專利名稱：布魯氏菌弱毒疫苗突變株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗突變株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別是涉及一種布魯氏菌弱毒疫苗突變株及其構(gòu)建方法與其在制備布魯氏菌預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌引起的一種流行廣泛、危害極大的人畜共患病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》中記載的35種傳染病中的乙類傳染病，并被列為《家畜家禽防疫條例實(shí)施細(xì)則》中記載的二類傳染病之首。迄今為止，該病已波及到世界五大洲，在200多個(gè)國(guó)家中已有160多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有人畜布病的存在和流行。布病是目前世界上流行最廣，危害最大的人畜共患病之一，嚴(yán)重地影響著人民健康和畜牧業(yè)發(fā)展。人患此病，病期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)月、數(shù)年，甚至十幾年，嚴(yán)重者甚至喪失勞動(dòng)能力。家畜患布病后出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、不孕、乳腺炎和睪丸炎等，每年因家畜布病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。布病在我國(guó)流行范圍廣、危害嚴(yán)重，自新中國(guó)成立后開(kāi)展了全面的系統(tǒng)防治，因而有效地控制了布病的發(fā)生和流行。然而，自上個(gè)世紀(jì)90年代以來(lái)，該病的國(guó)內(nèi)外疫情呈明顯上升趨勢(shì)，被列為再度肆虐的傳染病，引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。為防治動(dòng)物布病，我國(guó)成功地研制出布魯氏菌羊種M5弱毒疫苗和豬種S2弱毒疫苗，并進(jìn)行了大面積的推廣應(yīng)用，對(duì)牛、羊、豬、鹿等動(dòng)物布病的防制起了巨大的作用，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。此外，對(duì)人采用從國(guó)外引進(jìn)的104M減毒活菌苗免疫疫區(qū)內(nèi)職業(yè)人群及受威脅的高危人群，也有效地控制了布魯氏菌的感染。但是，在布氏菌疫苗用于防治布病的過(guò)程中，還存在著自然感染和疫苗免疫難以鑒別的問(wèn)題，因?yàn)槿诵髴?yīng)用活菌苗以后所產(chǎn)生的各種血清反應(yīng)和自然感染所產(chǎn)生的各種血清學(xué)反應(yīng)極其相似。鑒別診斷不僅關(guān)系著布病的防治工作，同時(shí)對(duì)流行病學(xué)調(diào)查也具有重要意義，這也是布病防治領(lǐng)域的難題之一。
布魯氏菌弱毒活疫苗防治人、畜間布病的主要問(wèn)題是接種后產(chǎn)生的抗體與自然感染產(chǎn)生的抗體無(wú)法鑒別，這給布病的診斷帶來(lái)困難。目前，廣泛應(yīng)用的布魯氏菌弱毒活疫苗包括國(guó)際通用的S19、Rev-1和104M，以及我國(guó)研制的布魯氏菌羊種M5弱毒疫苗和豬種S2弱毒疫苗都存在這個(gè)問(wèn)題(WHO.The Development of New/ImprovedBrucellosis VaccinesReport of WHO Meeting，1997.)。近來(lái)，美國(guó)從強(qiáng)毒株2308中篩選出一種減毒的粗糙型牛種布魯氏菌突變株活疫苗RB51，此突變株由于缺乏O-抗原不產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此不干擾常規(guī)血清學(xué)診斷，在美國(guó)已獲得政府批準(zhǔn)正式使用(WHO.The Development of New/Improved Brucellosis VaccinesReport of WHOMeeting，1997.)。但是，最近的文獻(xiàn)報(bào)道，RB51也產(chǎn)生低水平的O-抗原，意味著用RB51做疫苗仍有干擾常規(guī)血清學(xué)和ELISA診斷的可能性(Cloeckaert A，Zygmunt M S，Guilloteau L A.Brucella abortus vaccine strain RB51 produces low levels ofM-like O-antigen.Vaccine.2002，201820-1822.)。
bp26(GenBank號(hào)AF242532)、wboA(與O-抗原聚合作用有關(guān))(GenBank號(hào)AF107768)、omp31(GenBank號(hào)U39453，該基因的功能為形成細(xì)胞外膜孔道的蛋白)、P39(GenBank號(hào)AF360361，該基因的功能為參與結(jié)合蛋白依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng))和pgm(GenBank號(hào)AF232056，磷酸葡萄糖變位酶，Phosphoglucomutase，與O-抗原組裝有關(guān))是來(lái)源于病原體的基因，這些基因是細(xì)菌復(fù)制非必需的，同時(shí)它們又編碼免疫顯性抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供免疫保護(hù)作用良好，并且能夠與非突變株感染進(jìn)行鑒別的布魯氏菌弱毒疫苗突變株。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案布魯氏菌弱毒疫苗突變株，是將布魯氏菌弱毒疫苗株中編碼免疫顯性抗原蛋白bp26、wboA、omp31、P39或pgm的基因敲除，得到布魯氏菌弱毒疫苗突變株。
所述布魯氏菌弱毒疫苗株可為布魯氏菌羊種M5株、人用104M株或豬種S2株(上述布魯氏菌弱毒疫苗株均可購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所)。
將其中一株免疫效果較好的布魯氏菌羊種M5疫苗株的bp26基因缺失突變株命名為M5-26，該細(xì)胞株已于2007年03月30日保藏于位于中國(guó)湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M207030。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種構(gòu)建上述布魯氏菌弱毒疫苗突變株的方法。
本發(fā)明所提供的布魯氏菌弱毒疫苗突變株的構(gòu)建方法，可包括以下步驟1)設(shè)計(jì)引物分別依據(jù)布魯氏菌全基因組序列中靶基因bp26、wboA、omp31、P39或pgm的上、下游已知區(qū)域的核苷酸序列，各設(shè)計(jì)兩對(duì)特異的PCR引物，擴(kuò)增目的基因上、下游兩個(gè)長(zhǎng)度為500bp至1000bp的同源性核苷酸片段；為定向連接成含缺損基因的同源性核苷酸片段，所述擴(kuò)增上游片段的逆向引物和擴(kuò)增下游片段的正向引物的5’端添加一種相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，所述擴(kuò)增上游片段的正向引物和擴(kuò)增下游片段的逆向引物的5’端添加另一種相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，此外，為防止改變下游基因的讀碼框架，擴(kuò)增上游同源性核苷酸片段的逆向引物與擴(kuò)增下游同源性核苷酸片段的正向引物的5’末端在缺失目的基因相應(yīng)區(qū)域的間隔堿基數(shù)為3的倍數(shù)；2)目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的獲得以布魯氏菌的基因組DNA為模板，分別在步驟1)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩個(gè)同源性核苷酸片段，再將這兩個(gè)上、下游同源性核苷酸片段定向連接起來(lái)，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段；3)將步驟2)獲得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段連接入自殺載體中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體；4)將步驟3)構(gòu)建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體轉(zhuǎn)化布魯氏菌，篩選陽(yáng)性克隆，得到缺失目的基因的布魯氏菌弱毒疫苗突變株。
在上述布魯氏菌弱毒疫苗突變株的構(gòu)建方法中，步驟1)中依據(jù)bp26的上游已知區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物可為序列表中的序列1和序列2，依據(jù)bp26的下游已知區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物可為序列表中的序列3和序列4；擴(kuò)增上游片段的逆向引物和擴(kuò)增下游片段的正向引物的5’端添加的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可任意選擇，如Bgl II識(shí)別位點(diǎn)等，其保護(hù)性堿基可為序列表中序列5。所述擴(kuò)增上游片段的正向引物和擴(kuò)增下游片段的逆向引物的5’端添加的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可依據(jù)載體確定，如可為BamHI識(shí)別位點(diǎn)，其保護(hù)性堿基可為序列表中序列6。
步驟3)中用于構(gòu)建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體的出發(fā)載體可為pKNG101或pCVD442等自殺載體，優(yōu)選為pKNG101(Kaniga K，DelorI，Cornelis GR.A wide-host-range suicide vector for improving reverse geneticsin gram negative bacteriainactivation of the blaA gene of Yersiniaenterocolitica.Gene.1991，109(1)137-41)。
步驟4)中用于轉(zhuǎn)化含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體的布魯氏菌出發(fā)菌株可為布魯氏菌羊種M5株、人用104M株或豬種S2株。
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的布魯氏菌弱毒疫苗存在難以鑒別診斷等問(wèn)題，通過(guò)基因敲除的方式制備了它們的突變株，以小鼠為模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變株的免疫保護(hù)作用良好，并且能夠與非突變株感染進(jìn)行鑒別，構(gòu)建的布氏菌活菌苗突變株缺失了病原體的某些基因，這些基因是細(xì)菌復(fù)制非必需的同時(shí)它們又編碼免疫顯性抗原，而且保持了母系菌株的免疫力而毒力不增加，此外，由于本發(fā)明構(gòu)建的突變株缺失了某個(gè)抗原蛋白基因，因此還可以根據(jù)缺失基因的免疫生物學(xué)特性建立區(qū)分疫苗免疫和自然感染的鑒別診斷方法。本發(fā)明的布魯氏菌弱毒突變株有望發(fā)展成為帶標(biāo)記的弱毒疫苗，對(duì)控制布病的流行、傳播和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展具有重要的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為布魯氏菌弱毒疫苗突變株構(gòu)建過(guò)程的流程2為PCR擴(kuò)增的F1和F2片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖3為F1和F2連接產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物均由上海生工合成。
實(shí)施例1、布魯氏菌羊種M5疫苗株bp26基因缺失突變株的構(gòu)建及其毒力和免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)一、布魯氏菌羊種M5疫苗株bp26基因缺失突變株的構(gòu)建選擇缺失靶基因依據(jù)的條件第一，基因缺失后不影響布魯氏菌疫苗突變體的復(fù)制，并且毒力不增加，而免疫力不降低；第二，缺失基因應(yīng)編碼免疫顯性的抗原蛋白。依據(jù)上面的條件選擇wboA、bp26、omp31、P39或pgm作為用于構(gòu)建布魯氏菌弱毒疫苗突變株的缺失靶基因。以缺失bp26為例，參見(jiàn)圖1用本發(fā)明的方法構(gòu)建布魯氏菌羊種M5疫苗株的bp26缺失突變株，具體過(guò)程包括以下步驟1、PCR引物設(shè)計(jì)依據(jù)布魯氏菌羊種菌16M株的全基因組序列，在bp26基因上下游設(shè)計(jì)兩對(duì)特異的PCR引物P1A/P1B與P2A/P2B，在上游片段的逆向引物P1B和下游片段的正向引物P2A的5′-末端添加相同的限制性核苷酸內(nèi)切酶Bgl II識(shí)別位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基(GAAGATCT，序列表中序列5)，在上游片段的正向引物P1A和下游片段的逆向引物P2B的5′-末端，分別添加BamHI酶切位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基(CGGGATCC，序列表中序列6)，引物序列如下P1A5′-CGGGATCCGGTTTGTAACGATTTTAAATTA-3′(序列表中序列1)P1B5′-GAAGATCTTATCGACCCCATACTGCGGGAA-3′(序列表中序列2)；P2A5′-GAAGATCTTTTTAGAGGATGTCCTTTTC-3′(序列表中序列3)P2B5′-CGGGATCCAAGACCACTGCCGCATACCG-3′(序列表中序列4)。
2、目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的獲得1)PCR擴(kuò)增以布魯氏菌羊種菌16M株(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所)的基因組DNA為模板，分別在步驟1設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μl反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液5μl，上游引物(5uM)2μl，下游引物(5uM)2μl，dNTPs(10μM)0.5μl，rTaq(5u/ul)0.4μl，水38.μl，布魯氏菌基因組DNA(20ng/μl)2μl。PCR擴(kuò)增條件為先95℃3min；然后94℃30sec，58℃40sec，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道1為F1片段，泳道2為F2片段，泳道3為DNA Marker DL2000)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了兩個(gè)同源性核苷酸片段，即長(zhǎng)度約為700bp的F1和長(zhǎng)度約為500bp的F2，與預(yù)期結(jié)果相符。
2)純化PCR產(chǎn)物用諾德金生物公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化/瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)步驟1)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，方法為取待純化的PCR產(chǎn)物200μl，與等體積的結(jié)合液充分混勻，短暫離心后轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置1min后12000rpm離心1min，棄廢液后向柱中加入600μl漂洗液AW，12000rpm離心1min，再加500μl漂洗液AW，12000rpm離心1min后將吸附柱置于一新的離心管中，開(kāi)蓋放置1min，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，加50μl無(wú)菌水洗脫，37℃放置2min，最后12000rpm離心1min收集純化產(chǎn)物。
3)酶切PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Bgl II對(duì)步驟2)經(jīng)純化的兩個(gè)DNA片段分別進(jìn)行酶切，20μl酶切體系為DNA片段(1000ng)4μl，Bgl II內(nèi)切酶(TAKARA公司)1μl，10×酶切緩沖液2μl，水13μl。酶切條件為37℃作用4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用GeneacidPCR產(chǎn)物試劑盒純化酶切后的片段，最后用20μl的水洗脫(重復(fù)洗2次)。
4)酶切產(chǎn)物的連接在T4DNA連接酶的作用下，將兩個(gè)酶切片段F1和F2在4℃下連接過(guò)夜(12-24小時(shí))，連接體系為片段F1酶切產(chǎn)物200ng，片段F2酶切產(chǎn)物200ng，T4DNA連接酶1μl，10×連接酶緩沖液1μl，補(bǔ)加水至10μl。連接反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示(泳道1為連接產(chǎn)物，泳道2為DNA MarkerDL2000)，用PCR產(chǎn)物純化/瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收F1-F2目的DNA片段，回收及純化方法為稱重并記錄小離心管的重量，紫外燈下從瓊脂糖凝膠中切割F1-F2目的片段放入稱好的小離心管中，稱重，計(jì)算出膠塊重量，每10mg膠塊加入10μl結(jié)合液BS，渦旋振蕩均勻，50-65℃水浴作用10min，期間不時(shí)搖動(dòng)，使膠塊完全溶解。瞬時(shí)離心，將溶液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫放置1min，12000rpm離心1min，棄廢液，吸附柱放回收集管中，再加600μl漂洗液AW，12000rpm離心1min，棄廢液，吸附柱放回收集管中，加500μl漂洗液AW，12000rpm離心1min，棄廢液，吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min，將吸附柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，開(kāi)蓋放置1min，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，加50μl無(wú)菌水至吸附柱中，室溫放置2min，最后12000rpm離心1min，得到F1-F2目的DNA純化樣品，以此作為目的基因缺陷型同源性核苷酸片段。
3、構(gòu)建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的自殺載體1)酶切F1-F2片段和自殺質(zhì)粒用BamHI(50U)分別消化約500ng的F1-F2片段和約1000ng的自殺質(zhì)粒pKNG101，20μl酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為F1-F2或pKNG101(500ng或1000ng)4μl，BamHI內(nèi)切酶10×緩沖液2μl，水13μl，在30℃下作用12h后，分別用Geneacid PCR產(chǎn)物試劑盒純化消化產(chǎn)物，方法為將100μl反應(yīng)產(chǎn)物置于一微量離心管中，加5倍體積的DF緩沖液，振蕩混勻，加到裝有收集管的DF離心柱中，13000rpm離心30sec，棄廢液后重新將DF柱裝到收集管上，向柱中加600μl Wash緩沖液，13000rpm離心30sec，棄廢液后重新將DF柱裝到收集管上，13000rpm離心3min干燥離心柱，將干燥后的離心柱裝到一新離心管上，加15-50μl無(wú)菌去離子水，室溫放置3min，最后13000rpm離心2min收集純化的DNA樣品。
2)F1-F2片段與質(zhì)粒連接在T4DNA連接酶的作用下，將步驟1)中經(jīng)酶切及純化后的F1-F2片段與pKNG101酶切產(chǎn)物在4℃連接過(guò)夜，以將片段F1-F2插入自殺質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)處，得到含有F1-F2片段的重組載體，命名為pKNG101/F1-F2，連接反應(yīng)體系為F1-F2片段酶切產(chǎn)物200ng，pKNG101酶切產(chǎn)物100ng，T4DNA連接酶1μl，10×緩沖液1μl，補(bǔ)加水至10μl。
3)制備大腸桿菌SPY372λpir感受態(tài)接種受體菌大腸桿菌SPY372λpir(Millert VL，Mekalanos JJ.A Novel SuicideVector and Its Use in Construction of Insertion MutationsOsmoregulation ofOuter Membrane Proteins and Virulence Determinants in Vibrio cholerae RequirestoxR.Journal of Bacteriology.170(6)2575-2583)于3mL LB肉湯培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、950mL去離子水)中，在37℃下150rpm搖菌至渾濁(控制OD值為0.4-0.6，即菌量不能太多，也不能太少)，4500rpm離心5min集菌，用1mL的0.1M CaCl2洗菌兩次(用毛細(xì)管將菌輕輕懸起，4℃下5000rpm離心5min，棄上清)，加入1mL的0.1M CaCl2重懸菌體，4℃過(guò)夜，24小時(shí)內(nèi)備用。過(guò)夜制備的感受態(tài)菌轉(zhuǎn)化效率最高，但存放時(shí)間不能太長(zhǎng)(不超過(guò)48h)，否則感受態(tài)細(xì)菌易老化。取100μl制備的感受態(tài)菌，接入3mL含40μg/mL氨芐青霉素的LB肉湯(ApR)中，過(guò)夜培養(yǎng)無(wú)菌體生長(zhǎng)，確定沒(méi)有污染。
4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌SPY372λpir取100-200μl步驟3)制備的大腸桿菌SPY372λpir感受態(tài)細(xì)菌，加入到1.5mL的離心管中，再加入10μl步驟3)獲得的連接產(chǎn)物，冰浴30min后，于42℃(水浴)熱沖擊90秒，冰浴3min，加入400μl的LB肉湯，離心管口用封口膜封緊，37℃下?lián)u動(dòng)2小時(shí)，取150μl涂于含40μg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板(ApR)，倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑取10-20個(gè)克隆，于LB瓊脂平板上在37℃下增菌培養(yǎng)12小時(shí)，用特異引物P1A和P2B引導(dǎo)的PCR反應(yīng)篩選出陽(yáng)性克隆，可擴(kuò)增出1200bpDNA片段的為陽(yáng)性克隆。
4、轉(zhuǎn)化布魯氏菌1)提取含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的自殺質(zhì)粒用GENEAID質(zhì)粒微量提取試劑盒從步驟3篩選出的大腸桿菌SPY372λpir的陽(yáng)性克隆中提取自殺質(zhì)粒，將鑒定正確的大腸桿菌SPY372λpir陽(yáng)性克隆接種到6mL的LB肉湯(ApR)培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)6-8小時(shí)(OD值0.6-0.8)，12000rpm離心1min集菌，棄上清，加入200μlPD1(RNase A added)，充分混勻；再加入200μlPD2，上下翻轉(zhuǎn)4-6次，此時(shí)溶液變?yōu)槌吻逋该?；加?00μl PD3，上下翻轉(zhuǎn)4-6次后產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，12000rpm離心10min；將上清小心轉(zhuǎn)移至離心柱內(nèi)，避免帶有菌體沉淀顆粒，12000rpm離心1min，倒掉離心管內(nèi)液體；在離心柱內(nèi)加入400μlW1溶液，12000rpm離心1min，倒掉離心管內(nèi)液體；在離心柱內(nèi)加入600μlWash Buffer溶液，12000rpm離心1min，倒掉離心管內(nèi)液體；再離心1min，甩干柱內(nèi)洗液；加入20μl無(wú)菌去離子水，12000rpm離心1min收集質(zhì)粒。取2μl質(zhì)粒，加2μl載樣緩沖液，補(bǔ)水至10μl，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)約8400bp的明亮致密條帶。
2)羊種布魯氏菌M5株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備將羊種布魯氏菌M5株(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所)接種到5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃低速振蕩培養(yǎng)6小時(shí)至OD值為0.6-0.8，將電擊杯(1mm)和無(wú)菌去離子水預(yù)先在冰浴上預(yù)冷，在4℃下4000rpm離心5min收集菌體，用等體積的預(yù)冷無(wú)菌去離子水(5mL)洗滌兩次，離心集菌，再用等體積的預(yù)冷無(wú)菌去離子水(5mL)懸浮均勻，分裝成50μl體系，置冰浴上備用。
3)電轉(zhuǎn)化取1μl pKNG101/F1-F2的重組質(zhì)粒(100ng左右)，加入到步驟2)中新鮮制備的50μl感受態(tài)細(xì)菌(預(yù)冷10min)中，輕微混勻，置冰上繼續(xù)放置15min，加入到已預(yù)冷的電擊杯中(貼壁加入避免氣泡產(chǎn)生)，于25μF、200Ω、1.8Kv的電擊參數(shù)下電擊。電擊后立即加入500μl的LB液體培養(yǎng)基懸浮細(xì)菌，將電擊細(xì)胞轉(zhuǎn)到離心管中，37℃低速振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，取100μl涂于含5％蔗糖的LB瓊脂平板(又稱LB-蔗糖平板)上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
6)突變株篩選和鑒定從每個(gè)LB-蔗糖平板上各挑取5-6個(gè)克隆，涂抹在LB-蔗糖平板上37℃增菌培養(yǎng)12小時(shí)后，各取約2mg細(xì)菌置于含50μl無(wú)菌蒸餾水的小管中，混勻，煮沸5分鐘后，10000rpm離心10min，以上清液為模板，用引物P1A/P2B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選僅擴(kuò)增出1200bp F1-F2長(zhǎng)度的小片段克隆，再于LB-蔗糖平板上進(jìn)行稀釋培養(yǎng)，各取5-6個(gè)克隆重復(fù)進(jìn)行PCR鑒定，將連續(xù)3次經(jīng)PCR鑒定均為陽(yáng)性克隆作為目的基因缺陷突變株。對(duì)突變株進(jìn)行序列測(cè)定，表明獲得了序列正確的布魯氏菌M5疫苗株bp26基因缺失突變株。
二、布魯氏菌M5疫苗株bp26基因缺失突變株的毒力和免疫保護(hù)作用測(cè)定1、突變株的毒力測(cè)定取TSA(tryptose soy agar)培養(yǎng)基(胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、葡萄糖2.5g、NaCl 5.0g、K2HPO42.5g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL)上生長(zhǎng)的布魯氏菌M5疫苗株和步驟一獲得的bp26基因缺失的突變株菌落，分別用PBS制成1×105CFU菌懸液，再將75只6-8周雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成三組，分別在腹膜內(nèi)每只小鼠注射0.2mL布魯氏菌M5疫苗株和bp26基因突變株菌液(M5突變株)，在另一組每只小鼠注射0.2mL生理鹽水作空白對(duì)照。分別在感染后的第8，15，28，42和60天，從每組中取5只小鼠處死，無(wú)菌條件下取出脾臟、稱重、然后加5mL的PBS勻漿，10倍系列稀釋后取0.1mL接種至TSA平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5天后細(xì)菌記數(shù)(CFU)，推算全脾內(nèi)活苗數(shù)，最后換算成對(duì)數(shù)值，結(jié)果如表1和表2所示。表1顯示了布魯氏菌M5疫苗株和M5疫苗突變株脾內(nèi)細(xì)菌記數(shù)情況，表2顯示了二者感染小鼠后的炎癥應(yīng)答情況。從二者感染小鼠后脾內(nèi)活菌記數(shù)和脾重可以看出，布魯氏菌M5疫苗株和本發(fā)明的M5疫苗突變株的毒力無(wú)有意義的差別，即突變株的毒力未增加。
表1布魯氏菌M5疫苗株和M5疫苗突變株脾內(nèi)細(xì)菌記數(shù)結(jié)果

注每組測(cè)定結(jié)果均為5只小鼠的平均值。
表2 布魯氏菌M5疫苗株和M5疫苗突變株的脾重計(jì)算結(jié)果

注每組測(cè)定結(jié)果均為5只小鼠的平均值。
2、測(cè)定布魯氏菌羊種M5疫苗株bp26基因缺失突變株的免疫保護(hù)作用取TSA(tryptose soy agar)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的布魯氏菌S2308(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所)菌落，用PBS制成5×104CFU菌懸液，取布魯氏菌羊種M5疫苗株或bp26基因缺失突變株免疫小鼠10周后，各組中10只小鼠分別腹膜內(nèi)攻毒0.2mL的5×104CFU布魯氏菌株S2308，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，攻毒15天后，處死小鼠，取出脾臟，用5mL的PBS勻漿，用PBS系列稀釋后，取0.1mL接種TSA平板(平板中加0.1％赤癬糖醇保證只有S2308能生長(zhǎng))，30℃培養(yǎng)5天后細(xì)菌記數(shù)(CFU)，推算全脾內(nèi)活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，分別由M5疫苗株和M5疫苗突變株免疫的小鼠組與空白對(duì)照組相比，脾內(nèi)活菌記數(shù)明顯降低，表明疫苗株和疫苗突變株均具有良好的免疫保護(hù)作用。將用上述方法獲得的免疫效果較好的布魯氏菌羊種M5疫苗株bp26基因缺失突變株命名為M5-26，該細(xì)胞株已于2007年03月30日保藏于位于中國(guó)湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M207030。
表3布魯氏菌M5疫苗株和M5疫苗突變株免疫保護(hù)作用測(cè)定結(jié)果

注每組測(cè)定10只小鼠的結(jié)果。
序列表<160>6<210>1<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgggatccggt ttgtaacgat tttaaatta29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaagatcttat cgaccccata ctgcgggaa29<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gaagatctttt tagaggatgt ccttttc 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4cgggatccaag accactgccg cataccg 27<210>5<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gaagatct7<210>6<211>7<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6cgggatcc 權(quán)利要求
1.布魯氏菌弱毒疫苗突變株，是將布魯氏菌弱毒疫苗株缺失bp26、wboA、omp31、P39或pgm基因后得到的布魯氏菌弱毒疫苗突變株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的布魯氏菌弱毒疫苗突變株，其特征在于所述布魯氏菌弱毒疫苗株為羊種M5株、人用104M株或豬種S2株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的布魯氏菌弱毒疫苗突變株，其特征在于為生物保藏號(hào)為CCTCC M207030的布魯氏菌弱毒疫苗突變株M5-26。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的布魯氏菌弱毒疫苗突變株的方法，包括以下步驟1)分別依據(jù)布魯氏菌全基因組序列中靶基因bp26、wboA、omp31、P39或pgm的上、下游已知區(qū)域的核苷酸序列，各設(shè)計(jì)兩對(duì)特異的PCR引物，擴(kuò)增目的基因上、下游兩個(gè)長(zhǎng)度為500bp至1000bp的同源性核苷酸片段；為定向連接成含缺損基因的同源性核苷酸片段，所述擴(kuò)增上游片段的逆向引物和擴(kuò)增下游片段的正向引物的5’端添加一種相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，所述擴(kuò)增上游片段的正向引物和擴(kuò)增下游片段的逆向引物的5’端添加另一種相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，此外，為防止改變下游基因的讀碼框架，擴(kuò)增上游同源性核苷酸片段的逆向引物與擴(kuò)增下游同源性核苷酸片段的正向引物的5’末端在缺失目的基因相應(yīng)區(qū)域的間隔堿基數(shù)為3的倍數(shù)；2)以布魯氏菌的基因組DNA為模板，分別在步驟1)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩個(gè)同源性核苷酸片段，再將這兩個(gè)上、下游同源性核苷酸片段定向連接起來(lái)，得到目的基因缺陷型同源性核苷酸片段；3)將步驟2)獲得的目的基因缺陷型同源性核苷酸片段連接入自殺載體中，得到含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體；4)將步驟3)構(gòu)建的含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體轉(zhuǎn)化布魯氏菌，篩選陽(yáng)性克隆，得到缺失目的基因的布魯氏菌弱毒疫苗突變株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中擴(kuò)增上游片段的逆向引物和擴(kuò)增下游片段的正向引物的5’端添加的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)為BglII識(shí)別位點(diǎn)，其保護(hù)性堿基為序列表中的序列5，擴(kuò)增上游片段的正向引物和擴(kuò)增下游片段的逆向引物的5’端添加的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)為BamH I識(shí)別位點(diǎn)，其保護(hù)性堿基為序列表中的序列6。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中依據(jù)bp26的上游已知區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物為序列表中的序列1和序列2，依據(jù)bp26的下游已知區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物為序列表中的序列3和序列4。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟3)中用于構(gòu)建含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體的出發(fā)載體為pKNG101或pCVD442。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟4)中用于轉(zhuǎn)化含有目的基因缺陷型同源性核苷酸片段的重組自殺載體的布魯氏菌出發(fā)菌株為布魯氏菌羊種M5株、人用104M株或豬種S2株。
9.權(quán)利要求1或2或3所述的布魯氏菌弱毒疫苗突變株在制備布魯氏菌預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2或3所述的布魯氏菌弱毒疫苗突變株在制備鑒別布魯氏菌疫苗免疫和自然感染試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了布魯氏菌弱毒疫苗突變株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。其目的是提供布魯氏菌弱毒疫苗突變株及其構(gòu)建方法與其在制備布魯氏菌預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用。該布魯氏菌弱毒疫苗突變株是將布魯氏菌弱毒疫苗株缺失bp26、wboA、omp31、P39或pgm基因后得到的布魯氏菌弱毒疫苗突變株。以小鼠為模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變株的免疫保護(hù)作用良好，而且毒力不增加。此外，由于本發(fā)明構(gòu)建的突變株缺失了某個(gè)抗原蛋白基因，因此還可以根據(jù)缺失基因的免疫生物學(xué)特性建立區(qū)分疫苗免疫和自然感染的鑒別診斷方法。本發(fā)明的布魯氏菌弱毒突變株有望發(fā)展成為帶標(biāo)記的弱毒疫苗，對(duì)控制布病的流行、傳播和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展具有重要的實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61K39/10GK101092605SQ200710099648
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者王效義, 王棠, 郭兆彪, 宋亞軍, 周蕾, 楊瑞馥 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所