一種羊種布魯氏菌分子標(biāo)記疫苗株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種羊種布魯氏菌分子標(biāo)記疫苗株及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 布氏桿菌?。ú疾。┦怯刹际蠗U菌（Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人 獸共患傳染病，該病傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重地威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。布病在我國(guó)流行范 圍廣泛，危害嚴(yán)重，雖然自新中國(guó)成立后對(duì)布病開展了全面性的系統(tǒng)防御，但近些年來(lái)，該 病的疫情呈明顯上升趨勢(shì)，被列為再度肆虐的傳染病，引起國(guó)內(nèi)各地區(qū)的高度關(guān)注。
[0003]目前用于布魯氏菌病防控的弱毒活疫苗主要有國(guó)外的牛型19號(hào)弱毒菌株（S19) 和羊型Rev. 1弱毒菌株，國(guó)內(nèi)自主研制的羊型5號(hào)弱毒菌株（M5)和豬型2號(hào)弱毒菌株（S2)。 在我國(guó)主要使用由S2株（豬型2號(hào)苗）制備的弱毒疫苗，該疫苗適用的宿主廣泛，毒力弱， 免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，免疫保護(hù)效率較高，目前成功地防治了牛、羊、豬等布氏桿菌病；但 該疫苗和其它光滑型布魯氏菌疫苗一樣存在一定缺陷，即免疫動(dòng)物后，會(huì)在動(dòng)物機(jī)體誘導(dǎo) 產(chǎn)生S-LPS抗原"0"鏈特異性抗體，不能與野生菌株布魯氏菌感染動(dòng)物相區(qū)分，給布魯氏菌 病的診斷帶來(lái)了很大的麻煩，這在一定程度上限制了疫苗的使用。因此，研制一種既具有良 好的免疫保護(hù)效果，且安全性高，同時(shí)又能區(qū)分自然感染和疫苗免疫的標(biāo)記型布魯氏菌活 疫苗具有重要的實(shí)際意義。
[0004]bp26蛋白，又稱為CP28(CytosolubleProtein)或0MP28,具有較強(qiáng)免疫原性，是 一種可以由細(xì)胞內(nèi)向外釋放的可溶性外周漿蛋白，在不同種型布魯氏菌間具有高度保守 性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中檢測(cè)出針對(duì)此抗原的特異性抗體。研究發(fā)現(xiàn)， bp26基因的缺失突變對(duì)布魯氏菌的生物學(xué)特性和免疫原性幾乎沒有影響，常被作為布魯氏 菌血清學(xué)檢測(cè)的靶蛋白，被認(rèn)為是目前布魯氏菌最為合適的基因缺失疫苗分子標(biāo)志之一。 但有研究發(fā)現(xiàn)僅缺失布魯氏菌bp26蛋白分子作為診斷抗原存在假陽(yáng)性現(xiàn)象，而且，不同宿 主動(dòng)物對(duì)不同毒力菌株bp26基因編碼蛋白的免疫原性存在差異，因此，以bp26蛋白作為鑒 別診斷抗原會(huì)影響布魯氏菌基因缺失疫苗的實(shí)際應(yīng)用效果，從而，雙基因缺失的布魯氏菌 減毒活疫苗受到越來(lái)越多的關(guān)注。
[0005] 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是布魯氏菌外膜的主要成分，是一種重要的 毒力因子，由類脂A、核心寡聚糖和0抗原三部分組成。LPS的完整性決定布魯氏菌表型，對(duì) LPS合成過程中所需酶的編碼基因進(jìn)行突變可導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不完整的粗糙型LPS，使其毒 力變?nèi)?，?jīng)常被用作減毒活菌苗候選株進(jìn)行研究。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與布魯氏菌光滑型表型相 關(guān)的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wboA、wz和wbkC。wboA基因編碼一種糖基轉(zhuǎn) 移酶，該酶參與布魯氏菌LPS中0鏈的形成，該基因的缺失或破壞會(huì)影響布氏桿菌光滑型表 型的形成。RB51是由流產(chǎn)布魯氏菌2308株通過利福平抗性篩選而獲得，是一株缺少0-鏈 的粗糙型菌株，免疫動(dòng)物后血清中不產(chǎn)生抗0-鏈抗體，可用于布魯氏菌病血清學(xué)的鑒別診 斷。目前，RB51疫苗已被美國(guó)、墨西哥、智利等國(guó)家批準(zhǔn)應(yīng)用。
[0006] 布魯氏菌的殘余毒力是評(píng)價(jià)布魯氏菌疫苗有效性的一個(gè)重要指標(biāo)。一般疫苗要求 殘余毒力不能太強(qiáng)，否則會(huì)引起免疫動(dòng)物病，但也不能太弱，否則不能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性 免疫。研究表明，粗糙型布魯氏菌雖然毒力下降，安全性提高，但可能由于過度弱化，致使免 疫動(dòng)物不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)力。另外，有些粗糙型菌株免疫動(dòng)物后，仍能產(chǎn)生微弱地針對(duì) 〇-側(cè)鏈的抗體，從而干擾布病的檢測(cè)，使粗糙型菌株作為布病疫苗的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值遭受質(zhì) 疑。因此，研制既具有免疫保護(hù)作用，又能區(qū)分疫苗免疫和野生毒株感染的粗糙型布魯氏菌 標(biāo)記疫苗已成為布魯氏菌病疫苗的未來(lái)發(fā)展方向。
[0007] 在防治布魯氏菌感染過程中，機(jī)體的細(xì)胞免疫是控制布魯氏菌感染的關(guān)鍵。L7/ L12蛋白是布魯氏菌的一種核糖體蛋白，在菌體合成蛋白質(zhì)多肽鏈的過程中通過與延伸因 子（EFs)相互作用發(fā)揮功能，在各種生物型布魯氏菌中較為保守，是布魯氏菌侵染宿主過 程中的優(yōu)勢(shì)抗原。有研究表明，L7/L12蛋白能特異性地刺激感染動(dòng)物的單核細(xì)胞，刺激 CD4+Thl淋巴輔助細(xì)胞釋放IFN-y因子，從而起到增強(qiáng)免疫保護(hù)效果的作用。
[0008] 粗糙型布魯氏菌基因缺失疫苗雖然能夠解決目前布魯氏菌病活疫苗存在的難題， 但可能會(huì)存在疫苗的免疫保護(hù)作用較弱的缺陷，這為疫苗的廣泛使用帶來(lái)了一定的限制。 利用某些蛋白分子多亞基聚合體的聚合功能，擴(kuò)展免疫原性分子的免疫原性，達(dá)到增強(qiáng)疫 苗免疫保護(hù)效果的目的。目前報(bào)道的具有聚合和放大抗原免疫原性的多聚體蛋白主要是 2, 4_ 二氧四氫蝶啶合成酶（Lumazinesynthase，LS)〇
[0009]布魯氏菌 2, 4_ 二氧四氫蝶啶合成酶（Brucellaspp.Lumazinesynthase，BLS)是 先以二聚體的形式形成穩(wěn)定的五聚物，再由兩個(gè)穩(wěn)定的五聚體形成一個(gè)十聚體，因此，BLS 具有更高的熱穩(wěn)定性和更穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，有研究表明，在BLS的氨基末端插入外源性多 肽片段不會(huì)改變BLS的三維結(jié)構(gòu)，這為BLS作為提高抗原免疫原性的聚合功能提供了基礎(chǔ) 保證；此外，BLS具有較好的佐劑作用，JulianaCassataro等將0mp31的loop區(qū)的27個(gè) 氨基酸與BLS連接制備重組蛋白，免疫Balb/C小鼠后用綿羊附睪型布魯氏菌攻毒，其保護(hù) 性與ReV. 1疫苗相當(dāng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0011] 本發(fā)明提供的重組菌是將布魯氏菌的bp26蛋白的編碼基因替換為BLS蛋白的編 碼基因和L7/L12蛋白的編碼基因，且失活所述布魯氏菌的wboA蛋白的編碼基因，得到的菌 株。
[0012] 上述重組菌中，所述將布魯氏菌的bp26蛋白的編碼基因替換為BLS蛋白的編碼基 因和L7/L12蛋白的編碼基因，且失活所述布魯氏菌的wboA蛋白的編碼基因是將布魯氏菌 的bp26蛋白的編碼基因的部分片段替換為BLS蛋白的編碼基因和L7/L12蛋白的編碼基 因，且缺失所述布魯氏菌的wboA蛋白的編碼基因的部分片段；
[0013] 所述布魯氏菌的bp26蛋白的編碼基因的部分片段為序列表中序列4的第58-582 位核苷酸分子；
[0014] 所述BLS蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?的第504-977位核苷酸分子；
[0015] 所述L7/L12蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?的第978-1352位核苷酸分子；
[0016] 所述布魯氏菌的wboA蛋白的編碼基因的部分片段為序列表中序列5的第1-897 位核苷酸分子。
[0017] 上述重組菌中，所述替換和所述缺失均通過同源重組的方式實(shí)現(xiàn)的；
[0018] 所述將布魯氏菌的bp26蛋白的編碼基因的部分片段替換為BLS蛋白的編碼基因 和L7/L12蛋白的編碼基因是將含有bp26蛋白編碼基因上游同源臂、BLS蛋白編碼基因、L7/ L12蛋白編碼基因和bp26蛋白編碼基因下游同源臂的DNA片段導(dǎo)入所述布魯氏菌中實(shí)現(xiàn)同 源重組；
[0019] 所述含有bp26蛋白編碼基因上游同源臂、BLS蛋白編碼基因、L7/L12蛋白編碼基 因和bp26蛋白編碼基因下游同源臂的DNA片段通過PUC19-SacB-bp26NC-BL重組載體導(dǎo)入 所述布魯氏囷；
[0020] 所述PUC19-SacB-bp26Ne-BL重組載體為將序列表中序列2所示的缺失突變盒 bp26NC-BL插入pUC19-SacB載體的SacI和PstI酶切位點(diǎn)間，且保持pUC19-SacB載體的 其他序列不變得到的載體；
[0021 ] 所述缺失布魯氏菌的wboA蛋白的編碼基因的部分片段是將含有wboA蛋白編碼基 因上游同源臂和wboA蛋白編碼基因下游同源臂的DNA片段導(dǎo)入所述布魯氏菌中實(shí)現(xiàn)同源 重組；
[0022] 所述含有wboA蛋白編碼基因上游同源臂和wboA蛋白編碼基因下游同源臂的DNA 片段通過PUC19-SacB_wboAN/e重組載體導(dǎo)入所述布魯氏菌；
[0023] 所述HJClQ-SacB-wboA^重組載體將序列3所示的缺失突變盒wboA-NC插入到 pUC19_SacB載體中的SacI和PstI酶切識(shí)別位點(diǎn)間，且保持pUC19_SacB載體的其他序列 不變得到的載體；
[0024] 所述bp26蛋白編碼基因上游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列2中第1-503 位；
[0025] 所述bp26蛋白編碼基因下游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列2中第 1353-2117 位；
[0026] 所述wboA蛋白編碼基因上游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列3中第1-618 位；
[0027] 所述wboA蛋白編碼基因下游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列3中第 619-1209 位。
[0028] 上述重組菌中，所述含有bp26蛋白編碼基因上游同源臂、BLS蛋白的編碼基因、 L7/L12蛋白的編碼基因和bp26蛋白編碼基因下游同源臂的DNA片段為序列表中序列2 ;所 述含有wboA蛋白編碼基因上游同源臂和wboA蛋白編碼基因下游同源臂的DNA片段為序列 表中序列3。
[0029] 上述重組菌中，所述pUC19_SacB載體為將序列表中序列1所示的蔗糖敏感基因 (SacBD插入PUC19載體的Ndel酶切識(shí)別位點(diǎn)間得到的載體。
[0030] 上述重組菌中，所述布魯氏菌為羊種布魯氏菌；所述羊種布魯氏菌具體為羊種布 魯氏囷囷株MB6 ;所述羊種布魯氏囷囷株MB6的保減編號(hào)為CGMCCNo. 10964。
[0031] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供羊種布魯氏菌菌株MB6。
[0032] 本發(fā)明提供的羊種布魯氏菌菌株MB6的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10964。
[0033] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種布魯氏菌疫苗。
[0034] 本發(fā)明提供的布魯氏菌疫苗的活性成分為上述重組菌。
[0035] 上述布魯氏菌疫苗是通過皮下、注射、口服或噴霧等方法來(lái)免疫動(dòng)物的。
[0036] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述重組菌或上述羊種布魯氏菌菌株MB6的新用途。
[0037] 本發(fā)明提供了上述重組菌或上述羊種布魯氏菌菌株MB6在制備如下1)_6)中的應(yīng) 用：
[0038] 1)布魯氏菌疫苗；
[0039] 2)降低動(dòng)物組織載菌量的產(chǎn)品；
[0040]3)誘發(fā)細(xì)胞免疫的產(chǎn)品；
[0041] 4)誘發(fā)體液免疫的產(chǎn)品；
[0042] 5)預(yù)防和/或治療布魯氏菌病的產(chǎn)品；
[0043] 6)鑒別或輔助鑒別待測(cè)樣本為上述布魯氏菌疫苗免疫樣本還是野生型布魯氏菌 感染樣本的產(chǎn)品。
[0044] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述布魯氏菌疫苗的新用途。
[0045] 本發(fā)明提供了上述布魯氏菌疫苗在制備具有如下1)_5)中至少一種功能的產(chǎn)品 中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0046] 1)降低動(dòng)物組織載菌量；
[0047] 2)誘發(fā)細(xì)胞免疫；
[0048] 3)誘發(fā)體液免疫；
[0049] 4)預(yù)防和/或治療牛布魯氏菌病和/或羊布魯氏菌病和/或豬布魯氏菌?。?br>[0050] 5)鑒別或輔助鑒別待測(cè)樣本為上述布魯氏菌疫苗免疫樣本還是野生型布魯氏菌 感染樣本。
[0051] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種鑒別待測(cè)樣本為上述布魯氏菌疫苗免疫樣本 還是野生型布魯氏菌感染樣本的方法。
[0052] 本發(fā)明提供的鑒別待測(cè)樣本為上述布魯氏菌疫苗免疫樣本還是野生型布魯氏菌 感染樣本的方法包括如下步驟：將待測(cè)樣本與布魯氏菌MB6Abp26AwboA-BL虎紅平板凝 集抗原混勻，
[0053] 若所述待測(cè)樣本與所述布魯氏菌MB6Abp26AwboA-BL虎紅平板凝集抗原發(fā)生凝 集反應(yīng)，則待測(cè)樣本為或候選為上述布魯氏菌疫苗免疫樣本；
[0054] 若所述待測(cè)樣本與所述布魯氏菌MB6Abp26AwboA-BL虎紅平板凝集抗原不發(fā)生 凝集反應(yīng)，則待測(cè)樣本為或候選為野生型布魯氏菌感染樣本。
[0055] 上述方法中，所述布魯氏菌MB6Abp26AwboA-BL虎紅平板凝集抗原的制備方法 具體如下：
[0056] (1)將上述重組菌接種于肝浸液瓊脂克氏瓶，37°C培養(yǎng)48h，用生理鹽水洗滌并離 心，收集菌體。
[0057] (2)將120g氫氧化鈉溶于2LPH8. 9的碳酸鹽緩沖液，然后加入乳酸540mL，并用 PH8. 9碳酸鹽緩沖液定容到6L，得到緩沖液。
[0058] (3)將4g虎紅染料和396mL蒸餾水混勻，得到虎紅染液。
[0059] (4)將步驟（1)的菌體和碳酸鹽緩沖液混勻（按每克菌體加入22. 5mL碳酸鹽緩沖 液的比例），得到菌懸液；然后將菌懸液與步驟（3)的虎紅染液混勻（按每35mL菌懸液加 入lmL虎紅染液），離心收集菌體沉淀。
[0060] (5)將步驟（4)收集的菌體沉淀與步驟（2)的緩沖液混勻（按每克菌體加入6mL 緩沖液），得到抗原。
[0061] (6)用布魯氏菌MB6Abp26AwboA-BL菌株陽(yáng)性血清（兔血清）標(biāo)化步驟（5)獲得 的抗原，即得到布魯氏菌MB6Abp26AwboA-BL虎紅平板凝集抗原。
[0062] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0063