NC膜放于其上，再鋪三層濾紙，200mA和20V電泳l_2h。小心取出NC膜，到放在一個(gè)干凈平皿中，用TBST洗膜3次，每次5min。將NC膜放入雜交瓶中，加入10mL膜封閉液，37°C于雜交儀上封閉lh。倒去封閉液，將NC膜放入盛有TBST的平皿中沖膜3次，每次5min。將NC膜放入雜交瓶中，加入用TBST稀釋的一抗(鼠抗布魯氏菌16M血清)(1:200)，37°C于雜交儀上雜交l-2h。與二抗的結(jié)合:用TBST沖膜3次，每次5min。加入用TBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔HRP-1gG 二抗5mL (1:3000)，37°C于雜交儀上雜交lh。用TBST沖膜3次，每次lOmin。加ECL底物顯色液，避光顯色lmin，然后照相。
[0026]2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子
小鼠ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作見(jiàn)操作步驟。將轉(zhuǎn)染Plex-MSC-0mpl9成功的細(xì)胞，繼續(xù)置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h和24h。空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組合正常細(xì)胞作為對(duì)照組。在12h和24h收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，進(jìn)行IFN-γ和IL-6的ELISA檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0027]3 結(jié)果
3.1基因的擴(kuò)增克隆及酶切鑒定
用引物PCR擴(kuò)增Ompl9基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到約530bp的目的條帶與預(yù)期結(jié)果相符(如圖1所示)，將其克隆到pMD18-Tsimple載體中，轉(zhuǎn)化至DH5a菌中，提取克隆質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Spel/Xhol雙酶切鑒定(如圖2所示)，并對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，表明本試驗(yàn)獲得的目的基因片段正確。
[0028]3.2同源重組質(zhì)粒pLEX-MCS_ompl9的構(gòu)建
以布魯氏菌S2308基因組為模板擴(kuò)增出0MP19基因的序列，大小分別約為534bp (如圖3所示)。將目的基因連接于用慢病毒表達(dá)載體PLEX-MCS多克隆位點(diǎn)Spe I/Xho I中，然后，Spe I/Xho I雙酶切慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS-ompl9，可以得到大小約為534bp的目的DNA條帶，以及10682 bp的慢病毒表達(dá)載體pLEX_MCS ;結(jié)果與預(yù)期相符，說(shuō)明慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS-omp 19構(gòu)建成功。
[0029]3.3同源重組質(zhì)粒pLEX-MCS-omp 19的轉(zhuǎn)染細(xì)胞
通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑慢病毒包裝將pLEX-MCS-omp 19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48h后收毒，然后將毒液與巨噬細(xì)胞共孵育8h后換液，培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24h后用RIPA裂解液，對(duì)細(xì)胞裂解提取總蛋白。
[0030]3.4 Western blot 鑒定 ompl9 蛋白表達(dá)
收集轉(zhuǎn)染之后的巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，濃縮之后經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過(guò)半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)膜至NC膜上，采用本室保存的羊抗布魯氏菌IgG抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊抗體為二抗，進(jìn)行western blot分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的樣本在表達(dá)重組蛋白的位置上有特異的反應(yīng)條帶出現(xiàn)，對(duì)照組無(wú)特異條帶出現(xiàn)(如圖4所示)，說(shuō)明此蛋白可與抗布魯氏菌抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，結(jié)果表明在真核細(xì)胞巨噬細(xì)胞中表達(dá)了此蛋白。
[0031]3.5 IFN-γ 的測(cè)定
轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞12h和24h后，用ELISA法檢測(cè)IFN-γ的含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染pLEX-MCS-omp 19質(zhì)粒組細(xì)胞在12h和24h分泌IFN- γ (如圖5所示)和IL-6 (如圖6所示)顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(Ρ〈0.01)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染0mpl9蛋白可提高細(xì)胞免疫。
[0032]4 討論
布魯氏菌在動(dòng)物機(jī)體中可以在專業(yè)的和非專業(yè)的吞噬細(xì)胞內(nèi)生存繁殖。主要是寄生在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，以及胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞。它能夠逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用并在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存繁殖。近來(lái)陸陸續(xù)續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)于布魯氏菌與宿主細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵性機(jī)制，使得人們對(duì)布魯氏菌的胞內(nèi)生存情況有了一定認(rèn)知，但是有好多機(jī)制還是未知的。在非專業(yè)吞噬細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)吞噬體的形成所起的作用已被一些研究小組證明，但是布魯氏菌在專業(yè)吞噬細(xì)胞中的命運(yùn)和在其內(nèi)的抵抗機(jī)制仍然是一個(gè)未解決的問(wèn)題。在感染過(guò)程中，巨噬細(xì)胞對(duì)布魯氏菌的生存和擴(kuò)散是非常重要的，布魯氏菌在這些細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移還沒(méi)有徹底地弄清楚。布魯氏菌可以通過(guò)呼吸爆發(fā)，吞噬溶酶體融合，內(nèi)吞作用和自噬途徑抑制一個(gè)或更多個(gè)吞噬細(xì)胞的殺菌機(jī)制。巨噬細(xì)胞被布魯氏菌感染后，4個(gè)小時(shí)內(nèi)僅有少量布氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，也有少量布魯氏菌為了生存，在進(jìn)化過(guò)程中獲得了抗宿主免疫反應(yīng)的逃避策略，當(dāng)機(jī)體的天然免疫監(jiān)視較弱時(shí)，致病菌就會(huì)快速繁殖。當(dāng)巨噬細(xì)胞死亡時(shí)又大量釋放出來(lái)，從而造成持續(xù)感染。
[0033]INF-γ是抗布魯氏菌免疫反應(yīng)中關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，主要由活化后的NK細(xì)胞、⑶4+和⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生。其作用主要有:促進(jìn)⑶8+T和⑶4+細(xì)胞的聚集；增強(qiáng)細(xì)胞的抗原呈遞；由IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性氧之間物(R0IS，reactiveoxygenintermediates)從而起到抗菌作用。被非肽類抗原激活的γ δ Τ細(xì)胞也可以分泌IFN- γ來(lái)激活巨噬細(xì)胞的抗菌作用，通過(guò)細(xì)胞毒作用溶解感染的細(xì)胞來(lái)間接控制胞內(nèi)布魯氏菌的數(shù)量。小鼠受布魯氏菌感染后，Thl型免疫應(yīng)答被激發(fā)，在體內(nèi)主要產(chǎn)生了兩種抗體亞型IgG2a和IgG3，對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的殺傷能力增強(qiáng)，IgG2a的分泌依賴于IFN- γ。IL-6為Th2型細(xì)胞因子，它在抗炎作用中發(fā)揮重要作用，該研究表明，0mpl9基因可顯著提高IFN-γ和IL-6水平，Omp 19基因在細(xì)胞內(nèi)可誘導(dǎo)Thl/Th2的混合反應(yīng)，從而提高細(xì)胞免疫，因此，pLEX-MCS-omp 19有望作為抗布魯氏菌的候選疫苗。
[0034]布魯氏菌細(xì)胞膜具有三層的膜結(jié)構(gòu)，最內(nèi)層的膜稱為細(xì)胞質(zhì)膜、外層膜稱為外周胞質(zhì)膜，最外層膜稱為外膜。外膜與肽聚糖(Peptidoglycan，PG)層緊密結(jié)合組成細(xì)胞壁，外膜含有脂多糖(Lipolpolysaccharide，LPS)、蛋白質(zhì)和磷脂層，外膜的蛋白質(zhì)也叫外膜蛋白(Outer Membrane Proteins，OMPs)。外膜蛋白在S型布魯氏菌表面由于受到LPS的遮蓋，不能充分暴露出來(lái)，R型布魯氏菌表面缺少0鏈，0ΜΡ能夠顯露出來(lái)，所以被視為是布魯氏菌表面重要的保護(hù)性抗原。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)布魯氏菌表面的主要OMPs有7類。布魯氏菌的外膜蛋白o(hù)mpl9是研究較多的一個(gè)外膜蛋白，它的缺失可以降低對(duì)多粘菌素B和脫氧膽酸鹽的抵抗能力，其具體原因是改變了外膜上各個(gè)LPS之間的固有結(jié)構(gòu)，打亂了相互之間的作用，使其原先的固有結(jié)構(gòu)不能夠修正，從而改變外膜的特性。本研究發(fā)現(xiàn)0mpl9蛋白在巨噬細(xì)胞內(nèi)能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫，從而可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抵抗布魯氏菌感染，然而，此蛋白是否對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和凋亡產(chǎn)生影響，還有待于進(jìn)一步研究。
[0035]上面對(duì)本專利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本專利并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下做出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.布魯氏菌Ompl9基因在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的布魯氏菌Ompl9基因在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布魯氏菌Ompl9基因在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的布魯氏菌Ompl9基因在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用，其特征在于，布魯氏菌Ompl9基因用于提高細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ水平和IL-6水平。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的布魯氏菌Ompl9基因在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用，其特征在于，采用布魯氏菌Ompl9基因作為亞單位疫苗候選基因。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了布魯氏菌Omp19基因在提高細(xì)胞免疫中的應(yīng)用，采用布魯氏菌Omp19基因作為亞單位疫苗候選基因。根據(jù)Genbank公布的羊布魯氏菌16M株外膜蛋白Omp19基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，以其全基因組為模板，采用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，連接入pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序正確后，構(gòu)建重組質(zhì)粒Plex-MSC-Omp19，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞RAW264.7中，用Western？blot分析Omp19基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，然后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Omp19基因的細(xì)胞對(duì)干擾素-γ分泌的影響，Omp19基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)可顯著提高IFN-γ和IL-6水平。Omp19基因在細(xì)胞內(nèi)具有免疫反應(yīng)原性，可提高細(xì)胞免疫，可作為亞單位疫苗候選基因。
【IPC分類】A61K39/10, A61P31/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105311628
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510850998
【發(fā)明人】張俊波, 印雙紅, 陳創(chuàng)夫, 冉輝, 羅靜, 李建新, 李默
【申請(qǐng)人】銅仁學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日