小鼠crabp2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種載體構(gòu)建方法，具體地說(shuō)是一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體 的構(gòu)建及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素A是人體生長(zhǎng)發(fā)育及維持機(jī)體生命活動(dòng)所不可或缺的一種微量營(yíng)養(yǎng)素，它 除了在細(xì)胞分化方面具有明確的作用W外，同時(shí)還參與如免疫反應(yīng)、食欲和生長(zhǎng)等許多其 它生理生化過(guò)程。其中，其活性代謝物視黃酸通過(guò)調(diào)節(jié)許多目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞分 化和增殖等許多生理生化過(guò)程，但要充分發(fā)揮此功能必須和相應(yīng)的蛋白相結(jié)合，即細(xì)胞視 黃酸結(jié)合蛋白（CRABPs)基因家族。
[0003] Tang等研究發(fā)現(xiàn)，CRABPs基因家族在豬胚胎發(fā)育不同時(shí)期的骨骼肌里呈現(xiàn)差異 表達(dá)，而CRAPB2是CRABPs基因家族的一名成員。早期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育時(shí)期，該 基因在多個(gè)組織器官都有表達(dá)，CRAPB2基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)可能對(duì) 肌肉發(fā)育起調(diào)控作用，而小鼠來(lái)源的骨骼肌細(xì)胞系C2C12,是用作研究體外肌細(xì)胞分化和肌 肉發(fā)育常用的一種重要細(xì)胞模型。
[0004] 在細(xì)胞水平上研究證明CRABP2基因參與骨骼肌的肌纖維分化和肌肉發(fā)育，首先 需要研究CRABP2基因?qū)2C12細(xì)胞的作用，因此構(gòu)建小鼠CRABP2基因的真核表達(dá)載體至 關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載 體的構(gòu)建W及該表達(dá)載體的應(yīng)用。
[0006] 一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建，包括W下步驟：
[0007](1)、采用TRIzol法提取小鼠肌肉組織中的總RNA，合成CDNA第一鏈后，W合成的 CDNA第一鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得CRABP2基因；
[000引 似、將步驟（1)中擴(kuò)增后獲得的產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體，挑選陽(yáng)性重組子 測(cè)序，獲得基因序列SEQIDN0:1，將測(cè)序獲得的陽(yáng)性重組子命名為PGEM-T-CRABP2;
[0009] (3)、將步驟似中的陽(yáng)性重組子PGEM-T-CRABP2與真核表達(dá)載體PCDNA3. 1 (+)連 接、轉(zhuǎn)化，得到小鼠CRABP2真核表達(dá)載體PCDNA3. 1-CRABP2的重組質(zhì)粒。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟（1)擴(kuò)增是采用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，且擴(kuò)增CRABP2基因時(shí)，設(shè)計(jì) 1對(duì)引物如下： 陽(yáng)011 ]上游引物：5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
[0012] 下游引物：5'CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT3'。
[0013] 優(yōu)選地，兩條所述引物的5'端分別加上EcoRV和NotI內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
[0014] 優(yōu)選地，將獲得的CRABP2基因置于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)后于紫外儀下切 割目的片段并使用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體。 陽(yáng)O巧]優(yōu)選地，所述步驟（3)，陽(yáng)性重組子PGEM-T-CRABP2與真核表達(dá)載體PCDNA3. 1 (+) 分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRV和NotI雙酶切進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì) 胞，通過(guò)抗性基因序列篩選，將陽(yáng)性克隆采用PCR和測(cè)序鑒定后，獲得小鼠CRABP2真核表達(dá) 載體PCDNA3. 1-CRABP2的重組質(zhì)粒。
[0016] 優(yōu)選地，所述抗性基因序列是PCDNA3. 1(+)載體所包含的Amp抗性基因序列。
[0017] 一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體的應(yīng)用，用于研究CRABP2基因在肌肉發(fā)育中 的調(diào)控作用。 陽(yáng)01引優(yōu)選地，小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體的應(yīng)用，包括如下步驟：
[0019] (1)、從所述小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體中挑選正確克隆的陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培 養(yǎng)，提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒；
[0020] (2)、將步驟（1)獲得的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，于37°C培養(yǎng)4-化后棄去 轉(zhuǎn)染混合液，加入含血清的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基繼續(xù)在37 °C溫度條件，C〇2為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn) 行培養(yǎng)；
[0021] (3)、轉(zhuǎn)染達(dá)3天后，收集細(xì)胞抽提RNA后驗(yàn)證分析小鼠CRABP2基因在C2C12細(xì)胞 中的表達(dá)情況。
[0022] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，細(xì)胞融合度達(dá)到60% -70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0023] 本發(fā)明一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)是：利用一對(duì)引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到小鼠CRABP2基因的完整編碼區(qū)，并成功構(gòu)建小鼠CRABP2基因真核 表達(dá)載體。該真核表達(dá)載體構(gòu)建方法簡(jiǎn)單易行；驗(yàn)證CRABP2基因在轉(zhuǎn)染后C2C12細(xì)胞中的 表達(dá)，為研究該基因在肌肉發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為將來(lái)運(yùn)用于遺傳標(biāo)記輔助育種 提供重要依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明： 陽(yáng)02引圖1為本發(fā)明所述CRABP2基因的RT-PCR擴(kuò)增圖； 陽(yáng)0%] 圖中：M為10化PMarker, 1-5為PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析得到 512bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小一致；
[0027] 圖2為本發(fā)明所述的載體酶切鑒定圖；
[0028] 圖中：M為1000 bpMarker,
[0029] 1為限制性內(nèi)切酶EcoRV和NotI雙酶切PGEM-T-CRABP2重組質(zhì)粒雙酶切后，出現(xiàn) 兩條片段，約SOObp和3000bp，酶切片段大小與預(yù)期值相符；
[0030] 2為限制性內(nèi)切酶EcoRV和Not I雙酶切PCDNA3. 1(+)質(zhì)粒；
[0031] 圖3為本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆測(cè)序圖；
[0032] 圖4為本發(fā)明重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆測(cè)序與基因序列比對(duì)結(jié)果； 陽(yáng)03引圖5為本發(fā)明所述的PCDNA3. 1-CRABP2載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后Real time PCR 檢測(cè)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定的原理是：將CRABP2 基因T-A克隆到pGEM-T easy載體上，再通過(guò)亞克隆的方法定向插入到真核表達(dá)載體PCDNA3. 1(+)中，然后將獲得的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞系，驗(yàn)證CRABP2 基因轉(zhuǎn)染后在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)。
[0035](一）一種小鼠CRABP2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定，包括W下步驟：
[0036] (1)、TRIzol法提取總RNA:用研鉢磨碎小鼠肌肉組織樣品，每50-lOOmg組織加入 Iml裂解液，PBS漂洗細(xì)胞后，加入ImlTRIzol試劑（購(gòu)自invitrogen公司），吹打混勻， 移入1. 5mlEP管中，然后加入氯仿抽提，用75%的乙醇充分洗涂沉淀，離屯、后去上清，干燥 后用DEPC水溶解，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0037] 似、CDNA第一鏈的合成：取步驟（1)中獲得的總RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合 成第一鏈cDNA;例如：20y1反應(yīng)體系中加入5y1RNA溶液、1y1OligoUy1dNTP，65°C 反應(yīng) 5min，迅速放冰上冷卻；再加入 4]i化UfferJy1DTT、1Ji1foiaseinhibitor, 37°C反 應(yīng)2min后加入IyI逆轉(zhuǎn)錄酶，37°C反應(yīng)60min;80°C15min終止反應(yīng)，得到cDNA，于-20°C 冰箱保存；
[0038](3)、目的基因片段的體外擴(kuò)增及純化
[0039] 將步驟似中獲得的第一鏈CDNA作為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲得CRABP2 基因，然后將CRABP2基因置于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)，于紫外儀下切割目的片段并使 用凝膠回收試劑盒回收（如圖1);
[0040] 擴(kuò)增CRABP2基因時(shí)，應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物對(duì)：上游引物： 5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
[0041]下游引物：5' CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT 3'
[0042] 同時(shí)在兩條引物5'端分別加上EcoRV和NotI內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)總體 積為 20yL，其中含 10Xbuffer(Mg2〇，75ymol/L的dNTP，0. 3ymol/L的引物，1.OULATaq DNA聚合酶，cDNA模板為50ng;PCR擴(kuò)增程序是：95°C5min預(yù)變性，95°C30s變性，ere30s 進(jìn)行退火，然后72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0043](4)、小鼠CRABP2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0044] ①、將步驟（3)純化PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體（購(gòu)自Promega公司）連接， 連接