專利名稱：人胱抑素c真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)、純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及利用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組人胱抑素C表達(dá)、 純化的方法。
背景技術(shù)：
胱抑素C基因?qū)佟翱醇一颉?，能在幾乎所有的有核?xì)胞表達(dá)，無(wú)組織學(xué)特異性，故 機(jī)體胱抑素產(chǎn)生率相當(dāng)恒定。因胱抑素是一種低分子量蛋白質(zhì)，可經(jīng)腎小球自由濾過(guò)，在近 曲小管被重吸收并降解，腎臟是清除循環(huán)中胱抑素的唯一器官，所以血清胱抑素濃度主要 由腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)決定，由此可見(jiàn)胱抑素是一種理想的反映GFR變化的內(nèi)源性標(biāo)志物。目前有很多關(guān)于人胱抑素C重組及表達(dá)的方法，但都是利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)， 另外一個(gè)事實(shí)是市售的胱抑素C單抗在建立胱抑素C檢測(cè)方法時(shí)，絕大多數(shù)抗體都存在特 異性差、靈敏度低的缺點(diǎn)。我們認(rèn)為利用原核系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)過(guò)程中，由于缺乏與天然胱 抑素C相同的表達(dá)環(huán)境導(dǎo)致重組的胱抑素C與天然胱抑素C結(jié)構(gòu)有差異之處，導(dǎo)致制備出 來(lái)的單抗存在識(shí)別天然胱抑素C特異性差和靈敏度低的缺點(diǎn)。為此我們選擇真核表達(dá)系統(tǒng)模擬天然胱抑素C的表達(dá)環(huán)境可選用CHO等真核表達(dá) 系統(tǒng)進(jìn)行人胱抑素C表達(dá)、純化。CHO表達(dá)系統(tǒng)具有以下的優(yōu)點(diǎn)(1)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能 方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可貼壁生長(zhǎng)，又可以懸浮培養(yǎng)，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；(3)具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力，外源蛋白的整合穩(wěn)定；(4)具有產(chǎn)物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離 純化；(5)能以懸浮培養(yǎng)方式或在無(wú)血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度培養(yǎng)。且培養(yǎng)體積能達(dá)到 1000L以上，可以大規(guī)模生產(chǎn)。本方法利用真核表達(dá)系統(tǒng)克服了原核表達(dá)的缺點(diǎn)獲得了高活性的重組人胱抑素C 蛋白，為獲得高質(zhì)量抗體提供了有力的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是建立一種人胱抑素C真核表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)、純化 的方法，包括下述步驟1)首先設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法以帶有胱抑素基因的原核表達(dá)載體為模板 擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的基因片段。2)經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶的消化在連接酶的作用下與用同樣限制性內(nèi)切酶消化過(guò)的 真核表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過(guò)鑒定獲得帶有胱抑素C基因片段的重組子。3)利用獲得的正確重組子擴(kuò)增純化得到的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染方法的作用下，進(jìn)入真核細(xì)
3胞中進(jìn)行表達(dá)。4)利用蛋白的物理性質(zhì)通過(guò)色譜柱將目的蛋白純化，使目的蛋白獲得較高的純度。5)使用市售高質(zhì)量胱抑素C檢測(cè)試劑檢測(cè)目的蛋白的測(cè)定值和理論值的差異。所述真核表達(dá)載體是具有可以攜帶基因片段并可以通過(guò)調(diào)控元件在真核表達(dá)系 統(tǒng)調(diào)控表達(dá)攜帶基因片段的分子生物學(xué)載體工具。更進(jìn)一步的說(shuō)是可以通過(guò)信號(hào)肽進(jìn)行分 泌或不帶有信號(hào)肽進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)的載體或者可以通過(guò)包裝病毒進(jìn)行感染宿主細(xì)胞將攜帶 基因整合到宿主基因組而進(jìn)行該基因表達(dá)的載體。本發(fā)明不限制選擇使用載體，在進(jìn)一步 的試驗(yàn)中我們選擇使用pcDNA3. 1(+)載體。所述的真核表達(dá)系統(tǒng)是可以適合外源基因表達(dá)的所有真核細(xì)胞，本發(fā)明不限制 選擇使用宿主細(xì)胞，在進(jìn)一步的試驗(yàn)中我們選擇使用CHO細(xì)胞系。所述的轉(zhuǎn)染方法是指可以促進(jìn)外源質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞的方法，其包括化學(xué)轉(zhuǎn)染和 物理方法轉(zhuǎn)染。再進(jìn)一步的試驗(yàn)中我們選擇了化學(xué)方法中的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染。 所述的純化是指利用蛋白的物理性質(zhì)通過(guò)色譜柱將目的蛋白純化，使目的蛋白獲 得較高的純度。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中我們使用親和層析柱利用蛋白的his標(biāo)簽對(duì)目的蛋白進(jìn) 行一步法純化。得到蛋白純度超過(guò)95%。所述的檢測(cè)是利用能夠?qū)﹄滓炙谻進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑對(duì)目的蛋白進(jìn)行含量的 測(cè)定。進(jìn)一步的試驗(yàn)中我們使用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。


1、純化后重組胱抑素C的SDS-PAGE圖。圖1，純化后重組胱抑素C的SDS-PAGE 圖。2、利用胱抑素C膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒進(jìn)行分析的結(jié)果。圖2，北京九強(qiáng)胱抑素 C校準(zhǔn)工作曲線；圖3，純化的胱抑素C系列稀釋后理論與測(cè)定值比較。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1胱抑素C真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)、純化(1)胱抑素C真核表達(dá)載體的構(gòu)建。按照胱抑素C的序列設(shè)計(jì)引物上游引物ATCGGGATCCTCCAGTCCTGGCAAG下游弓丨物 CGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGGC GTCCTGACAGGT其中在上游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，在下游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)及6X組 氨酸標(biāo)簽(劃線部分表示)。以56度為退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收后，進(jìn)行酶切，與同 樣用BamHI、EcoRI消化的pcDNA3. 1 (+)載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，選 擇陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序鑒定。(2)胱抑素C在CHO細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定正確的克隆，大量制備質(zhì)粒，使用IipofectAMINE試劑，依據(jù)說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入G418 (0. 8mg/ml)，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，將培養(yǎng)體系增大到1L，經(jīng)過(guò)72小時(shí)的培養(yǎng)收集細(xì)胞，采用超聲破碎法破碎細(xì)胞，離心后收集上清，使用M柱進(jìn)行親和層析。經(jīng) 過(guò)SDS-PAGE分析，蛋白大小為13KD左右，與理論值相同。產(chǎn)量為:3mg/L。根據(jù)SDS-PAGE的 條帶灰度估算蛋白濃度后，將蛋白濃縮到3mg/ml。實(shí)施例2使用北京九強(qiáng)公司胱抑素C檢測(cè)試劑盒對(duì)純化蛋白進(jìn)行測(cè)定(1)先用邁瑞B(yǎng)S300全自動(dòng)生化儀按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所說(shuō)的方法步驟進(jìn)行校準(zhǔn)， 其工作曲線見(jiàn)附圖2。(2)將純化后的蛋白用蛋白保護(hù)液稀釋到約8. 50 μ g/ml，用以上曲線測(cè)定三次， 結(jié)果均值為7. 80 μ g/ml。(3)用蛋白保護(hù)液將上面測(cè)定的蛋白倍比稀釋成一系列值(包括原濃度和0濃 度的蛋白保護(hù)液)，即 7. 80 μ g/ml，7. 02 μ g/ml ,6. 24 μ g/ml，5. 46 μ g/ml，4. 68 μ g/ml， 3. 90 μ g/ml ,3. 12 μ g/ml，2· 34 μ g/ml，1· 56 μ g/ml，0· 78 μ g/ml，0 μ g/ml。(4)然后用生化儀對(duì)以上各濃度值測(cè)定三次取平均值，相關(guān)系數(shù)R > 0. 99，理論稀 釋值與測(cè)定值比較圖見(jiàn)附圖3。
權(quán)利要求
1.人胱抑素C真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)、純化
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，它是具有可以攜帶基因片段并可以 通過(guò)調(diào)控元件在真核表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)攜帶基因片段的分子生物學(xué)載體工具。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，包括不限于pcDNA3.1等可以通過(guò)信 號(hào)肽進(jìn)行分泌或不帶有信號(hào)肽進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)的載體或者可以通過(guò)包裝病毒進(jìn)行感染宿主 細(xì)胞將攜帶基因整合到宿主基因組而進(jìn)行該基因表達(dá)的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，可以適合外源基因表達(dá)的所有 真核細(xì)胞，包括但不限于目前常用的CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞及人源細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化，其特征在于利用重組胱抑素C的物理特性進(jìn)行各種色 譜柱進(jìn)行純化使最終得到的重組胱抑素C具有較高的純度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種利用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組人胱抑素C蛋白表達(dá)及其純化的方法。由于原核表達(dá)系統(tǒng)缺少翻譯后修飾等機(jī)制使得表達(dá)純化后的蛋白與天然蛋白相比具有活性低，結(jié)構(gòu)差異大的缺點(diǎn)，這應(yīng)該是利用大腸桿菌來(lái)源重組胱抑素C蛋白制備的單抗在建立胱抑素C檢測(cè)試劑遇到困難的主要原因。本方法利用真核表達(dá)系統(tǒng)克服了原核表達(dá)的缺點(diǎn)獲得了高活性的重組人胱抑素C蛋白，為獲得高質(zhì)量抗體提供了有力的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102071214SQ20101021324
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者華權(quán)高, 沈鶴霄 申請(qǐng)人:武漢生之源生物科技有限公司