專利名稱：：一種dna疫苗真核表達(dá)載體及其在制備基因疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種DNA疫苗真核表達(dá)載體與其在制備抗腫瘤等基因疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的最重要?dú)⑹种唬虼?，加?qiáng)惡性腫瘤的防治研究具有重大意義。目前，手術(shù)切除、化療和放療仍然是治療惡性腫瘤的主要治療方法。傳統(tǒng)的手術(shù)治療方法雖可使患者的生存率有所提高，但是術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率依然在半數(shù)以上，這是因?yàn)槭中g(shù)雖然能夠有效地切除肉眼所見的瘤塊，但無法保證去除所有的腫瘤細(xì)胞，也未能改變腫瘤發(fā)生的內(nèi)環(huán)境；而化療和放療除了有嚴(yán)重的毒副作用外，許多腫瘤如腎癌等對(duì)其不敏感或產(chǎn)生抗性。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響病人預(yù)后的重要因素，更是惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)中最危險(xiǎn)的階段，目前，上述傳統(tǒng)治療方法在克服腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面存在很大的局限性，成為腫瘤治療的瓶頸。近年來逐步發(fā)展的免疫基因治療手段，因其具有特異性高、針對(duì)性強(qiáng)和副作用小的特點(diǎn)，已經(jīng)成為惡性腫瘤治療的重要發(fā)展方向。DNA疫苗也稱基因疫苗或核酸疫苗，是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗，它是指將外源抗原基因克隆到真核表達(dá)載體上，然后再將該重組的質(zhì)粒DNA免疫動(dòng)物。外源抗原基因能夠在宿主體內(nèi)表達(dá)，并刺激其產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。許多動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)都證明，DNA疫苗可以有效地激發(fā)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，被譽(yù)為第三次疫苗革命。DNA疫苗具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)①DNA質(zhì)粒表達(dá)的抗原接近天然構(gòu)象，抗原性強(qiáng)；②激發(fā)機(jī)體全面的免疫應(yīng)答，其保守抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答對(duì)不同亞型的病原體有交叉抵御作用；③制備簡(jiǎn)單，成本低廉，易進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，且運(yùn)輸、保存方便；④使用安全，沒有感染病原的危險(xiǎn)，DNA疫苗僅僅是病原體某種抗原的基因片段，而不是整個(gè)病原體的基因，且利用質(zhì)粒作載體，不涉及感染性因子；⑤免疫具有持續(xù)性，一次接種可獲得長(zhǎng)期免疫力，避免了滅活疫苗、重組亞單位疫苗等需多次加強(qiáng)免疫的繁瑣；⑥能聯(lián)合免疫，即可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中或?qū)⒑煌乖虻亩喾N質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)DNA疫苗；⑦DNA疫苗既有預(yù)防作用，也有治療作用；⑧接種途徑多樣化，既能采用注射方式接種(包括皮內(nèi)、皮下、肌注、基因槍注射技術(shù))，亦能采用口服或噴霧接種方式。Survivin屬于凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員，研究顯示，Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，也是IAP家族成員中最小的一個(gè)。人Survivin基因定位于染色體(17q25)，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，編碼一種分子量為16.5kD的胞質(zhì)蛋白，含有一個(gè)桿狀病毒重復(fù)(BIR)結(jié)構(gòu)功能區(qū)，羧基末端缺乏鋅指結(jié)構(gòu)而代之以a螺旋結(jié)構(gòu)。其mRNA在體內(nèi)經(jīng)過不同的剪切方式可產(chǎn)生三種異構(gòu)體Survivin、Survivin-2B禾卩Survivin-EX3。Survivin在胚胎組織及惡性腫瘤中普遍表達(dá)，如胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌等；但在分化成熟的組織及癌旁正常組織中無表達(dá)。這一特點(diǎn)使得Survivin成為腫瘤靶向治療的重要靶點(diǎn)，具有良好的特異性及安全性。研究證實(shí)，靶向Survivin治療可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，而對(duì)正常組織幾乎無不良影響，這一顯著優(yōu)勢(shì)使Survivin逐漸成為抗腫瘤免疫治療研究中的一大熱點(diǎn)。RongXiang等將鼠全長(zhǎng)Survivin和分泌型趨化因子CCL21的基因連接至pBudCE4.1真核表達(dá)載體上，制備成DNA疫苗，在C57BL/6J小鼠體內(nèi)的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該0亂疫苗發(fā)引發(fā)008+CTL反應(yīng)，對(duì)肺癌細(xì)胞具有很好的殺傷效果[RongX，NorikoM,Yu叩ingL，etal.ADNAvaccinetargetingsurvivincombinesapoptosiswithsuppressionofangiogenesisinlungtumoreradication.CancerResearch,2005，65(2):553-561]。MarcSchmitz等人證實(shí)凋亡抑制蛋白Survivin的自氨基端第5-14位氨基酸(TLPPAWQPFL)和第95-104位氨基酸(ELTLGEFLKL)可在體外有效地激發(fā)特異性CD8+CTL殺傷腫瘤細(xì)胞(MarcS，PetraD,BerndW，etal.GenerationofSurvivin-specificCD8+TEffectorCellsbyDendriticCellsPulsedwithProteinorSelectedP印tides.Cancerresearch,2000，60(17):4845-4849)。KerstinOtto等人又用這段短肽在IV期黑色素瘤患者體內(nèi)進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)，ELISP0T檢測(cè)結(jié)果表明，該短肽可以激發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)(Kerstin0，MadsHA，AndreasE，etal.Lackoftoxicityofther即y-inducedTcellresponsesagainsttheuniversaltumourantigensurviving.Vaccine,2005，23(7):884-889)。YoshihikoHirohashi等研制的抗腫瘤多肽疫苗是以人Survivin-2B的自氨基端第80-88位氨基酸(AYACNTSTL)為耙點(diǎn)，這段短肽是HLA-A24限制性T淋巴細(xì)胞表位，可被CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞特異性識(shí)別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，以這段短肽為靶抗原制備的疫苗對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有很好的殺傷抑制作用，目前該疫苗己經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)階段(YoshihikoH，ToshihikoT，AkikoM,etal.AnHLA—A24—restrictedCytotoxicTLymphocyteEpitopeofaTumor—associatedProtein,Survivin.ClinicalCancerResearch,2002，8(6):1731-1739)。人絨毛膜促性激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)是由胚胎合體滋養(yǎng)層細(xì)胞所分泌的糖蛋白激素，正常hCG由a鏈和p鏈亞單位以非共價(jià)鍵連接構(gòu)成二聚體。幾乎所有的惡性腫瘤細(xì)胞均能表達(dá)異位hCG。hCGP是多種腫瘤的特征性蛋白，多種組織的腫瘤細(xì)胞均選擇性分泌單鏈hCGP或hCG0的核心片段，研究表明，該蛋白與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移特性、惡性化程度以及腫瘤微環(huán)境和免疫耐受的形成等均有一定關(guān)系，具體表現(xiàn)為hCG的糖基序列大多集中在hCGe的梭基末端多肽(hCGp-CTP)區(qū)域，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的hCGP鏈越多，糖基化程度越高，腫瘤細(xì)胞表面所帶的負(fù)電荷就越多，而腫瘤細(xì)胞表面帶負(fù)電荷可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、刺激有關(guān)粘附分子和趨化因子的生成，從而使腫瘤細(xì)胞越容易轉(zhuǎn)移。同時(shí)，由于強(qiáng)負(fù)電荷的存在，可以抑制NK、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的活性降低，甚至無能，造成腫瘤的免疫耐受。由于hCGP亞基與促黃體激素(LH)有較高的同源性，因此以hCGP亞基為免疫原產(chǎn)生的抗體會(huì)與LH產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只有hCGe羧基端自109-145位氨基酸殘基組成的37肽(hCGP-CTP37)是hCG分子所特有的，并存在hCG的特異抗原表位，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體才具有更好的抗原特異性。以異位hCGP亞基為靶抗原激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)可有效地攻擊腫瘤細(xì)胞，已成為腫瘤生物治療新的研究熱點(diǎn)。國外利用該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的胰腺癌腫瘤疫苗Avicine已經(jīng)結(jié)束II期臨床試驗(yàn)，結(jié)直腸癌疫苗已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵時(shí)期，顯示該靶點(diǎn)對(duì)多種惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具免疫保護(hù)功能，具有良好的應(yīng)用前景。hCGP鏈的核心片段-CTP37，是多種腫瘤的特征性蛋白，與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、惡性化程度以及腫瘤微環(huán)境和免疫耐受的形成等均有一定關(guān)系。研究表明，以CTP37為耙抗原激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可有效地攻擊腫瘤細(xì)胞，現(xiàn)已成為腫瘤生物治療的另一研究熱點(diǎn)。Li-ZhenHe等將hCG0的全基因連接在抗DC細(xì)胞抗體Bll重鏈的3'端構(gòu)成融合基因，再將其插入真核表達(dá)載體pMMV4中構(gòu)成DNA疫苗，體外實(shí)驗(yàn)證明該疫苗可激發(fā)產(chǎn)生強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)殺死腫瘤細(xì)胞(HeLZ，RamakrishnaV,ConnollyJE，etal.Anovelhumancancervaccineelicitscellularresponsestothetumor-associatedantigen,humanchorionicgonadotropinbeta[J].ClinCancerRes，2004,10(6):1920-7.)。Moulton等將含有hCGP的C00H-末端37個(gè)氨基酸殘基(CTP37)的短肽與白喉類毒素相偶連制備成蛋白質(zhì)疫苗，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗CTP37的抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)，現(xiàn)在該疫苗治療結(jié)直腸癌的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵日寸期(MoultonHM，YoshiharsPH，MasonDH，etal.Activespecificimmunotherapywithabeta-humanchorionicgonadotropinpeptidevaccineinpatientswithmetastaticcolorectalcancer:antibodyresponseisassociatedwithimprovedsurvival[J].ClinCancerRes，2002，8(7):2044-51)。HeYi等于近期發(fā)表的一篇論文中介紹了他們研制的一種新型的以CTP37為耙點(diǎn)的核酸疫苗，是將CTP37與分枝桿菌熱休克蛋白HSP65相連，并將這段融合基因插入真核表達(dá)載體構(gòu)成核酸疫苗，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了抑瘤效果的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該核酸疫苗可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的親和性抗體，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明該疫苗可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，為腫瘤的免疫治療提供了一條新思路(YiH，RongY，YankaiZ，etal.ImprovedefficacyofDNAvaccinationagainstbreastcancerbyboostingwiththerepeatbeta-hCGC-terminalpeptidecarriedbymycobacterialheat-shockproteinHSP65[J].Vaccine,2006，24(14):2575-84.)。基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)除了正確選取最特異、高效、廣泛的靶抗原之外，還包括合理選擇適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體，這也是核酸疫苗研制的前提條件。pVAXl載體是被美國藥品及食物鑒定委員會(huì)承認(rèn)的用于疫苗臨床使用的真核表達(dá)載體，它具有卡那霉素抗性，非常適合于人體應(yīng)用。當(dāng)前，DNA疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵性問題是如何提高疫苗的免疫保護(hù)力，這一問題關(guān)系到DNA疫苗最終能否轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品。以往人們?yōu)榱藰?gòu)建多價(jià)DNA疫苗及增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性，多構(gòu)建雙啟動(dòng)子表達(dá)載體、重組表達(dá)融合蛋白或通過攜帶不同抗原基因和佐劑基因的質(zhì)粒共同免疫，雖然雙啟動(dòng)子載體可用于兩個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)，但啟動(dòng)子之間的相互千擾會(huì)造成轉(zhuǎn)錄效果的不一致，減弱甚至喪失某些基因的表達(dá)(TaharaH,ZitvogelL，StorkusWJ"，etal.EffectiveeradicationofestablishedmurinetumorswithIL-12genetherapyusingapolycistronicretroviralvector[J].JImmunol,1995，154(12):6466-74.);此外，多載體共免疫的效率也較低，常常不能取得令人滿意的效果。采用IRES元件構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體，可允許兩個(gè)目的基因同時(shí)有效表達(dá)(Wa.gstaffM，LilleyC,SmithJ,etal.GenetransferusingadisabledherpesvimsvectorcontainingtheEMCVIRESallowsmultiplegeneexpressioninvitroandinvivo.GeneTher.1998，5(11):1566-70.)，是近年來多基因表達(dá)的重要方法。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite,IRES)是最早發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物病毒基因組5'非編碼區(qū)的一段DNA序列，它具有不依賴于5'帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始功能，可以使來源于同一mRNA的2個(gè)開放讀碼框架正確表達(dá)，是一種雙順反子表達(dá)元件。在兩個(gè)蛋白編碼序列之間插入IRES，在上游啟動(dòng)子的控制下，轉(zhuǎn)錄后為同一條mRNA;翻譯時(shí)，IRES上游基因翻譯起始遵循一般的真核生物基因的翻譯起始規(guī)律(即帽結(jié)構(gòu)依賴方式)，而IRES下游基因則通過IRES引導(dǎo)核糖體進(jìn)入，啟始基因的翻譯，從而實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)。由于兩個(gè)基因翻譯自同一條mRNA，表達(dá)出的蛋白在時(shí)間和空間上接近，尤適用于研究相互作用的兩個(gè)蛋白質(zhì)或通過報(bào)告基因追蹤待檢測(cè)蛋白的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，也可作為多表位DNA疫苗的表達(dá)載體。正常情況下，機(jī)體對(duì)自身抗原具有耐受性，不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。利用異種同源基因作為抗原，通過生物種與種之間基因的同源性，設(shè)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，有利于打破機(jī)體的自身免疫耐受，能夠使疫苗有效地誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫保護(hù)反應(yīng)，高效發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的作用。異種同源抗原是打破腫瘤免疫耐受的有效策略。研究發(fā)現(xiàn)，生物在由低級(jí)物種向高級(jí)物種進(jìn)化演變過程中，不同種屬的同一基因表現(xiàn)為一定的同源性?？衫卯惙N同源細(xì)胞或分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自體免疫反應(yīng)達(dá)到抗腫瘤的目的。通過利用生物種與種之間基因的同源性，設(shè)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)(cross-reaction),可能會(huì)打破自身免疫耐受(CiesielskiM丄ApfelL，BaroneTA，etal.AntitumoreffectsofaxenogeneicsurvivinbonemarrowderiveddendriticcellvaccineagainstmurineGL261gliomas.CancerImmunolImmunother，2006，55(12)，1491-503)。研究表明，使用與腫瘤抗原(HER-2/neu)高度同源的蛋白質(zhì)，可以誘導(dǎo)出比使用腫瘤抗原本身大得多的機(jī)體免疫反應(yīng)。國內(nèi)魏于全院士等發(fā)現(xiàn)用異種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子極其受體作為疫苗免疫小鼠，可誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤新生血管的自身免疫反應(yīng)，從而可抑制腫瘤生長(zhǎng)，在動(dòng)物體內(nèi)取得了較好的抑瘤效果(WeiYQ，HuangM丄YangL，etal.ImmunogenetherapyoftumorswithvaccinebasedonXenopushomologousvascularendothelialgrowthfactorasamodelantigen.[J]ProcNatlAcadSciUSA.2001S印25:98(20):11545-50)。目前，以異種抗原作為免疫原研制抗腫瘤疫苗已經(jīng)成為重要的設(shè)計(jì)策略，國內(nèi)外在多種疫苗設(shè)計(jì)上均應(yīng)用此策略，并取得了令人滿意的免疫保護(hù)效果。腫瘤免疫基因治療的主要目的是使機(jī)體產(chǎn)生具有抗腫瘤特異性和細(xì)胞毒活性的T淋巴細(xì)胞，從而達(dá)到特異性攻擊腫瘤的作用。T細(xì)胞的活化需雙信號(hào)刺激第一信號(hào)由T細(xì)胞抗原受體(TCR)與抗原提呈細(xì)胞(APC)上的抗原肽-MHC分子復(fù)合物結(jié)合提供，第二信號(hào)由APC上的共刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合提供。只有雙信號(hào)共同刺激才能有效激活特異性的T細(xì)胞，缺乏第二信號(hào)造成T細(xì)胞克隆凋亡，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃避。APC上的共刺激分子主要是一些粘附分子，其中，B7分子是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。B7.1是APC上的主要共刺激分子，它與配體CD28分子的相互作用是T細(xì)胞激活的第二信號(hào)。B7.1與其配體CD28結(jié)合后，可促進(jìn)T細(xì)胞增殖、阻止T細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生T細(xì)胞趨化因子(HeroldK，Lu丄RulifsonT,etal.RegulationofC-CchemokineproductionbymurineTcellsbyCD28/B7costimulation[J].JImmuno1，1997，159(9):4150-53.);上i周IL-2Ra、P和Y，增加IL-2mRNA的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞因子分泌。上調(diào)CD40L的表達(dá)和CTLA24的mRNA水平；還可增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)超抗原的敏感性，介導(dǎo)CTL對(duì)靶細(xì)胞的效應(yīng)功能；介導(dǎo)T-B細(xì)胞間的粘附，促進(jìn)體液免疫應(yīng)答等。B7.1主要共刺激CD8+T細(xì)胞向CTL分化CD4+T細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化，這在增強(qiáng)和維持有效免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。同時(shí)，B7.l還具有較強(qiáng)的共刺激GM-CSF產(chǎn)生的作用(BoussiotisV，F(xiàn)reemanG，GribbenJ"，etal.TheroleofB7.1/B7.2:CD28/CTLA-4pathwaysinthepreventionofanergy，inductionofproductiveimmunityanddown-regulationoftheimmuneresponse[J].ImmunolRev,1996，153:5-26,)。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落束纖因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)主要由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)DC等APC分化、成熟和活化及上調(diào)CD86的表達(dá)以激發(fā)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答(KassE，ParkerJ"，Schlom，etal.ComparativestudiesoftheeffectsofrecombiantGM-CSFandGM-CSFadministeredviaapoxvirustoenhancetheconcentrationofantigenpresentingcellsinregionallymphnodes[J].Cytokine，2000，12(7):960-71.);在體外具有促進(jìn)髓樣袓細(xì)胞增殖，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和ADCC效應(yīng)等活性(Yu丄BurwickJ,DranoffG，etal.Genetherapyformetastaticbraintumorsbyvaccinationwithgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactortransducedtumorscells[J].Humangenetherpy，1997，8(9):1065—72.);促進(jìn)Th、Tc、NK在腫瘤部位浸潤，從而殺傷腫瘤(NakazakiY，TaniK，LinZT，etal.Vaccineeffectofgranulocyte—macrophagecolony-stimulatingfactororCD80gene-transducedmurinehematopoietictumorcellsandtheircooperativeenhancementofanti-tumorimmunity[J].GeneTher，1998，5(10):1355-62.)。大量文獻(xiàn)表明，GM-CSF具有很好的協(xié)同抗腫瘤作用(ArmstrongC，BotellaR，GallowayT，etal.Anti-tumoreffectsofgranulocytemacrophagecolony—stimulatingfactorproductionbymelanomacells[J].CancerRes,1996,56(9):2191-98;WakimotoH，AbeJ,TsunodaR，etal.Intensifiedanti-tumorimmunitybyacancervaccinethatproducesgranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorplusinterleukin4[J].CancerRes，1996，56(8):1828—33.)。僅靠腫瘤特異性抗原難以有效激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫，尚需B7.1共刺激分子與其配體等相互作用參與激活T細(xì)胞。許多研究也已證實(shí)多數(shù)腫瘤細(xì)胞不表達(dá)B7.1共刺激分子，從而逃避了機(jī)體免疫監(jiān)視，以至腫瘤逃避免疫監(jiān)視而在體內(nèi)無限制生長(zhǎng)(楊旭偉，陳元仲，林振興.人B7.l基因cDNA的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體構(gòu)建[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，35(2):109-111.)。而GM-CSF具有激活樹突細(xì)胞等專職抗原遞呈細(xì)胞作用，使抗原特異的輔助T淋巴細(xì)胞和抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞增生，在體內(nèi)能激活較強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。若將兩者聯(lián)合應(yīng)用，即可啟動(dòng)針對(duì)腫瘤抗原的免疫，又可促進(jìn)輔助T淋巴細(xì)胞和抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞增生，產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)。目前已有研究證實(shí)，將GM-CSF與B7.1分子聯(lián)合應(yīng)用會(huì)提高疫苗對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。S咖imoto等人的研究結(jié)果表明，B7.1基因和GM-CSF基因共轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞株LLC制備的瘤苗(LLC/GM+B7)，誘發(fā)的CTL細(xì)胞殺傷活性明顯高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染B7.1或GM-CSF基因的LLC細(xì)胞(SumimotoH，TaniK，NakazakiY,etal.GM-CSFandB7-1(CD80)co-stimulatorysignalsco-operateintheinductionofeffectiveanti-tumorimmunityinsyngeneicmice.IntJCancer.1997，73(4):556-61.)。Nakazaki等人的研究結(jié)果表明，胸腺淋巴瘤細(xì)胞/GM-CSF與胸腺淋巴瘤細(xì)胞/B7.1瘤苗聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤免疫效果，其機(jī)制可能是GM-CSF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的瘤苗主要是通過APC介導(dǎo)的間接途徑影響Th細(xì)胞進(jìn)而激活CTL;B7.1基因轉(zhuǎn)錄的瘤苗是通過直接途徑影響CTL，而將兩者聯(lián)合使用可誘發(fā)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤部分根除(NakazakiY，TaniK,LinZ，etal.VaccineeffectofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactororCD80genetransducedmurinehematopoietictumorcellsandtheircooperativeenhancementofanti-tumorimmunity[J].GeneTher，1998，5(10):1355-62.)。LDH法測(cè)定細(xì)胞CTL效應(yīng)的原理如圖27所示乳酸脫氫酶(LDH)是活細(xì)胞胞漿中的內(nèi)含酶之一，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞共同孵育后，靶細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，膜的通透性發(fā)生改變使胞漿中的LDH釋放到胞外。取含有LDH的培養(yǎng)上清，經(jīng)酶促反應(yīng)使底物(tetrazoliumsalt)轉(zhuǎn)化成一種紫紅色的甲肷類化合物(formazan)，在490nm處有很高的吸收峰，測(cè)定其A490值就能間接反映出效應(yīng)細(xì)胞對(duì)耙細(xì)胞的殺傷狀況。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于構(gòu)建基因疫苗且可同時(shí)啟動(dòng)兩種基因共表達(dá)的DNA疫苗真核表達(dá)載體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種DNA疫苗真核表達(dá)載體，是在pVAXl載體骨架中含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite,IRES)編碼序列的重組真核表達(dá)載體。由于所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的上、下游均可以啟動(dòng)基因表達(dá)，因此為方便外源基因的插入，在上述DNA疫苗真核表達(dá)載體中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的兩端還可再添加一種或多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切酶的選擇是廣泛的，包括EcoRV、BamHI、ClaI、BstBI、PvuI禾BPsiI、BssHII、SwaI、PacI、NsiI、SmaI、XhoI、NotI、BstXI、NheI和SalI等。具體來講，在所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的5'端添加限制性內(nèi)切酶EcoRV、ClaI、BstBI、PvuI和PsiI識(shí)別位點(diǎn)，在其3，端添加限制性內(nèi)切酶BssHII、SwaI、PacI、NsiI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)的DNA疫苗真核表達(dá)載體為pVAXl-IRES。所述DNA疫苗真核表達(dá)載體可按照基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建。所述DNA疫苗真核表達(dá)載體在制備基因疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述基因疫苗包括針對(duì)多種疾病的基因疫苗，如抗腫瘤、抗流感、抗艾滋病、抗病毒性肝炎、抗結(jié)核、抗狂犬病或抗瘧疾等基因疫苗。本發(fā)明另一目的在于提供所述DNA疫苗真核表達(dá)載體的一種應(yīng)用，即提供一種高效廣譜實(shí)體腫瘤治療性基因疫苗。其中，以本發(fā)明的DNA疫苗真核表達(dá)載體為出發(fā)載體構(gòu)建的抗腫瘤基因疫苗，其活性成分是在本發(fā)明的DNA疫苗真核表達(dá)載體的載體骨架中核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因，以及人和猴的絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因的重組真核表達(dá)載體。所述Survivin-2B的自氨基端第5-28位氨基酸殘基的編碼序列和自氨基端第80-121位氨基酸殘基的編碼序列可通過連接臂"nG"連接，其中，n可以為K(賴氨酸)、R(精氨酸)、C(半胱氨酸)、Q(谷氨酰胺)G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)。所述由連接臂"nG"連接的Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列的融合基因的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。所述Survivin-2B的自氨基端第5-28位氨基酸殘基編碼序列位于Survivin-2B的自氨基端第80-121位氨基酸殘基編碼序列的的3'或5'端均可。所述人和猴的絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列也可通過連接臂"nG"連接，其中，n為K、R、C、Q、G或N。所述由連接臂"NG"連接的人和猴的絨毛膜促性腺激素0鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列的融合基因的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述人的絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列可位于猴的絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列的3'或5'端均可。此外，所述Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因位于人和猴絨毛膜促性腺激素P鏈的CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因的3'或5'端均可。為引導(dǎo)目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)獲得有效表達(dá)和分泌，所述抗腫瘤基因疫苗的真核表達(dá)載體的載體骨架中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游還可連接有人IgK鏈前導(dǎo)信號(hào)肽(sig)編碼序列和/或人IgG-Fc段編碼序列和/或糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)肽編碼序列。此外，為進(jìn)一步增強(qiáng)所述抗腫瘤基因疫苗激活免疫應(yīng)答的能力，在所述抗腫瘤基因疫苗的真核表達(dá)載體的載體骨架中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的下游還可連接有人GM-CSF和/或B7.l共刺激分子編碼序列，以及白細(xì)胞介素、干擾素和/或腫瘤壞死因子等免疫激活細(xì)胞因子的編碼序列。具體來講，在本發(fā)明的DNA疫苗真核表達(dá)載體的載體骨架中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因，以及人和猴的絨毛膜促性腺激素0鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因的重組真核表達(dá)載體可為pVAX1-2PAG。在本發(fā)明的DNA疫苗真核表達(dá)載體的載體骨架中在所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游依次連接有人IgK鏈前導(dǎo)信號(hào)肽編碼序列、Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因、人和猴的絨毛膜促性腺激素3鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因，以及人IgG-Fc段編碼序列和糖基磷脂酰肌醇錨定信號(hào)肽編碼序列的重組真核表達(dá)載體可為pVAXl-2PAG-Fc-GPI。在本發(fā)明的DNA疫苗真核表達(dá)載體的載體骨架中在所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游依次連接有人IgK鏈前導(dǎo)信號(hào)肽編碼序列、Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因(抗原基因)、人和猴絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因(抗原基因)、人IgG-Fc段編碼序列和糖基磷脂酰肌醇錨定信號(hào)肽編碼序列(所述人Igk鏈前導(dǎo)信號(hào)肽編碼序列、人IgG-Fc段編碼序列和糖基磷脂酰肌醇錨定信號(hào)肽編碼序列與所述抗原基因融合表達(dá))，在所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的下游連接有人GM-CSF和B7.l共刺激分子編碼序列的重組真核表達(dá)載體可為pVAXl-sig-2PAG-FC-GPI-GM/B7(簡(jiǎn)稱pVAX1-2PFcGB)。需要的時(shí)候，在上述疫苗的制備中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑或表面活性劑等。上述疫苗的用量一般為0.01-200ug/kg體重/天，可以一次或多次使用，療程-一般為20-40天，劑量和療程都可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。為提高療效，本發(fā)明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑等進(jìn)行組合治療。本發(fā)明提供了一種DNA疫苗真核表達(dá)載體。該載體是針對(duì)DNA疫苗在惡性腫瘤治療中展現(xiàn)出來的優(yōu)勢(shì)，在真核表達(dá)載體pVAXl的基礎(chǔ)之上，引入了雙順反子表達(dá)元件一IRES序列，并在IRES序列的兩端插入了多種稀有酶切位點(diǎn)，從而構(gòu)建成功的一種新型DNA疫苗載體pVAXl-IRES。并在此NA疫苗載體pVAX1-IRES的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一種多靶點(diǎn)復(fù)合抗腫瘤基因疫苗，該抗腫瘤基因疫苗是在pVAXl-IRES中IRES編碼序列的上游含有人IgK鏈前導(dǎo)信號(hào)肽(sig)、人Survivin-2B主要T細(xì)胞表位區(qū)域、人和猴絨毛膜促性腺激素e鏈的核心片段CTP37區(qū)域、人lgG-Fc段編碼序列和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定肽的多基因融合序列，在pVAXl-IRES中IRES編碼序列的IRES下游含有人GM-CSF和B7.1融合基因的重組真核表達(dá)載體pVAXl-sig-2PAG-FC-GPI-GM/B7(簡(jiǎn)稱pVAXl-2PFcGB)。轉(zhuǎn)染有該質(zhì)粒的293T細(xì)胞的流式細(xì)胞儀和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，pVAXl-2PFcGB在293T細(xì)胞中獲得很好的表達(dá)，此外，本發(fā)明的抗腫瘤基因疫苗還具有較好的體液免疫和細(xì)胞免疫效果，同時(shí)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。以本發(fā)明的真核表達(dá)載體制備的基因疫苗有望對(duì)乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等多種惡性實(shí)體瘤發(fā)揮廣譜治療作用，在腫瘤的治療及其藥物開發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為PCR擴(kuò)增的IRES編碼序列的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為攜帶IRES編碼序列的重組載體pSimplel8-EcoRV/BAP-IRES的EcoRV和XhoI雙酶切鑒定結(jié)果圖3為pSimple18-EcoRV/BAP-IRES和真核表達(dá)載體pVAXl的EcoRV和XhoI雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖4為真核DNA疫苗載體pVAXl-IRES的EcoRV和XhoI雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖5A為PCR擴(kuò)增的DsRedl基因片段的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖5B為PCR擴(kuò)增的EGFP基因片段的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖6A為攜帶DsRedl基因的重組載體pGEM-TEasy-DsRedl的BamHI和PvuI雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖6B為攜帶EGFP基因的重組載體pGEM-TEasy-EGFP的BssHII和NsiI雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖7為pGEM-TEasy-DsRedl、pGEM-TEasy-EGFP和pVAXl-IRES雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖8A為攜帶DsRedl基因的真核表達(dá)載體pVAXl-IRES-DsRedl的BamHI和PvuI雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖8B為攜帶EGFP基因的真核表達(dá)載體pVAXl-IRES-EGFP的NsiI和BssHII雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖8C為攜帶DsRedl和EGFP基因的真核表達(dá)載體pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的BamHI和XhoI雙酶切產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖9為各種重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況的激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果圖10為各種重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)情況的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖11為抗原復(fù)合物2PAG融合基因的結(jié)構(gòu)式意圖圖12為PCR擴(kuò)增的Sur-SC和SC-hraCTP及抗原復(fù)合物2PAG融合基因的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖13為PCR擴(kuò)增的人GM-CSF因子和B7.1融合基因的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖14為含有抗原復(fù)合物2PAG融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-2PAG-Fc-GPI的菌落PCR及酶切鑒定結(jié)果圖15為真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-sig-2P-FC-GPI-IRES的酶切鑒定結(jié)果圖16為真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IRES-GM/B7的酶切鑒定結(jié)果圖17為pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-GM/B7(pVAXl-2PFcGB)的酶切鑒定結(jié)果圖18為pVAXl-2PFcGB在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)效率的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖19為pVAXl-2PFcGB在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)效率的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖20為Balb/c小鼠的免疫方案圖21為各組免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖22為各組免疫小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)曲線圖23為各組免疫小鼠皮下移植瘤攻擊30天后離體腫瘤體積的比較結(jié)果圖24為皮下移植瘤攻擊35天后各組免疫小鼠體內(nèi)的平均瘤重統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖25為皮下移植瘤攻擊35天后各免疫組的腫瘤抑制率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖26為2D組、E組和F組免疫小鼠血清抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果圖27為L(zhǎng)DH法測(cè)定細(xì)胞CTL效應(yīng)的原理示意圖圖28為各免疫組小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性檢測(cè)結(jié)果圖29為pVAXl-2PFcGB、pVAXl-2PAG、pVAXl-2PAG-Fc-GPI的結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物及DNA序列如無特別說明均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。所有百分比濃度如無特別說明均為體積/體積(V/V)或質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度。實(shí)施例l、DNA疫苗載體pVAXl-IRES的構(gòu)建一、RES編碼序列的PCR擴(kuò)增與純化首先根據(jù)pIRES-neo載體中的IRES編碼序列(IRES序列的位置為1295-1880bp)設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增引物，并在用于PCR擴(kuò)增IRES編碼序列的上游引物IRES-F中添加了限制性內(nèi)切酶EcoRV、ClaI、BstBI、PvuI和PsiI識(shí)別位點(diǎn)，在用于PCR擴(kuò)增IRES編碼序列的下游引物IRES-R中添加了限制性內(nèi)切酶BssHII、SwaI、PacI、NsiI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)，具體引物序列如下IRES-F(上游引物)5'-CCGATATCGATTCGAACGATCGTTATAACTAGGGCGGCCAATTCCGCC-3,IRES-R(下游引物)5'-GCCTCGAGCGCGCATTTAAATTAATTAATGCATTGGCTGCAGGAATTATCCCG-3'。引物合成后，用滅菌蒸餾水配制成2(^mol/L的使用液，分裝，-2(TC保存?zhèn)溆?。然后，以質(zhì)粒pIRES-neo(Clontech公司)為模板，在引物IRES-F和IRES-R的引導(dǎo)下，在PerkinElmer公司的GeneAmpPCRSystem2400型PCR儀上PCR擴(kuò)增IRES的編碼序列，50ulPCR反應(yīng)體系為5XPrimeSTAR緩沖液(含Mg2+)10ul，dNTPs(2.5mmol/L)4ul，上游引物(20umol/L)lul，下游引物(20umol/L)lyl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/u1，TaKaRa公司)0.5u1，模板(pIRES-neo質(zhì)粒稀釋100倍)lwl，滅菌蒸餾水32.5yl。PCR反應(yīng)條件為先95'C3min;然后94°C45s，60°C45s，72°Clmin30s，共循環(huán)30次；最后72。C延伸7min，4。C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢觀[)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道M為DL2000DNAMarker(購自TaKaRa公司)，泳道1為IRES編碼序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了682bp的DNA條帶，與預(yù)期大小一致。用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化該目的條帶。二、攜帶IRES編碼序列的pSimple18-EcoRV/BAP重組載體的構(gòu)建與鑒定1、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)a.取-7(TC保存的大腸桿菌DH5a菌種，將其劃線接種于LB瓊脂平板上，在37°C溫箱中培養(yǎng)過夜(12-24小時(shí))；b.挑取濕潤光滑，邊緣整齊的大腸桿菌DH5a單個(gè)菌落接種至3mLLB液體培養(yǎng)基中，在37"C、200rpm下振蕩培養(yǎng)過夜；c.將活化的菌種按l^接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中，37"振蕩培養(yǎng)2-4h，使細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即0D6。。=0.3-0.6;d.在無菌條件下將菌液轉(zhuǎn)移至無菌、預(yù)冷的聚丙烯管中，冰浴10min后4'C、8000rpm離心10min，使菌體完全沉淀；e.棄上清，用10mL預(yù)冷的0.lmol/LCaCl2重懸菌體沉淀，冰浴20min后，4°C、6000rpm離心10min;f.棄上清，用2raL預(yù)冷的0.lmol/LCaCl2重懸菌體沉淀，冰浴3.5h后，加入15%甘油，分裝，-7(TC保存?zhèn)溆谩?、PCR擴(kuò)增的IRES編碼序列的5'末端磷酸化用TaKaRa公司的DNAKinationKit高效磷酸化試劑盒并參照試劑盒說明書對(duì)步驟一擴(kuò)增的IRES編碼序列進(jìn)行5'末端磷酸化，具體步驟如下a.在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量為50til;T4PolynucleotideKinase(10U/u1)ATP(10mM)10XReaction緩沖液PCR純化產(chǎn)物ddH20總體積50^ilb.37。C反應(yīng)30分鐘；c.7(TC加熱10分鐘，使酶失活；d.加入50u1的ddH20，補(bǔ)充體積至100u1;e.加入10u1(1/10量)的3MCH3COONa(pH5.2);f.加入4u1的DNAmate溶液，均勻混合；g.加入250ul的-2(TC預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻；h.4°C、12000rptn離心IO分鐘，回收沉淀，用70%冷乙醇清洗沉淀后，室溫干燥10分鐘；6.將沉淀溶解于20n1的ddH20中。3、5'末端磷酸化后的IRES編碼序列與pSimple18-EcoRV/BAP載體的連接用TaKaRa公司的LigationMix高效DNA連接酶將步驟2經(jīng)5，末端磷酸化后的IRES編碼序列與載體pSimple18-EcoRV/BAP(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，連接體系如下pSimple18-EcoRV/BAP載體1u15'末端磷酸化后的IRES編碼序列4ulLigationMix5y1總體積10|il連接條件為16"連接lh。4、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct感受態(tài)細(xì)胞取步驟l制備的新鮮大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a200"1，置于冰浴中，加入步驟3的連接產(chǎn)物10ul，輕輕混勻后冰浴30min，立即轉(zhuǎn)移到42。C水浴中熱休克90s，再冰浴靜置2min，加入O.5mL不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37。C水浴15min后，37°C搖床輕搖45min;隨后，取200w1轉(zhuǎn)化菌體，均勻涂布于含有氨芐青霉素(100ug/mL)的LB平板培養(yǎng)基上，在超凈工作臺(tái)吹干約10min，37。C倒置培養(yǎng)12-16h。然后，從LB抗性平板中挑取長(zhǎng)出的單一菌落5個(gè)，分別接種于含氨芐青霉素(100ng/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(5mL/管)，37。C搖床培養(yǎng)過夜。5、提取質(zhì)粒15u15u1134u1將步驟4)獲得的轉(zhuǎn)化有攜帶IRES編碼序列的pSimple18-EcoRV/BAP的重組質(zhì)粒菌液過夜培養(yǎng)，用博大泰克公司的堿裂解法試劑盒并參照試劑盒說明書提取質(zhì)粒。6、酶切鑒定及測(cè)序?qū)Σ襟E5用堿裂解法試劑盒提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRV和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下10XNEBuffer32y1100XBSA0.2ul重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA5u1XhoI1u1EcoRV1u1滅菌雙蒸水_10.8ul總體積20|al酶切條件為37'C水浴酶切過夜。對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1為EcoRV和XhoI雙酶切產(chǎn)物)，經(jīng)酶切獲得了2692bp和682bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明IRES編碼序列已成功連入pSimple18-EcoRV/BAP載體中。然后，將經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的攜帶IRES編碼序列的pSimplel8-EcoRV/BAP重組載體，將其命名為pSimplel8-EcoRV/BAP-IRES。三、真核DNA疫苗載體pVAXl-IRES的構(gòu)建與鑒定1、酶切將步驟二經(jīng)測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pSimple18-EcoRV/BAP-IRES和真核表達(dá)載體pVAXl(invitrogen公司)分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切條件為37"C水浴過夜，酶切體系如下pSimplel8-EcoRV/BAP-IRESpVAXlDNA30u130u110Xbuffer5u15y1100XBSA0.5u10.5y1XhoIlu1lu1EcoRVllUly1雙蒸水12.5u112.5u1總體積50u150u1。2、酶切產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化對(duì)步驟1的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1為pVAXl的EcoRV和XhoI雙酶切產(chǎn)物，泳道2為PSimplel8-EcoRV/BAP-IRES的EcoRV和XhoI雙酶切產(chǎn)物)，pVAXl經(jīng)酶切獲得了大小約為3000bp的DNA條帶，pSimple18-EcoRV/BAP-IRES經(jīng)酶切獲得了682bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的"PCR片斷快速膠回收試劑盒"并參照試劑盒說明書回收并純化經(jīng)酶切過夜的重組質(zhì)粒pSimplel8-EcoRV/BAP-IRES中的IRES編碼序列的DNA片段和真核表達(dá)載體pVAXl。將純化后的目的基因IRES和線性化載體pVAXl進(jìn)行連接，16。C連接lh，連接體系如下目的基因IRES5^1線性化pVAXl載體5|ilLigationMix10y1總體積20^1。然后，用與步驟二相同的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞。3、陽性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定挑取在含卡那霉素(50ug/mL)LB抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落6個(gè)(編號(hào)1-6)，分別接種于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(5mL/管)，37C搖床培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRV和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下質(zhì)粒10XBSAEcoRVXhoIddH203±h心z、緩沖液pVAXl-IRES10wl2u10.5u10.5y10.5ul6.5p120y1。然后，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1為pVAXl空載體，泳道2為IRES的DNA片段，泳道3-8為挑選的1-6號(hào)單克隆質(zhì)粒的EcoRV和XhoI雙酶切產(chǎn)物)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得3000bp和682bp的DNA條帶，其中4，5，7，8號(hào)單克隆為陽性克隆，與預(yù)期結(jié)果一致，證明獲得了序列及插入位置均正確的含有IRES編碼序列的pVAXl重組載體，命名為pVAX1-IRES，即本發(fā)明的真核DNA疫苗載體。實(shí)施例2、真核DNA疫苗載體pVAXl-IRES的表達(dá)功能驗(yàn)證為了檢驗(yàn)實(shí)施例l構(gòu)建的真核DNA疫苗載體pVAX1-IRES是否具有同時(shí)啟動(dòng)兩種基因進(jìn)行共表達(dá)的功能，首先從紅色熒光蛋白表達(dá)載體pDsRedl-Nl(Clontech公司)中擴(kuò)增出紅色熒光蛋白基因DsRedl(EF517319)，從增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-Nl(Clontech公司)中擴(kuò)增出增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因EGFP(EF587314),然后將擴(kuò)增出的DsRedl基因片段和EGFP基因片段分別插入pVAXl-IRES載體中IRES編碼序列的上游和下游，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP、pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP。將這三個(gè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞293T，通過流式細(xì)胞儀和激光掃描共聚焦顯微鏡分析DsRedl、EGFP的表達(dá)情況，從而檢驗(yàn)所構(gòu)建的DNA疫苗載體pVAXl-IRES是否具有同時(shí)啟動(dòng)兩種基因進(jìn)行共表達(dá)的功能，具體實(shí)驗(yàn)方法如下6.PCR擴(kuò)增DsRedl基因和EGFP基因片段6.引物設(shè)計(jì)根據(jù)紅色熒光蛋白基因DsRedl(EF517319)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因(EF587314)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物序列如下F-DsRedl(上游引物)5，-CCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGC-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))R-DsRedl(下游引物)5'-CCGCGATCGCTACAGGAACAGGTGG-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶PvuI識(shí)別位點(diǎn))；F-EGFP(上游引物)5，-CCGATGCATCGCCACCATGGTGAGC-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NsiI識(shí)別位點(diǎn))R-EGFP(下游引物)5，-CCGGCGCGCTTACTTGTACAGCTCG-3，(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BssHII識(shí)別位點(diǎn))。引物合成、純化后用滅菌蒸餾水配制成20umol/L的使用液，分裝，-2(TC保存?zhèn)溆谩?、DsRedl基因片段的PCR擴(kuò)增及其回收、純化以質(zhì)粒pDsRedl-Nl(Clontech公司)為模板，在引物F-DsRedl和R-DsRedl的引導(dǎo)下，在PerkinElmer公司的GeneAmpPCRSystem2400型PCR儀上PCR擴(kuò)增DsRedl基因序列，50ulPCR反應(yīng)體系為10XExT叫緩沖液5ul，dNTPs(2.5mmol/L)4yl，上游引物(20"mol/L)lul，下游引物(20umol/L)lul，TaKaRaExTaq(5U/ul，TaKaRa公司)1U1，模板(pDsRed1-Nl質(zhì)粒稀釋100倍)lnl，滅菌蒸餾水37ul。PCR反應(yīng)條件為先95"C5min;然后94°C45s，62°C45s，72°C2min，共循環(huán)35次；最后72'C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5ylPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5A所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道l為DsRedl基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了723bp的DNA條帶，與預(yù)期大小一致。用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化該目的條帶。3、EGFP基因片段的PCR擴(kuò)增及其回收、純化以質(zhì)粒pEGFP-Nl(Clontech公司)為模板，在引物F-EGFP和R-EGFP的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增EGFP基因序列，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與步驟2相同。反應(yīng)結(jié)束后，取5ii1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5B所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1為EGFP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了746bp的DNA條帶，與預(yù)期大小一致。用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化該目的條帶。二、pGEM-TEasy-DsRedl、pGEM-TEasy-EGFP重組克隆載體的構(gòu)建1、將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將步驟一擴(kuò)增并經(jīng)純化的DsRedl基因和EGFP基因分別連接入大腸桿菌克隆載體pGEM-TEasy(購自TaKaRa公司)中，16。C連接過夜，連接體系如下PCR擴(kuò)增的目的基因純化產(chǎn)物6.0y1pGEM-TEasy2,0u110XT4DNALigasebufferl.OulT4DNALigase(12p/u1)1.On1總體積10|il。反應(yīng)結(jié)束后，用與實(shí)施例1步驟二中相同的方法將兩個(gè)基因的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。2、陽性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定挑取在含氨芐青霉素(lOOiig/mL)LB抗性平板上長(zhǎng)出的分別轉(zhuǎn)化DsRedl基因和EGFP基因的單菌落各6個(gè)(均編號(hào)1-6)，分別接種于含氨芐青霉素(Amp+)(100pg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(5mL/管)，37。C搖床培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒，對(duì)攜帶DsRedl基因的質(zhì)粒(命名為pGEM-TEasy-DsRedl)用限制性內(nèi)切酶BamHI和PvuI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下質(zhì)粒10X緩沖液BSABamHIPvuIddH20總共pGEM-TEasy-DsRedl10u12u10.5u10.5u10.5u16.5u120u1。對(duì)攜帶EGFP基因的質(zhì)粒(命名為pGEM-TEasy-EGFP)用限制性內(nèi)切酶BssHII和NsiI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下:_質(zhì)粒10XBSABssHIINw'IddH20總共緩沖液pGEM-TEasy-EGFP10ul2ul0.5yl0.5ul0.5ul6.5ul20yl。酶切反應(yīng)條件均為37'C水浴酶切過夜。然后，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中，攜帶DsRedl基因的質(zhì)粒pGEM-TEasy-DsRedl的酶切鑒定結(jié)果如圖6A所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1-6為挑選的1-6號(hào)單克隆質(zhì)粒的BamHI和PvuI雙酶切產(chǎn)物，泳道7為DsRedl基因片段)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得3015bp和717bp的DNA條帶，其中1,3，4，5號(hào)單克隆為陽性克隆，與預(yù)期結(jié)果一致，最后將經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含有DsRedl基因的重組大腸桿菌克隆載體pGEM-TEasy-DsRedl;攜帶EGFP基因的質(zhì)粒pGEM-TEasy-EGFP的酶切鑒定結(jié)果如圖6B所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1-6為挑選的1-6號(hào)單克隆質(zhì)粒的BssHII和NsiI雙酶切產(chǎn)物)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得3015bp和740bp的DNA條帶，其中1,2,4，5，6號(hào)單克隆為陽性克隆，與預(yù)期結(jié)果一致，最后將經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含有EGFP基因的重組大腸桿菌克隆載體pGEM-TEasy-EGFP。三、重組載體pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP和pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的構(gòu)建1、pVAXl-IRES-DsRedl的構(gòu)建1)酶切將步驟二獲得的攜帶DsRedl基因的陽性重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-DsRedl和實(shí)施例1構(gòu)建的真核表達(dá)載體pVAXl-IRES用限制性內(nèi)切酶BamHI和PvuI進(jìn)行雙酶切，37°C水浴過夜，酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>然后，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖7所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道2為攜帶DsRedl基因的陽性重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-DsRedl的BamHI和PvuI雙酶切產(chǎn)物，泳道4為pVAXl-IRES的BamHI和PvuI雙酶切產(chǎn)物)，pGEM-TEasy-DsRedl經(jīng)雙酶切獲得717bp的DNA條帶，pVAXl-IRES經(jīng)雙酶切可獲得大小約為3600bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。2)酶切產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化717bp的DsRedl基因和3600bp的線性化質(zhì)粒pVAXl-IRES的條帶，然后將純化后的目的基因DsRedl和線性化載體pVAXl-IRES進(jìn)行連接，16。C連接lh，連接體系如下DsRedl基因5^1pVAXl-IRES載體5plLigationMix10u1總體積20^1。然后，用與與實(shí)施例l步驟二中相同的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞。3)陽性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定挑取在含卡那霉素(50iig/mL)LB抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落8個(gè)(編號(hào)l-8)，分別接種于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(5mL/管)，37。C搖床培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和PvuI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下質(zhì)粒10XBSABamHIPvuIddH20心z、緩沖液pVAXl-IRES-DsRedl10ul2u10.5u10.5y10.5n16.5u120ii1。酶切鑒定結(jié)果如圖8A所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1-8為挑選的1-8號(hào)單克隆質(zhì)粒的BamHI和PvuI雙酶切產(chǎn)物)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得3600bp和717bp的DNA條帶，其中1，2，4號(hào)單克隆為陽性克隆，與預(yù)期結(jié)果一致，最后將經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含有DsRedl基因的重組真核表達(dá)載體，命名為pVAXl—IRES—DsRedl。2、pVAXl-IRES-EGFP的構(gòu)建1)酶切將步驟二獲得的攜帶EGFP基因的陽性重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-EGFP和實(shí)施例1構(gòu)建的真核表達(dá)載體pVAX1-IRES用限制性內(nèi)切酶NsiI和BssHII進(jìn)行雙酶切，37°C水浴過夜，酶切體系如下:_pGEM-TEasy-EGFPpVAXl-IRES<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>然后，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖7所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1為攜帶EGFP基因的陽性重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-EGFP的NsiI和BssHII雙酶切產(chǎn)物，泳道3為pVAXl-IRES的NsiI和BssHII雙酶切產(chǎn)物)，pGEM-TEasy-EGFP經(jīng)雙酶切可獲得740bp的DNA條帶，pVAXl-IRES經(jīng)雙酶切可獲得3600bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。2)酶切產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化740bp的EGFP基因和3600bp的線性化質(zhì)粒pVAXl-IRES的條帶，然后將純化后的目的基因EGFP和線性化載體pVAXl-IRES進(jìn)行連接，16。C連接lh，連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>然后，用與與實(shí)施例l步驟二中相同的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。3)陽性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定挑取在含卡那霉素(50yg/mL)LB抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落3個(gè)(編號(hào)l-3)，分別接種于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(5mL/管)，37'C搖床培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NsiI和BssHII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>酶切鑒定結(jié)果如圖8B所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1-3為挑選的1-3號(hào)單克隆質(zhì)粒的NsiI和BssHII雙酶切產(chǎn)物)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得3600bp和740bp的DNA條帶，其中3號(hào)單克隆為陽性克隆，與預(yù)期結(jié)果一致，最后將經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含有EGFP基因的重組真核表達(dá)載體，命名為pVAXl-IRES-EGFP。3、pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的構(gòu)建1)酶切將步驟1獲得的攜帶DsRedl基因的真核表達(dá)載體pVAXl-IRES-DsRedl用限制性內(nèi)切酶NsiI和BssHII進(jìn)行雙酶切，37。C水浴過夜，酶切體系如下pVAX1—IRES—DsRed1DNA30y1iox緩沖液5w1100XBSA0,5u1NsiIIn1BssHIIlu1雙蒸水12.5ix1總體積50ii1。然后，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)雙酶切可獲得大小約為4300bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。2)酶切產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化大小約為4300bp的線性化質(zhì)粒pVAXl-IRES-DsRedl的條帶，然后將純化后的EGFP基因和線性化質(zhì)粒pVAXl-IRES-DsRedl進(jìn)行連接，16'C連接lh，連接體系如下EGFP基因5|ilpVAX卜IRES-DsRedl5^1LigationMix10y1總體積2(^1。然后，用與與實(shí)施例l步驟二中相同的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。3)陽性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定挑取在含卡那霉素(50ug/mL)LB抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落3個(gè)(編號(hào)1-3)，分別接種于含卡那霉素(50yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(5mL/管)，37"C搖床培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下質(zhì)粒10xBSAXhoIBamHIddH20總共緩沖液pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP10ul2ul0.5u10.5ul0.5u16.5ul20ul。酶切鑒定結(jié)果如圖8C所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道1為挑選的單克隆質(zhì)粒，泳道2為挑選的單克隆質(zhì)粒的XhoI和BamHI雙酶切產(chǎn)物)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可獲得3600bp和2100bp左右的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，最后將經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含有DsRedl基因和EGFP基因的重組真核表達(dá)載體，命名為pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP。4)大量提質(zhì)粒將鑒定正確的分別轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP及pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的重組克隆菌液過夜培養(yǎng)，按照Promega公司W(wǎng)izardPlusMinipr印sDNAPurificationsystem并參照產(chǎn)品說明書提取質(zhì)粒。四、重組真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及表達(dá)水平檢測(cè)1、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞采用脂質(zhì)體法將步驟三構(gòu)建的三種真核表達(dá)載體pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP及pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP分別轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，具體方法為將293T細(xì)胞(購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心)培養(yǎng)于含10X胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL公司)中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，用0.25%胰酶(或EDTA)常規(guī)消化后接種入6孔培養(yǎng)板中，于37°C、50mL/L0)2孵育箱中培養(yǎng)24h(細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80-90%)，然后將陽性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-Nl、pDsRedl-Nl和鑒定正確的重組質(zhì)粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP和pVAX卜DsRed1-IRES-EGFP分別在Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofect.amine2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體操作參照試劑盒說明書，空白對(duì)照組只加入等量的空白脂質(zhì)體。2、激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)各種重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況用Bio-Rad公司的Radiance210(T激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)步驟1的各種重組質(zhì)粒在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，檢測(cè)方便包括以下步驟a.轉(zhuǎn)染48h后用0.25%的胰酶消化293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞，輕輕吹打制備成單細(xì)胞懸液；b.用冰浴預(yù)冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗細(xì)胞3次；c.用1%多聚甲醛重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液滴到載玻片上，封片劑封存；d.用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)各種重組質(zhì)粒的表達(dá)情況。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的293T細(xì)胞的激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果如圖9所示(a:pDsRed1-Nl;b:pEGFP-Nl;c:pVAXHRES-DsRedl;d:pVAXHRES-EGFP;e-g:pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP;h:空白對(duì)照)，轉(zhuǎn)染陽性對(duì)照質(zhì)粒pDsRedl-Nl和pEGFP-Nl的293T細(xì)胞均有紅色或綠色的熒光呈現(xiàn)(a,b)，證明轉(zhuǎn)染體系建立成功；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP的293T細(xì)胞也發(fā)出紅色或綠色的熒光(c，d)，證明連入的DsRedl、EGFP基因均可以在已構(gòu)建的pVAXl-IRES載體中正常表達(dá)；分別在575nm或518nm兩種波長(zhǎng)激發(fā)下觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的293T細(xì)胞，可見紅色或綠色熒光呈現(xiàn)(e,f)，當(dāng)用575nm和518nm兩種波長(zhǎng)共同激發(fā)時(shí)，可見某些293T細(xì)胞呈黃色(g)，證明連入pVAXl-IRES載休中IRES編碼序列上游的DsRedl基因和下游的EGFP基因不僅可以分別在293T細(xì)胞中表達(dá)，而且可以在同一個(gè)細(xì)胞中通過IRES的作用進(jìn)行共表達(dá)，證明本發(fā)明的DNA疫苗載體pVAXl-IRES具有同時(shí)啟動(dòng)兩種基因進(jìn)行共表達(dá)的功能。3、流式細(xì)胞儀測(cè)定各種重組質(zhì)粒的瞬時(shí)表達(dá)效率用BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定步驟1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各種重組質(zhì)粒在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)效率，具體方法如下a.轉(zhuǎn)染48h后用0.25%的胰酶消化293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞，輕輕吹打制備成單細(xì)胞懸液；b.用冰浴預(yù)冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗細(xì)胞3次；c.用0.5mL1%多聚甲醛重懸細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞儀測(cè)定各種重組質(zhì)粒在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的各種重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)效率的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖10所示(A:空白對(duì)照；B:pDsRedl-Nl;C:pEGFP-Nl;D:pVAXl-IRES-DsRedl;E:pVAXl-IRES-EGFP;F:pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP(UL表示up-left，左上角，575nm，反應(yīng)的是只單獨(dú)表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞；LR即low-right,右下角，518nra，反應(yīng)的是只單獨(dú)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞；UR即up-right,右上角，575nm+518nm，雙表達(dá)即同一個(gè)細(xì)胞中既表達(dá)紅色熒光蛋白又表達(dá)綠色熒光蛋白；LL即low-left,左下角，表示的是雙陰的細(xì)胞)，可見質(zhì)粒pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP中DsRedl基因的表達(dá)情況為(10.24%+18.86%=29.10%),EGFP基因的表達(dá)情況(5.24%+18.86%=24.10%)，DsRedl基因和EGFP基因同時(shí)表達(dá)的情況(18.86%)。表明連入pVAX卜IRES載體中IRES編碼序列上游的DsRedl基因和下游的EGFP基因不僅可以分別在293T細(xì)胞中表達(dá)，而且可以在同一個(gè)細(xì)胞中通過IRES的作用進(jìn)行共表達(dá)，進(jìn)一步證明本發(fā)明的DNA疫苗載體pVAXl-IRES具有同時(shí)啟動(dòng)兩種基因進(jìn)行共表達(dá)的功能。實(shí)施例3、多耙點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗的構(gòu)建及真核表達(dá)一、抗原復(fù)合物2PAG融合基因的設(shè)計(jì)Survivin主要激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，Survivin的mRNA在體內(nèi)經(jīng)過不同的剪切方式可產(chǎn)生三種異構(gòu)體Survivin、Survivin-2B和Survivin-EX3,其中以Survivin-2B的自氨基端第80-88位氨基酸殘基為特異性靶點(diǎn)的抗腫瘤疫苗已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)階段。經(jīng)大量文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，Survivin-2B的T細(xì)胞抗原表位主要集中在自氨基端第5-28和第80-121位氨基酸殘基之間，因此選取這兩個(gè)區(qū)域作為本發(fā)明多靶點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗的靶點(diǎn)之一。從Genebank中查找人Survivin2B(醒-001012271)中相對(duì)應(yīng)于上述兩個(gè)區(qū)域的堿基序列(134-205，359-513),再通過連接臂"-nG-，其中n可以為K(賴氨酸)、R(精氨酸)、C(半胱氨酸)、Q(谷氨酰胺)、G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)，本實(shí)施例n為N(天冬酰胺)"編碼序列將兩段DNA序列連接從而構(gòu)成Sur融合基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示，全長(zhǎng)273bp，編碼91個(gè)氨基酸殘基。CTP37是位于hCGe鏈羧基端第109-145位氨基酸殘基的37肽，存在hCG的特異抗原表位。將人和猴的CTP37聯(lián)合使用構(gòu)建復(fù)合耙抗原，方法為從Genebank中查找人和猴的hCGP-CTP37的編碼序列[人:NM一033043;猴麗一001032928(同源性比較結(jié)果，猴人二76%;猴小鼠二100%)，通過連接臂-nG-(n可以為K、R、C、Q、G或N，本實(shí)施例n為N)將兩個(gè)物種的CTP37編碼序列相連接構(gòu)成融合基因hmCTP，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示，全長(zhǎng)為228bp，編碼76個(gè)氨基酸殘基。將融合基因Sur的3'端和融合基因hmCTP的5'端相連接即得到抗原復(fù)合物2PAG融合基因，其結(jié)構(gòu)式意圖如圖ll所示。二、抗原復(fù)合物2PAG融合基因的PCR擴(kuò)增1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)Sur和hmCTP基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))，其中Sur-Fl的5，端含有限制性內(nèi)切酶XhoI識(shí)別位點(diǎn)，hmCTP-Rl的5'端含有限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，Sur-SC-Rl和Sur-SC-Fl有20bp的互補(bǔ)區(qū)域，具體引物序列如下Sur-Fl:5'-CCCGGCTCGAGACATTGCCCCCTG-3'Sur-SORh5，-CATCACAGGTCTTCTTATTGTTGG-3'Sur-SC-Fh5，-CAATAAGAAGACCTGTGATGACCCCCG-3，MCG-R1:5,-GGCCCGAATTCTTGTGGAAGGAAAGGG-3，。2、抗原復(fù)合物2PAG融合基因的PCR擴(kuò)增首先，由北京擎天生物技術(shù)有限公司合成上述兩條融合基因Sur和hmCTP，并分別連接至T-easy載體pGEM-TEasy(TaKaRa公司)中，將含有融合基因Sur的重組載體命名為Sur-T-easy,將含有融合基因hmCTP的重組載體命名為hmCTP-T-easy。然后，分別以含有合成基因的質(zhì)粒Sur-T-easy和hmCTP-T-easy為模板，PCR擴(kuò)增出融合基因Sur-SC和SC-hmCTP。其中，Sur-SC的3'端和SC-hmCTP的5'端含有20bp的互補(bǔ)序列。PCR擴(kuò)增體系為10xPCR緩沖液5jal，dNTPsMixture(2.5raM)5yl，引物(20pM)Sur-Fl和Sur-SC-Rl(或Sur-SC-Fl和hmCTP-Rl)各lpl，模板Sur-T-easy(或hmCTP-T-easy)1^1,TaqDNA聚合酶(5U/ul)lul，加去離子水至50ul。PCR反應(yīng)條件為先94。C預(yù)變性5rain;然后94。C變性30s，58'C退火30s，72。C延伸45s，共5個(gè)循環(huán)最后72t:繼續(xù)延伸10rain。反應(yīng)結(jié)束后，取5n1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示(泳道M為DL2000DNAMarker,泳道l為融合基因Sur-SC，泳道2為融合基因SC-hmCTP)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了273bp和228bp的DNA條帶，與預(yù)期大小一致。用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化融合基因Sur-SC(273bp)和融合基因SC-hmCTP(228bp)的目的條帶。再以PCR擴(kuò)增的融合基因Sur-SC和SC-hmCTP稀釋50倍后各取1^1共同為模板，用搭橋PCR的方法擴(kuò)增抗原復(fù)合物2PAG融合基因，在引物Sur-Fl和hmCTP-Rl的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，取5nlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示(泳道M為DL2000DNAMarker(購自TaKaRa公司)，泳道3為PCR擴(kuò)增的抗原復(fù)合物2PAG融合基因)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了523bp的DNA條帶，與預(yù)期大小一致。用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化該抗原復(fù)合物2PAG融合基因的目的條帶。三、人GM-CSF和B7.l融合基因的獲得按GeneBank上公開的人GM-CSF(NM-000758)和B7.1(腿-005191)的編碼序列設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增引物序列，序列如下GMF1(上游引物)5'-CCG」7ATGTGGCTGCAGAGCCTG-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NsiI識(shí)別位點(diǎn))GMR1(下游引物)5'-GCCGCCGCGTCGACCCCTGCCGCCCTCCTGGACTGGCTCCCAGC-3';B7Fl(上游引物)5'-GGCGGCAGGGGTCGACGCGGCGGCGGTCTTTCTCACTTCTGTTC-3，B7R1(下游引物)5，-CCG^^TTATACAGGGCGTACACTTTCCC-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BSSHII識(shí)別位點(diǎn))。首先，由北京擎天生物技術(shù)有限公司合成人GM-CSF和B7.l的編碼序列，并分別連接至pGEM-TEasy載體(購自TaKaRa公司)中，將含有人GM-CSF編碼序列的重組載體命名為pGEM-TEasy-GM-CSF，將含有B7.1編碼序列的重組載體命名為pGEM-TEasy-B7.1。然后，分別以含有合成基因的質(zhì)粒pGEM-TEasy-GM-CSF和pGEM-TEasy-B7.l為模板，在GMF1和GMR1的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增GM-CSF基因全長(zhǎng)序列，在B7F1和B7R1的引導(dǎo)下PC財(cái)廣增B7.l基因全長(zhǎng)序列，然后將各自的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后各取lpl共同作為模板，在引物GMF1和B7R1的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增GM-CSF和B7.l融合基因。具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參見步驟二。反應(yīng)結(jié)束后，取5ylPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1W瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖13所示(泳道M為DL2000DMMarker,泳道l為-人GM-CSF基因，泳道2為B7.l基因，泳道3為PCR擴(kuò)增的人GM-CSF因子和B7.l融合基因)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了1245bp的DNA條帶，與預(yù)期大小一致。用博大泰克公司的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒并參照試劑盒說明書回收并純化該人GM-CSF和B7.l融合基因的目的條帶。人GM-CSF基因和B7.l基因通過8肽編碼序列連接，表達(dá)后可以在體內(nèi)普遍存在的Furin蛋白酶作用下使人GM-CSF因子和B7.l分子分離，從而不影響它們的空間構(gòu)象，以利于發(fā)揮各自的功能。四、DNA疫苗pVAX1-2PFcGB的構(gòu)建1、含有抗原復(fù)合物2PAG融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-2PAG-Fc-GPI的構(gòu)建將步驟二獲得的抗原復(fù)合物2PAG融合基因用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的含有人Igk鏈前導(dǎo)信號(hào)肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)肽基因序列的真核表達(dá)載體pCI-GPI(在Promega公司的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo+的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成，構(gòu)建方法為在pCI-neo+原多克隆位點(diǎn)處的限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI之間插入通用序列構(gòu)建而成，該通用序列的基因順序?yàn)?，-Nhe1_人Igk鏈前導(dǎo)信號(hào)肽(sig)編碼序列-XhoI-EcoRV-EcoRI-人IgGFc段編碼序列-糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)肽的編碼序列-Xba1-3'，外源免疫分子基因可以在NheI—EcoRI之間選擇合適的酶切位點(diǎn)插入。pCI-GPI除含有人IgGFc段編碼序列和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)肽的編碼序列外，還含有pCI載體的主要骨架結(jié)構(gòu)，如CMV早期啟動(dòng)子、嵌合內(nèi)含子、Neo篩選標(biāo)記、SV40增強(qiáng)子和氨節(jié)抗性基因A即r+等)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，用引物Sur-Fl和hmCTP-R1進(jìn)行菌落PCR鑒定，然后提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Nhe工和NotI進(jìn)行雙酶切鑒定，PCR及酶切鑒定結(jié)果如圖14所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:2PAG融合基因的XhoI+EcoRI酶切產(chǎn)物；泳道2:pCI-GPI的XhoI+EcoRI酶切產(chǎn)物；泳道3:菌落PCR鑒定結(jié)果；泳道4:pCI-neo-2PAG-Fc-GPI質(zhì)粒；泳道5:pCI-neo-2PAG-Fc-GPI的NheI十NotI酶切產(chǎn)物)，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切可獲得5472bp和2473bp的DNA條帶，將鑒定正確的陽性克隆菌株由北京三博生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得序列及插入位置均正確含有抗原復(fù)合物2PAG融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pCI-2PAG-Fc-GPI。2、真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-sig-2P-FC-GPI-IRES的構(gòu)建將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pCI-2PAG-Fc-GPI先用限制性內(nèi)切酶NotI進(jìn)行單酶切并經(jīng)純化后，用Klenow酶(TaKaRa公司)并參照試劑盒說明書補(bǔ)平單酶切后產(chǎn)生的粘性末端，然后將純化后的產(chǎn)物再用限制性內(nèi)切酶NheI進(jìn)行單酶切，隨后切膠回收含有2473bp線性化的sig-2PAG-FC-GPI的目的片段(5'端為NheI酶切后產(chǎn)生的粘性末端，3'端為IQenow補(bǔ)平后產(chǎn)生的平端)。然后，將實(shí)施例l構(gòu)建的真核表達(dá)載體pVAXl-IRES用限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRV進(jìn)行雙酶切和純化后與sig-2PAG-Fc-GPI進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，用引物Sur-Fl和hmCTP-Rl進(jìn)行菌落PCR鑒定，然后提質(zhì)粒，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NheI和ClaI進(jìn)行雙酶切鑒定，菌落PCR及酶切鑒定結(jié)果如圖15所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:sig-2PAG-Fc-GPI/NotI—Klenow—NheI;泳道2:pVAXl-IRES的NheI+EcoRV酶切產(chǎn)物；泳道3:菌落PCR鑒定結(jié)果；泳道4:pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-IRES質(zhì)粒；泳道5:pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-IRES的NheI+ClaI酶切產(chǎn)物)，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切可獲得3600bp和2473bp的DNA條帶，將鑒定正確的陽性克隆菌株由北京三博生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得序列及插入位置均正確含有sig-2PAG-FC-GPIDNA片段的真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pVAX-sig_2P-FC-GPI-IRES。3、pVAXl-IRES-GM/B7的構(gòu)建將步驟三擴(kuò)增的GM-CSF和B7.l融合基因用限制性內(nèi)切酶NsiI和BSSHII進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pVAXl-IRES進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NsiI和BSSHII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖16所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:pVAXl-IRES-GM/B7質(zhì)粒；泳道2:GM-CSF和B7.l融合基因;泳道3:pVAXl-IRES-GM/B7質(zhì)粒的NsiI+BSSHn酶切產(chǎn)物)，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切可獲得3600bp和1245bp的DNA條帶，將鑒定正確的陽性克隆菌株由北京三博生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得序列及插入位置均正確含有GM-CSF和B7.l融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pVAX1-IRES-GM/B7。4、DNA疫苗pVAX卜2PFcGB的獲得將步驟2鑒定正確后的陽性重組質(zhì)粒pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-IRES用限制性內(nèi)切酶NheI和ClaI進(jìn)行雙酶切后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化2473bp的含有sig-2PAG-FC-GPI的目的片段，然后再與經(jīng)NheI和ClaI雙酶切的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX卜IRES-GM/B7進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NsiI和BSSHII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖17所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:sig-2PAG-Fc-GPI的NheI+ClaI酶切產(chǎn)物；泳道2:pVAXl-IRES-GM/B7的NheI+ClaI酶切產(chǎn)物；泳道3:PCR鑒定；泳道4:pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-GM/B7質(zhì)粒；泳道5:pVAX卜sig-2PAG-Fc-GPI-IRES的NheI+ClaI酶切產(chǎn)物)，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切可獲得大小約為2000bp的DNA條帶，將鑒定正確的陽性克隆菌株由北京三博生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得序列及插入位置均正確的真核表達(dá)質(zhì)粒，即本發(fā)明的多靶點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗，命名為pVAX1-sig-2PAG-Fc-GPI-GM/B7(簡(jiǎn)稱pVAXl-2PFcGB)。五、多靶點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗的真核表達(dá)1、DNA疫苗pVAX1-2PFcGB的真核表達(dá)采用與實(shí)施例2中相同的脂質(zhì)體法將步驟四構(gòu)建的DNA疫苗pVAXl-2PFcGB轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，空白對(duì)照組只加入等量的空白脂質(zhì)體，分別用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)。2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)采用與實(shí)施例2中相同的方法用BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定歩驟1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后pVAXl-2PFcGB在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)效率，在pVAXl-2PFcGB中，2PAG融合基因的羧基端融合了人IgGFc段基因，可作為檢測(cè)融合蛋白表達(dá)的標(biāo)簽，因此分別用FITC標(biāo)記的兔抗人IgG(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司)、PE標(biāo)記的兔抗人B7的抗體(EBioScience公司)與轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞進(jìn)行孵育，用以檢測(cè)插入片段2PAG-Fc-GPI和載體中GM-CSF/B7.1融合基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖18所示(A:空白對(duì)照組(FITC);B:實(shí)驗(yàn)組(FITC);C:空白對(duì)照組(PE);D:實(shí)驗(yàn)組(PE))，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，293T細(xì)胞中插入片段2PAG-Fc-GPI的陽性表達(dá)率為44.46%，平均熒光強(qiáng)度為334.17;載體中GM-CSF/B7.1的陽性表達(dá)率為52.26%，平均熒光強(qiáng)度為497.86，表明連接入pVAXl-IRES載體中IRES編碼序列上游的2PAG-Fc-GPI基因片段和下游的GM-CSF/B7.1融合基因均獲得表達(dá)。3、免疫熒光檢測(cè)采用與實(shí)施例2中相同的方法處理細(xì)胞，滴片后在熒光顯微鏡下直接進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。分別用FITC標(biāo)記的兔抗人IgG、PE標(biāo)記的兔抗人B7的抗體與轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞進(jìn)行孵育，用以檢測(cè)插入片段2PAG-Fc-GPI和載體中GM-CSF/B7.1融合基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果如圖19所示(A:經(jīng)FITC-IgG抗體孵育的293T細(xì)胞；B:經(jīng)PE-B7抗體孵育的293T細(xì)胞)，經(jīng)熒光顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pVAXl-2PFcGB48h后的293T細(xì)胞均有熒光顯示，且主要分布于細(xì)胞膜上(圖6)，而未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAXl-2PFcGB的293T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證明插入片段2PAG-Fc-GPI和載體中GM-CSF/B7.1融合基因均可以有效表達(dá)。實(shí)施例4、多靶點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗pVAXl-2PFcGB的抑瘤活性檢測(cè)用下述方法檢測(cè)本發(fā)明多靶點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗pVAXl-2PFcGB的抑瘤活性，同時(shí)以實(shí)施例3構(gòu)建的質(zhì)粒pVAX1-2PAG、pVAXl-2PAG-Fc-GPI(結(jié)構(gòu)示意圖見圖29)和pVAX1-IRES-GM/B7為對(duì)照，檢測(cè)方法如下一、多靶點(diǎn)復(fù)合抗原抗腫瘤基因疫苗pVAXl-2PFcGB免疫小鼠1、免疫用質(zhì)粒DNA的大量提取與純化用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司"B型超純質(zhì)粒大量快速提取試劑盒"并參照試劑盒說明書大量制備免疫用質(zhì)粒DNA，具體方法包括以下步驟a.將200mL攜帶pVAXl-2PFcG的大腸桿菌DH5a重組菌37"C培養(yǎng)12小時(shí)后收集菌體，加入7mL溶液l，振蕩至徹底懸??；b.加入10.5mL溶液2，輕輕顛倒混勻，使菌體充分裂解，隨后冰上放置5分鐘；c.加入IO.5mL溶液3，輕輕顛倒混勻，室溫放置10分鐘，4°C、12，000rpm離心15min;d.將上清與0.6倍體積的異丙醇混勻后，4'C、10,000rpm離心20min;e.收集沉淀，溶于2mL雙蒸水中并加入80u110mg/mLRNaseA，37。C保溫30分鐘；f.加入等體積的結(jié)合緩沖液，混勻后移入吸附柱，室溫、12，OOOrpm離心lmin;g.倒掉廢液，加入500nl去內(nèi)毒素緩沖液，室溫、2，000rpm離心lmin，重復(fù)l次后，再次于室溫、12，000rpm離心3min;盡量去除去內(nèi)毒素緩沖液；h.倒掉廢液，加入800yl漂洗緩沖液，靜置l分鐘后12,000rpm離心lmin，重復(fù)2次后，再次12,000rpm離心2min，盡量去除漂洗緩沖液；1、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中央加入50nl無菌水，室溫下靜置2-5min，12,000rpm離心2min，收集洗脫液，-20。C貯存?zhèn)溆?。收集洗脫液即為提純的質(zhì)粒DNA，加入10XPBS使質(zhì)粒咖A溶于PBS溶液。紫外分光光度法測(cè)定DNA含量和純度，結(jié)果DNA含量約為l^gAa，純度達(dá)90%，-20'C保存。2、動(dòng)物分組將6周齡、體重18-20g的雌性Balb/c小鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為6組，每組9只，A組為PBS對(duì)照組，B組為pVAXl空載體組，C組為pVAXl-IRES-GM/B7組，D組為pVAX1-2PAG組，E組為pVAXl-2PAG-Fc-GPI組，F(xiàn)組為pVAXl-2PFcGB組(基因疫苗pVAX1-2PFcGB)。3、皮下移植瘤攻擊收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心)，制備單細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度至2X106個(gè)/mL，于-d5天在小鼠背部右側(cè)皮下接種100W細(xì)胞懸液即2Xl()S個(gè)/只。4、Balb/c小鼠的免疫免疫方案如圖20所示，Balb/c小鼠經(jīng)皮下移植瘤攻擊5天后，開始接種疫苗。免疫方式采用股四頭肌肌肉注射，A組注射100WraS，其余各組分別注射相應(yīng)的DNA質(zhì)粒100Hg/只，分別于dO、d5、dl5和d20共免疫4次。每次免疫前，首先注射100y10.25%布比卡因預(yù)處理接種部位，72h后在相同部位接種疫苗。于末次免疫后第5天(d25)檢測(cè)小鼠體內(nèi)抗體的產(chǎn)生情況并收集每組2只小鼠的脾細(xì)胞，準(zhǔn)備CTL殺傷實(shí)驗(yàn)；d30天斷頸處死每組其余各只小鼠并摘取腫瘤組織稱重。二、免疫效果檢測(cè)1、疫苗免疫保護(hù)效果觀察和檢測(cè)1)免疫小鼠的成瘤時(shí)間首先給Balb/c小鼠皮下注射接種2Xl(f個(gè)EMT6細(xì)胞，接種細(xì)胞后5d，開始給各組小鼠股四頭肌分別注射相應(yīng)的質(zhì)粒DNA或PBS，觀察并記錄各組小鼠的腫瘤結(jié)節(jié)形成時(shí)間(可捫及，長(zhǎng)徑約2-3mm)。各組免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1和圖21所示，可以看出，各免疫組的腫瘤結(jié)節(jié)形成時(shí)間存在不同程度的差別。A組的成瘤時(shí)間最甲-，約6天左右；B組、C組的成瘤時(shí)間相差不多，無顯著性差別(P>0.05)。含有抗原復(fù)合物2PAG的D、E和F組小鼠成瘤時(shí)間均晚于對(duì)照組，其中D組小鼠的成瘤時(shí)間較早，約8天左右；E組次之，而F組小鼠的成瘤時(shí)間最晚，直到12天左右才可以檢測(cè)到腫瘤結(jié)節(jié)的形成。E組和F組與對(duì)照組相比，小鼠的成瘤時(shí)間差異顯著(P<0.05)。表l各組免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤時(shí)間平均成瘤時(shí)間(天)A組(PBS)6±1.01B組(pVAXl空載體)6.28±0.81C組(pVAXl-IRES-GM/B7空載體)6.57±1.13D組(pVAXl-2PAG)8.14±0.99E組(pVAXl-2PAG-Fc-GPI)9.57±1.23《F組(pVAXl-2PFcGB)12.29±1.26※注※與對(duì)照組比較，該組小鼠成瘤潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)2)免疫小鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)情況檢測(cè)預(yù)先選定各免疫組中的7只小鼠，皮下注射接種2X1()5個(gè)/只EMT6細(xì)胞后第5天開始接種疫苗。從小鼠皮下移植瘤攻擊后開始至處死小鼠的35天內(nèi)，每2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤的垂直長(zhǎng)徑和垂直短徑，并通過如下公式計(jì)算每組小鼠體內(nèi)腫瘤的平均體積，繪制其腫瘤生長(zhǎng)曲線，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)曲線進(jìn)行線性回歸并對(duì)其斜率做t檢驗(yàn)，小鼠體內(nèi)腫瘤的平均體積的計(jì)算公式如下腫瘤體積(nim3)=L垂直長(zhǎng)徑X垂直短徑的平方免疫小鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)曲線如圖22所示，pVAXl空載體組(B組)和不含復(fù)合抗原2PAG的pVAXl-IRES-GM/B7組(C組)小鼠體內(nèi)的內(nèi)移植生長(zhǎng)情況與PBS對(duì)照組之間無顯著差別(P>0.05);經(jīng)疫苗治療的D、E和F組內(nèi)的小鼠，其無瘤潛伏期均比對(duì)照組延長(zhǎng)，腫瘤的生長(zhǎng)均比對(duì)照組緩慢(P<0.05)。其中，E組和F組與PBS對(duì)照組相比，差異極其顯著(P<0.01)。F組內(nèi)小鼠的無瘤潛伏期最長(zhǎng)，在d22前其腫瘤的生長(zhǎng)速度最為緩慢，與E組相比有顯著性差異(P<0.05)，但當(dāng)d22之后差異不顯著(P>0.05)，這可能與第二次與第三次免疫之間時(shí)間的延長(zhǎng)有關(guān)，未能及時(shí)抑制住腫瘤的生長(zhǎng)。3)皮下移植瘤攻擊后35天小鼠的存活情況皮下注射接種2X105個(gè)/只EMT6細(xì)胞后35天內(nèi)，各組小鼠(7只/組)的存活情況如表2所示，PBS對(duì)照組和pVAXl空載體組均有l(wèi)只小鼠自然死亡，其余各組的7只小鼠均存活，表明本發(fā)明的基因疫苗具有較高的安全性。表2皮下移植瘤攻擊后35天各組免疫小鼠的存活情況<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>4)免疫小鼠對(duì)皮下移植瘤的抑制作用皮下注射接種2X105個(gè)/只EMT6細(xì)胞后35天斷頸處死各組內(nèi)的存活小鼠，摘取腫瘤組織，并拍照。稱量各組瘤重后，根據(jù)公式計(jì)算各組疫苗對(duì)腫瘤的抑制率，腫瘤抑制率的計(jì)算公式如下.-對(duì)照組平均瘤重一免疫組平均瘤重腫瘤抑制率(％)=-xlOO%對(duì)照組平均瘤重皮下接種EMT6細(xì)胞并經(jīng)疫苗免疫30天后，各免疫組小鼠的離體腫瘤體積比較結(jié)果如圖23所示(A:PBS空白對(duì)照組;B:pVAXl組;C:pVAXl-IRES組;D:pVAXl-2PAG組；E:pVAXl-2PAG-Fc-GPI組；F:pVAXl-2PFcGB組)，皮下移植瘤攻擊35天后各組小鼠的平均瘤重如圖24所示，各免疫組的腫瘤抑制率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3和圖25所示，結(jié)果顯示，A組、B組和C組的平均瘤重相近，沒有顯著性差異(P>0.05);與對(duì)照組相比，D組、E組和F組的平均瘤重均明顯降低，表明本發(fā)明含復(fù)合抗原基因2PAG的基因疫苗具有較高的腫瘤抑制率(P<0.01);其中F組的平均瘤重最小，具有最高的腫瘤抑制率，與對(duì)照組的差異極其顯著(P<0.001)。表3各組免疫小鼠對(duì)腫瘤的抑制作用平均瘤重(g)腫瘤抑制率(％)A組(PBS)3.78±0.59—B組(pVAXl空載體)3.50±0.447.4C組(pVAXl-IRES-GM/B7空載體)3.33±0.5111.9D組(pVAXl-2PAG)1.98±0.7547.6※E組(pVAXl-2PAG-Fc-GPI)1.41±0.3362.7※F組(pVAXl-2PFcGB)0.86±0.3177.27碰注※與對(duì)照組相比，該組小鼠對(duì)腫瘤的抑制作用非常顯著(P〈0.01);《《P<0.001。2、血清抗體的ELISA檢測(cè)末次免疫后第5天(d25)，取D、E和F組免疫小鼠的尾靜脈血，室溫放置3h后3000卬m離心10min，取上層血清，用Sur融合蛋白包板，用ELISA法檢測(cè)抗體滴度，同時(shí)設(shè)立免疫前鼠血清的陰性對(duì)照組，檢測(cè)方法包括以下步驟a.包被蛋白用包被液稀釋至終濃度為3ug/mL，包被ELISA板，4'C過夜；b.洗滌甩棄ELISA板孔中包被液，PBST洗滌1次；c.封閉2X酪蛋白室溫封閉4h，棄去封閉液，拍干ELISA板；d.檢測(cè):免疫鼠血清用PBS倍比稀釋后加入各孔，飾l/孔，37°C、30min;e.標(biāo)記PBST洗滌后加入服P標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司)，37"C反應(yīng)20min;f.顯色PBST洗滌后，TMB顯色10min，2M硫酸終止反應(yīng)。用SPECTRAIII酶聯(lián)儀檢測(cè)450mn的OD值。結(jié)果判定待測(cè)樣品的OD值(P)與陰性對(duì)照的OD值(N)之比大于或等于2.1(P/N》2.1)為陽性，顯示陽性結(jié)果的最大抗體稀釋度為免疫小鼠血清的抗體效價(jià)。D、E和F組免疫小鼠血清的抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖26所示，D、E和F組免疫小鼠血清中均有特異性抗體出現(xiàn)，D組的血清抗體效價(jià)為1:3200，E組和F組相同，均為1:6400。上述檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的基因疫苗具有較好的免疫原性。3、免疫小鼠CTL殺傷活性的測(cè)定測(cè)定免疫小鼠CTL殺傷活性，具體方法包括以下歩驟1)免疫小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備末次免疫后第5天(d25)，斷頸處死各組中剩余的兩只小鼠，在無菌條件下取小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞懸液，具體操作如下a.打開超凈工作臺(tái)的紫外燈照射30分鐘，取小鼠拉頸處死，自來水沖洗后浸泡于75X乙醇中5min，隨即放入超凈臺(tái)內(nèi)小鼠解剖板上左側(cè)臥位；b.用75%乙醇消毒小鼠腹部，無菌手術(shù)開腹腔取出脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，剪成(5-7段)放于200目不銹鋼網(wǎng)篩，將網(wǎng)篩置于預(yù)先放入2-3mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中，用研磨棒擠壓出脾細(xì)胞，盡量擠壓干凈；c.用適量無血清RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗鋼網(wǎng)，冰浴中靜置3-5min，取上清部分移入離心管中，補(bǔ)加培養(yǎng)液到10mL;d.準(zhǔn)備兩只透明刻度離心管，分別加入4mL淋巴細(xì)胞分離液，將脾細(xì)胞懸液緩慢加在分離液上方，1500rpm離心20min;e.離心后取白膜，加入10mL培養(yǎng)基洗2次(1000rpm離心10min);f.最后將細(xì)胞重懸于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中(不完全培養(yǎng)基中加入20XFCS)。用淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，一般來講，脾細(xì)胞懸液中可以收獲108的細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后可獲得107的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1X107ihL，加入維持淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子PHA-P2Pg/mL和IL-220IU/mL，放入C02孵箱中培養(yǎng)。2)效應(yīng)細(xì)胞的制備取免疫后小鼠的脾單個(gè)核細(xì)胞懸液，力卩PHA-P2Pg/mL和IL-21011VinL維持淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，為檢測(cè)特異性殺傷效應(yīng)，加入常規(guī)方法制備的重組Sur原核蛋白，工作濃度25M/mL，與細(xì)胞共刺激，C02孵箱中培養(yǎng)3天后用作效應(yīng)細(xì)胞。3)耙細(xì)胞的制備將小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6在C02孵箱中培養(yǎng)備用。4)乳酸脫氫酶(LDH)-釋放法測(cè)殺傷活性A、反應(yīng)體系的建立效耙細(xì)胞共孵育殺傷過程，在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，整個(gè)反應(yīng)體系要設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照孔和試驗(yàn)孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均為200W體系，包括以下內(nèi)容a.不同濃度效應(yīng)細(xì)胞LDH自然釋放孔(由效應(yīng)細(xì)胞與無血清RPMI-1640培養(yǎng)基組成)收集效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度倍比稀釋，每孔50W;b.靶細(xì)胞LDH自然釋放孔(靶細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基組成)每孔加入靶細(xì)胞(1X107mL)50W，用無血清培養(yǎng)基補(bǔ)足至100W;c.耙細(xì)胞最大釋放孔(由耙細(xì)胞、無血清RPMI-1640培養(yǎng)基和隨后加入的10X裂解液組成)每孔加入靶細(xì)胞(1X107mL)50W，用無血清培養(yǎng)基補(bǔ)足100W;d.培養(yǎng)基背景值孔加入100W無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，用于校正培養(yǎng)基中LDH的自然釋放；e.體積校正孔加入100W無血清RPMI-1640培養(yǎng)基和10X裂解液(Promega公司的CytoTox96@Non-RadioactiveCytotoxicityAssay試劑盒提供)，校正10W裂解液引起的體積誤差；f.實(shí)驗(yàn)孔每孔加入靶細(xì)胞(5X107raL)5(M，加入倍比稀釋好的效應(yīng)細(xì)胞50W，使效靶比為60:1;30:1;15:1;7.5:1。所有反應(yīng)設(shè)置完成后，于室溫300rpm離心4min。B、細(xì)胞培養(yǎng)和收獲上清將96孔培養(yǎng)板放入C02孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束前45min，在耙細(xì)胞最大釋放孔中，加入10X裂解液，繼續(xù)培養(yǎng)并在顯微鏡下觀察最大釋放孔中靶細(xì)胞的裂解情況，如果裂解不完全可補(bǔ)加入10X裂解液。結(jié)束培養(yǎng)后，在室溫下250rpra離心4min。C、LDH測(cè)定用Promega公司的CTL活性檢測(cè)試劑盒CytoTox96@Non-RadioactiveCytotoxicityAssay并參照試劑盒說明書測(cè)定各免疫組小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性，方法為準(zhǔn)備另一塊96孔酶聯(lián)板，從96孔圓底培養(yǎng)板中取上清50W移入酶聯(lián)板中相對(duì)應(yīng)位置，每孔中加入50W底物液，蓋好蓋室溫避光反應(yīng)30min后，再加入50W終止液，490nm處讀取吸光值。D、計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果先求出各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所設(shè)復(fù)孔的平均值，然后計(jì)算各組數(shù)據(jù)的糾正值，即實(shí)驗(yàn)組和自然釋放組減去培養(yǎng)基背景釋放值；最大釋放組減去體積糾正釋放值，應(yīng)用各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的糾正值，按如下公式計(jì)算-,、實(shí)^#方文-效i^ffilffi自然ff方文-耙^ia自然釋放殺傷率(％)=-X100%靶細(xì)胞最大釋放-耙細(xì)胞自然釋放各免疫組小鼠脾細(xì)胞的殺傷率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4和圖28所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D、E和F組免疫小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生了不同程度的細(xì)胞免疫反應(yīng)，隨著效耙比的增加，CTL特異性殺傷率也逐漸上升，與對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.05)，其中F組的CTL殺傷率最高，在效靶比為60:1、30:1和15:1時(shí)均與對(duì)照組具有極其顯著性差異(P〈0.01);D組和E組的CTL殺傷率基本相同。表4不同效靶比的各免疫組小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性CTL平均殺傷率(％)60:130:115:17.5:1A組(PBS)7.736.035.462.69B組(pVAXl空載體)12.098.056.064.48C組(pVAXl-IRES-GM/B7空載體)175714.3611.019.71D組(pVAX卜2PAG)40.75※31.21※28.04《23.99《E組(pVAXl-2PAG-Fc-GPI)48.56《30.97》24.56《18.48《F組(pVAXl-2PFcGB)68.7444.3『30.9『20.6(f注:《與對(duì)照組相比，該組小鼠對(duì)腫瘤的抑制作用非常顯著(P〈0.05);冊(cè)P〈0.01。序列表<160〉2<210>1<211〉273〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223>〈400〉1acattgccccctgcctggcagccctttctc肌ggaccaccgcatctctac60tggcccttcttgaacggcgcttacgcctgt肌taccagcactttgggaggccg鄉(xiāng)cggg120cggatcacaag卿gga^cat犯aaagcatagctccggttgcgctttcctttxtgtcaag180aagcagtttgaag肌ctgacccttggtgaa"tttttgaaactggacag.a^gagcca^g240aac3a犯ttgca^3gga^ac肌g273〈210〉2<211>228〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223>〈400〉2acctgtgatgacccccgcttccaggactcctcttcctcaaaggcccctccccccagcctt60ccaagtccatccagactccctgggcccagcgacacccctatcctcccacaaaacggcacc120tgtgatgacccccacctccaggcctcctcttcctcaaaggaccctccccccagccctcca180agtccatccggactcctggagccagcagacaaccctttccttccacaa228權(quán)利要求1、一種DNA疫苗真核表達(dá)載體，是在pVAX1載體骨架中添加內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列得到的重組pVAX1真核表達(dá)載體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗真核表達(dá)載體，其特征在于在所述DNA疫苗真核表達(dá)載體中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的兩端還添加有一種或多種稀有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；所述稀有限制性內(nèi)切酶包括EcoRV、ClaI、BstBI、PvuIPsiI、BssHII、SwaI、PacI、NsiI和XhoI。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA疫苗真核表達(dá)載體，其特征在于所述DNA疫苗真核表達(dá)載體為pVAXl-IRES。4、權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的DNA疫苗真核表達(dá)載體在制備基因疫苗中的應(yīng)用。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述基因疫苗為抗腫瘤、抗流感、抗艾滋病、抗病毒性肝炎、抗結(jié)核、抗狂犬病或抗瘧疾的基因疫苗。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤基因疫苗的活性成分為在權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的DNA疫苗真核表達(dá)載體的載體骨架中核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因，以及人和猴的絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因的重組真核表達(dá)載體。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述Survivin-2B的自氨基端第5-28位氨基酸殘基的編碼序列和自氨基端第80-121位氮基酸殘基的編碼序列通過連接臂"nG"連接，其中，n為K、R、C、Q、G或N;所述人和猴的絨毛膜促性腺激素e鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列通過連接臂"nG"連接，其中，n為K、R、C、Q、G或N。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤基因疫苗的真核表達(dá)載體的載體骨架中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的上游還連接有人IgK鏈前導(dǎo)信號(hào)肽編碼序列和/或人IgG-Fc段編碼序列和/或糖基磷脂酰肌醇錨定信號(hào)肽編碼序列。9、根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤基因疫苗的真核表達(dá)載體的載體骨架中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列的下游還連接有人GM-CSF和/或B7.l共刺激分子編碼序列，以及白細(xì)胞介素、干擾素和/或腫瘤壞死因子的編碼序列。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸殘基編碼序列構(gòu)成的融合基因，以及人和猴絨毛膜促性腺激素P鏈的核心片段CTP37區(qū)域編碼序列構(gòu)成的融合基因的重組真核表達(dá)載體重組真核表達(dá)載體為pVAXl-2PAG或pVAX1-2PAG-Fc-GPI或pVAX1-2PFcGB。全文摘要本發(fā)明公開了一種DNA疫苗真核表達(dá)載體及其應(yīng)用。其目的是提供一種DNA疫苗真核表達(dá)載體與其在制備抗腫瘤等基因疫苗中的應(yīng)用。所述DNA疫苗真核表達(dá)載體是在pVAX1載體骨架中添加內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)編碼序列得到的重組pVAX1真核表達(dá)載體。本發(fā)明的基因疫苗有望對(duì)乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等多種惡性實(shí)體瘤發(fā)揮廣譜治療作用，特別是以上述真核表達(dá)載體構(gòu)建的抗腫瘤基因疫苗具有較好的體液免疫和細(xì)胞免疫效果，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，將在腫瘤的治療及其藥物開發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號(hào)A61K48/00GK101096680SQ20071009988公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者于繼云,寧劉,亮張,浩王,銳賈,閻瑾琦申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所