本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種表達pedv的s+n雙基因的真核表達載體。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrheaped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病，是導致世界各養(yǎng)豬國家仔豬早期死亡的重要疫病之一。該病自1971年英國首次報道，隨后世界各國均有發(fā)生，我國于1980年首次報道該病以來，全國各地陸續(xù)有ped發(fā)生的報道。隨著pedv滅活疫苗、弱毒疫苗和單基因核酸疫苗的陸續(xù)問世和應(yīng)用，ped在一定程度上得到控制，但還是仍有發(fā)生。隨著10多年的光陰流逝，近年來，由于pedv的基因變異，導致再次爆發(fā)席卷全球，于2007年開始首先在泰國、韓國和越南等國家流行，隨后于蔓延至中國、日本和美國等養(yǎng)豬國家。由于該病來勢兇猛，且臨床癥狀比以往更為嚴重，發(fā)病率高達100％，死亡率在80％以上，尤其是對7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，死亡率高達100％，危害極大。pedv含有4個結(jié)構(gòu)蛋白，分別為s、m、n及e蛋白。有關(guān)研究表明，變異pedv的s基因與attenuateddr13弱毒株和cv777標準株的同源性分別為93.7％～94.1％和93.8％～94.1％，同cv777標準株比較，存在64個氨基酸突變，其中有3個氨基酸較以往國內(nèi)外流行毒株不一樣，為新變異新氨基酸，5氨基酸的插入和2個氨基酸缺失；雖然n基因比較保守，但也存在氨基酸變異。基于目前變異pedv為新的流行毒株，因此建立相應(yīng)的診斷技術(shù)及研制新型基因工程疫苗意義重大。目前，已見通過pedv的單個基因如n、s及m基因段片，通過原核表達方法表達出單基因蛋白，但未見通過pedv的s和n基因片段，利用blunt-m2哺乳動物真核表達載體，通過無縫克隆技術(shù)，構(gòu)建出pedv的s+blunt-m2+n的融合雙基因真核表達載體。因此，一種構(gòu)建pedv的s+n融合雙基因表達載體方法的建立，對今后開展該病的診斷技術(shù)及基因工程疫苗研究，具有重要意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種表達pedv的s+n雙基因的真核表達載體及其制備方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供了一種表達pedv的s+n雙基因的真核表達載體，其包含如seq.id.no：1所示的核苷酸序列。

所述真核表達載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分析pedv的s基因序列并截取具有中和抗原表位的基因片段，根據(jù)截取的pedv的s基因序列，結(jié)合n基因及peasy-blunt-m2載體基因的序列，設(shè)計與合成特異性引物；

(2)以pedv的cdna為模板，通過pcr技術(shù)分別出擴增s與n基因片段，并進行回收純化；

(3)將純化的s基因片段連接到blunt-m2載體上，構(gòu)建出s+blunt-m2質(zhì)粒；

(4)以s+blunt-m2質(zhì)粒為模板，擴增質(zhì)粒的基因片段，回收純化s+blunt-m2基因片段，采用peasy-uniseamlesscloningandassemblykit，通過無縫克隆技術(shù)將s+blunt-m2基因與n基因片段進行重組連接，將連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化至trans1-t1感受態(tài)細胞中，涂布于氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，提取s+blunt-m2+n質(zhì)粒進行測序鑒定，構(gòu)建出表達pedv的s+n雙基因的真核表達載體。

所述pedv指的是變異豬流行性腹瀉病毒。

其中步驟(1)所述特異性引物序列如下：

a、s

s-f:atggttactttgccatcattcaa

s-r:agaaacgtccgtgacacctt

b、s+m2

m2-f:aagggcgatccggaacaaaaa

m2-r:agaaacgtccgtgacacctt

c、n

n-f:aaggtgtcacggacgtttctgcttctgtcagctttcagga

n-r:tttttgttccggatcgcccttatttcctgtatcgaagatct。

本發(fā)明還提供了構(gòu)建的真核表達載體在制備pedv疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：本發(fā)明是直接將純化pedv的s基因片段連接到blunt-m2哺乳動物真核表達載體中，不需要連接至單克隆載體pmd19-t中，然后s+blunt-m2質(zhì)粒通過無縫克隆技術(shù)，拼接n基因片段，從而獲得s+n雙基因融合表達載體。因此，該真核表達載體的制備比較其他真核表達技術(shù)，具有操作步驟簡單、反應(yīng)時間短等特點，適合雙基因融合蛋白表達。

附圖說明

下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

圖1是s基因片段擴增結(jié)果。

圖2是s+m2陽性克隆鑒定結(jié)果。

圖3是s+m2和n片段分別pcr擴增結(jié)果。

圖4是s+m2和s+n片段無縫拼接的菌落pcr鑒定結(jié)果。

圖5是大量表達m2-s+nwb結(jié)果圖；圖中標號：1空載質(zhì)粒(m2)，2構(gòu)建質(zhì)粒(s+m2+n)，3未轉(zhuǎn)染的細胞后，m蛋白marker。

具體實施方式

實施例1

實施本發(fā)明的技術(shù)前需要克服以下技術(shù)難題：引物設(shè)計，分析pedv的s基因序列并截取具有較多中和抗原表位的基因片段，根據(jù)截取pedv的s基因序列，結(jié)合n基因及blunt-m2載體基因的序列，設(shè)計與合成特異性引物。

生物材料來源：peasy-bluntm2表達載體、peasy-uniseamlesscloningandassemblykit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

一、根據(jù)pedv的s和n基因及blunt-m2+m質(zhì)粒序列，設(shè)計合成相關(guān)擴增引物，序列如下表1。

表1引物序列

二、rt反應(yīng)：以pedv(該病毒株來源于2013年福建某規(guī)模豬場發(fā)生pedv的哺乳小豬的小腸，將小腸用pbs液研磨，吸取上清，采用商品化試劑盒提取rna)的rna為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，合成cdna,其體系如下表2。

表2反轉(zhuǎn)錄體系

反應(yīng)條件：25℃10min；50℃30min；85℃5s。

三、s片段的pcr擴增：以cdna為模板，進行pcr擴增，擴增體系如下表3。

表3m片段的pcr擴增體系

反應(yīng)條件如下：

通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，獲得目的片段423bp，如圖1所示。

四、s基因片段連接至m2載體

1、連接體系如下：2.0μls片段，1.0μlblunt-m2載體，使用ddh2o補齊體積至5.0μl,25℃連接10min；

2、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至trans1-t1感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30min；

3、42℃熱激30s，立即置于冰上2min；

4、加入平衡至室溫的lb培養(yǎng)基，250rpm，37℃培養(yǎng)1h；

5、4000rpm離心1min，棄掉部分上清，保留100μl，輕彈重懸后涂于amp+抗性平板上，37℃培養(yǎng)過夜；

6、分別挑單克隆菌株至10μl無菌水中，渦旋混勻后進行pcr鑒定，反應(yīng)體系如下表4。

表4pcr反應(yīng)體系

反應(yīng)條件如下：

7、使用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，發(fā)現(xiàn)目的片段579bp，如圖2所示。取陽性菌落送測序公司測序，之后進行序列比對，取比對目的質(zhì)粒作為模板進行pcr擴增，獲得線性載體。

五、s+m2片段的pcr擴增

以s+m2質(zhì)粒為模板，進行擴增，擴增體系如下表5。

表5擴增體系

反應(yīng)體系如下，使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，獲得目的條帶，如圖3所示。

六、n片段的pcr擴增

以pedv的cdna為模板，進行擴增，擴增體系如下表6。

表6擴增體系

反應(yīng)體系如下,使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物,獲得目的片段，如圖3所示。

七、純化片段

分別膠回收純化pcr擴增的n片段和pcr擴增的s+m2片段，采用純化試劑盒進行純化。

八、無縫拼接

1.以peasy-uniseamlesscloningandassemblykit推薦體系進行重組反應(yīng)，連接體系如下：2×assemblymix5μl；純化回收n片段2μl；純化回收s+m2片段3μl；于pcr儀中50℃連接15min；

2.連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化trans1-t1感受態(tài)細胞中；

3.42℃熱激30s，冰上靜置2min，加入400μllb培養(yǎng)基中，37℃200rpm搖菌1h；

4.取搖好的菌液4000rpm離心1min后棄部分上清，取菌株吹懸后涂于含amp+抗性的lb平板上，在37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜；

5.18h后從培養(yǎng)箱中取出平板，隨機挑取轉(zhuǎn)化后生長的感受態(tài)，菌落pcr鑒定陽性單克隆，獲得目的片段如圖4所示；

6.陽性克隆搖菌后測序，核苷酸序列如seq.id.no：1所示。

同源性在98.0％，說明拼接重組準確,獲得pedv的s+blunt-m2+n融合雙基因真核表達載體。

九、大提質(zhì)粒

取測序正確s+m2+n的活菌經(jīng)過活化后轉(zhuǎn)接入lb氨芐抗性培養(yǎng)基，放入搖床37℃、200rpm培養(yǎng)16h后，收集菌液提取質(zhì)粒。

十、轉(zhuǎn)染

(1)細胞接種

將293t細胞接種至細胞培養(yǎng)平皿中，培養(yǎng)12-24h，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達到70％匯合度；

(2)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的稀釋

經(jīng)去內(nèi)毒素s+m2+n質(zhì)粒和m2空載質(zhì)粒，質(zhì)粒稀釋于50μlopti-mem培養(yǎng)基中，transinel轉(zhuǎn)染試劑加入量為16μl，將轉(zhuǎn)染試劑加入上述含有稀釋質(zhì)粒的opti-mem培養(yǎng)基中，輕柔混勻室溫靜置20min；

(3)轉(zhuǎn)染

分別將加培養(yǎng)基、含空載質(zhì)粒-transinel轉(zhuǎn)染試劑混合物和含s+m2+n質(zhì)粒-transinel轉(zhuǎn)染試劑混合物加入細胞，于37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48h后，細胞沒有出現(xiàn)萎縮脫落，說明細胞生長狀態(tài)良好，不會影響蛋白的表達，然后提取細胞總蛋白。

十一、wb驗證目的蛋白的表達情況

細胞總蛋白提取

收集構(gòu)建質(zhì)粒(s+m2+n)和空載質(zhì)粒(m2)轉(zhuǎn)染細胞及未轉(zhuǎn)染的細胞后，分別提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度為4.35mg/ml。

使用分離膠濃度為10％的膠進行sds-page電泳，上樣品為20ug,200v恒壓電泳45min。

轉(zhuǎn)膜：使用pvdf膜進行轉(zhuǎn)膜，100v恒壓轉(zhuǎn)膜1h。

封閉：使用5％的脫脂牛奶(0.5％tbst稀釋)，37℃封閉2h。

一抗孵育：使用0.5％tbst稀釋一抗(pedv兔抗高免血清)，稀釋比例為1:4000，4℃過夜孵育。

洗滌：使用tbst洗滌4次，每次10min。

二抗孵育：使用0.5％tbst稀釋二抗(pedv抗兔hrp酶)，稀釋比例1:4000，室溫晃動孵育2h。

顯色：使用tbst洗4次，每次10min，采用化學發(fā)光成像儀進行檢測，成功獲得表達蛋白目的片段65kd左右，如圖5所示。表達蛋白對pedv兔抗高免血清具有反應(yīng)，說明表達蛋白具有免疫原性。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實施方式，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用于對本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求所保護的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>表達pedv的s+n雙基因的真核表達載體

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1743

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gttactttgccatcattcaatgaccattcttttgttaatattactgtctttgcgtccttt60

ggtggtcatagtggtgccaacctcattgcatctgacactactatcaatgggtttagttct120

ttctgtgttgacactagacaatttaccatttcactgttttataacgttacaaacagttat180

ggttatgtgtctaattcacaggatagtaattgccctttcaccttgcaatctgttaatgat240

tacctgtcttttagtaaattttgtgtttccaccagccttttggctagtgcctgtaccata300

gacctttttggttaccctgagtttggtagtggtgttaagtttacgtccctttactttcaa360

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gatccaaatgtagagcttcttgtttcacaggtggatgcatttaaaactgggaatgcaaaa1560

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gccatctacgatgatgtgggtttgccatctgattcgactcatgccaatttggaatgggat1680

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<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tttttgttccggatcgcccttatttcctgtatcgaagatct41