布魯氏菌Omp19基因在提高細胞免疫中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是布魯氏菌0mpl9基因在提高細胞免疫中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]布魯氏菌病是一種嚴重危害人和家畜健康的人獸共患傳染病。布魯氏菌為革蘭氏陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，其急性期的臨床特點主要為惡寒、發(fā)熱、關(guān)節(jié)和肌肉痛等；人感染布魯氏菌后造成骨關(guān)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等損害，慢性期主要癥狀為骨關(guān)節(jié)病及包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)多器官的損害，患者會一般會表現(xiàn)出神經(jīng)-精神癥狀，病程較長，容易復(fù)發(fā)并再感染，從而導(dǎo)致勞動力的喪失。動物布魯氏菌病的特點是生殖器官、胎膜及其它多種器官組織發(fā)炎、壞死和肉芽腫的形成，引起流產(chǎn)、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀。布魯氏菌病給人類健康和畜牧業(yè)和諧發(fā)展帶來嚴重危害。因此，研究布魯氏菌及對宿主細胞的致病機制，為布魯氏菌疫苗研發(fā)和和防空提供理論基礎(chǔ)，對于國民經(jīng)濟的發(fā)展和社會的安全具有重大的意義。
[0003]第I類外膜蛋白主要包括0MP10和0MP19，是布魯氏菌細胞膜的主要成分，研究表明這兩個外膜蛋白與根瘤菌科的細菌有著相似的抗原決定簇。0MP10的分子量大約為lOkDa，它3端具有138bp的核酸序列與HemH亞鐵螯合酶相同，因此懷疑它與細菌對鐵的利用和生物合成有關(guān)。0MP19的分子量大約為19kDa，又叫做BMP18，0MP19在布魯氏菌外膜的結(jié)構(gòu)方面有重要影響，對布魯氏菌外膜蛋白與多粘菌素之間起橋梁作用。1995年FreerA等通過試驗表明外膜蛋白中脂多糖分子與非脂多糖分子交錯分布，由此推測，外膜蛋白各成分之間的相互作用將脂多糖固有的結(jié)構(gòu)分布打亂，而0MP19的存在使其固有的結(jié)構(gòu)得以修正。當(dāng)0MP19基因缺失之后能改變布魯氏菌的外膜特性，影響布魯氏菌在胞內(nèi)的生存能力。0MP19基因缺失株能夠引起粗糙型羊種布魯氏菌外膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供布魯氏菌0mpl9基因在提高細胞免疫中的應(yīng)用，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
布魯氏菌0mpl9基因在提高細胞免疫中的應(yīng)用。
[0006]作為本發(fā)明進一步的方案:所述細胞為真核細胞。
[0007]作為本發(fā)明再進一步的方案:所述細胞為巨噬細胞。
[0008]作為本發(fā)明再進一步的方案:布魯氏菌0mpl9基因用于提高細胞內(nèi)的IFN-γ水平和IL-6水平。
[0009]作為本發(fā)明再進一步的方案:采用布魯氏菌0mpl9基因作為亞單位疫苗候選基因。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過擴增并構(gòu)建羊種布魯氏菌ompl9基因真核載體，然后轉(zhuǎn)染巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)ompl9基因可在細胞內(nèi)表達，在巨噬細胞內(nèi)可顯著提高IFN-γ和IL-6水平，ompl9基因在細胞內(nèi)具有免疫反應(yīng)原性，可提高細胞免疫，因此，可作為亞單位疫苗候選基因，這為進一步揭示布魯氏菌蛋白在致病機制中的作用機理奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011]圖1為布魯氏菌中0mpl9基因?qū)毎麅?nèi)免疫調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用中目的基因ompl9的PCR擴增圖，其中M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DM2000 ;1?2:ompl9基因PCR產(chǎn)物；3:陰性對照M。
[0012]圖2為布魯氏菌中0mpl9基因?qū)毎麅?nèi)免疫調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用中pMD18-T-ompl9的雙酶切鑒定圖，其中M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DM2000 ;1?3:pMD18-T-ompl9基因Spe I+Xho I酶切產(chǎn)物；4:質(zhì)粒對照。
[0013]圖3為布魯氏菌中Omp 19基因?qū)毎麅?nèi)免疫調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用中pLEX-MCS-omp 19的雙酶切鑒定圖，其中M: DNA標(biāo)準(zhǔn)DM10000 ;1?3.pLEX-MCS_ompl9基因Spe I+Xho I酶切產(chǎn)物；4.質(zhì)粒對照。
[0014]圖4為布魯氏菌中0mpl9基因?qū)毎麅?nèi)免疫調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用中Western blot檢測細胞中0MP19蛋白的表達圖。
[0015]圖5為布魯氏菌中0mpl9基因?qū)毎麅?nèi)免疫調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用中0mpl9蛋白提高IFN-γ水平的分泌圖。
[0016]圖6為布魯氏菌中0mpl9基因?qū)毎麅?nèi)免疫調(diào)節(jié)作用及其應(yīng)用中0mpl9蛋白提高IL-6水平的分泌圖。
【具體實施方式】
[0017]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0018]實施例1 1材料
1.1菌株、細胞和載體
布魯氏菌16M菌株基因組由石河子大學(xué)陳創(chuàng)夫提供，真核表達載體Plex-MSC質(zhì)粒、DH5 α感受態(tài)細胞、DE3感受態(tài)細胞、小鼠巨噬細胞RAW264.7為銅仁學(xué)院生物與農(nóng)林工程學(xué)院實驗室保存。
[0019]1.2試劑與儀器
限制性內(nèi)切酶、PMD18-T simple連接試劑盒、Τ4 DNA連接酶、及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒DNA小提中量試劑盒及DNA Maker均購自天根生化(北京)科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔HRP-1gG 二抗、哺乳動物細胞蛋白抽提試劑盒均購自康為公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。常規(guī)離心機(Beckman microfugel6)，PCR儀(B10-RAD及TECHNE)，UVP凝膠成像系統(tǒng)，高速冷凍離心機(eppendorf,centrifuge_5415D)0
[0020]2 方法
2.1目的基因引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中羊種布魯氏菌16M'基因序列，根據(jù)Plex-MSC表達載體的特點，采用Primer5.0軟件設(shè)計對特異性引物。
[0021]引物序列為:
上游引物:5’ ACTAGTATGGGAATTTCAAAAGCAAG 3’(下劃線處為Spel酶切位點)；如SEQID N0.1 所示；
下游引物:5’ CTCGAGGCGCGACAGCGTCACG 3’ (下劃線處為Xhol酶切位點);
如 SEQ ID N0.2 所示；
引物由北京華大基因合成。
[0022]2.2目的基因的PCR擴增
對目的基因進行PCR擴增，SUM01擴增反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5 min，94°C 40s，56°C40 s，72°C 40s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 7 min ;SUM02 擴增反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 5 min ；94°C40s，60°C 40 s’72V 40s，循環(huán)35次，72°C延伸7 min ;反應(yīng)結(jié)束后PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳分析，將目的片段按照天根生化(北京)科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行回收。
[0023]2.3重組質(zhì)粒pMD18-T_0mpl9構(gòu)建及鑒定
將PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T Simple克隆載體按照載體試劑盒說明書進行連接。16°C水浴鍋連接12 h后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細胞中，胞均勻涂布于氨芐青霉素抗性的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)挑取生長良好的單克隆菌落菌液篩選陽性克隆提取質(zhì)粒，并進行雙酶切Spel/Xhol鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送華大基因公司進行序測，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD18-T-0mpl9。
[0024]2.4重組質(zhì)粒Plex-MSC_0mpl9的構(gòu)建及鑒定
用限制性內(nèi)切酶Spel和Xhol對質(zhì)粒pMD18-T-0mpl9和Plex-MSC進行雙酶切，分別凝膠回收0mpl9片段和線性化的Plex-MSC，回收目的片段，用T4 DNA連接酶進行連接，在16°C恒溫水浴槽中連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細胞中，將鑒定為陽性的菌液轉(zhuǎn)接于含氨芐抗性的20mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180rpm/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜。按照天根公司高純度質(zhì)粒DNA小提中量試劑盒說明書提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Spel和Xhol對提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，37°C，4h后用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，酶切鑒定正確的送華大基因公司測序。
[0025]2.5 Omp 19 蛋白的 Western blot 鑒定
當(dāng)SDS-PAGE結(jié)束時，將含有目的蛋白的凝膠切下，盡量避免用手碰觸。同時裁剪6-7張大小和凝膠相同的濾紙和1張硝酸纖維素膜(NC膜)，切除凝膠、NC膜與濾紙一角作為標(biāo)記。將凝膠與NC膜在膜轉(zhuǎn)移緩沖液中靜置平衡10min，NC膜與濾紙分開浸泡。將三層濾紙放于半干式電轉(zhuǎn)儀中，放膠，然后將