè)定到比活性大于天然rFIX的50％(顯色測(cè)定)。

實(shí)施例26

在2mM苯胺存在下使rFVIII聚唾液酸化

將rFVIII轉(zhuǎn)移至反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，350mM氯化鈉，5mM氯化鈣，0.01％Tween80，pH 6)中，稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml且在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下在反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.0)中用NaIO₄(最終濃度：100μM)氧化1小時(shí)，且通過添加半胱氨酸水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物中添加20倍摩爾過量的氨氧基試劑和苯胺(親核性催化劑，最終濃度：2mM)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。借助于HIC移除過量氨氧基試劑。通過添加含乙酸銨的緩沖液(50mM Hepes，350mM氯化鈉，5mM氯化鈣，8M乙酸銨，0.01％Tween 80，pH 6.9)使反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至130mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mMHepes、2.5M乙酸銨、350mM氯化鈉、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的填充有53ml丁基-瓊脂糖FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)的柱上。接著，用50mM Hepes、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 7.4)洗脫綴合物。最后，收集含PSA-rFIX的洗脫份，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Millipore，Billerica，MA)進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FVIII顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PSA-rFVIII綴合物，測(cè)定到比活性為天然rFVIII的80％。

實(shí)施例27

在10mM苯胺存在下使rFVIII聚唾液酸化

將rFVIII轉(zhuǎn)移至反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，350mM氯化鈉，5mM氯化鈣，0.01％Tween80，pH 6)中，稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml且在4℃下在黑暗中在平緩振蕩下在反應(yīng)緩沖液(50mM Hepes，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.0)中用NaIO₄(最終濃度：100μM)氧化1小時(shí)，且通過添加半胱氨酸水溶液(最終濃度：1mM)淬滅15分鐘。接著，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行UF/DF。向滲余物中添加20倍摩爾過量的氨氧基試劑和苯胺(親核性催化劑，最終濃度：10mM)。在室溫下在黑暗中在平緩振蕩下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。借助于HIC移除過量氨氧基試劑。通過添加含乙酸銨的緩沖液(50mM Hepes，350mM氯化鈉，5mM氯化鈣，8M乙酸銨，0.01％Tween 80，pH 6.9)使反應(yīng)混合物的導(dǎo)電率上升至130mS/cm，且將其裝載于經(jīng)50mMHepes、2.5M乙酸銨、350mM氯化鈉、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 6.9)預(yù)平衡的填充有53ml丁基-瓊脂糖FF(GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT)的柱上。接著，用50mM Hepes、5mM氯化鈣、0.01％Tween 80(pH 7.4)洗脫綴合物。最后，收集含PSA-rFIX的洗脫份，且使用由再生纖維素制成的30kD膜(Millipore，Billerica，MA)進(jìn)行UF/DF。通過測(cè)量總蛋白質(zhì)(BCA)和FVIII顯色活性對(duì)所述制劑進(jìn)行分析性表征。對(duì)于PSA-rFVIII綴合物，測(cè)定到比活性為天然rFVIII的80％。

實(shí)施例28

使用分支PEG使凝血蛋白聚乙二醇化

凝血蛋白(例如實(shí)施例22-25中所述的FIX、FVIII和FVIIa)的聚乙二醇化可擴(kuò)展至實(shí)施例21中所述的由醛和含活性氨氧基的適合連接基團(tuán)制成的分支或線性聚乙二醇化試劑。