專利名稱：一種布魯氏菌分子標(biāo)記高免疫保護性弱毒活疫苗及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種布魯氏菌分子標(biāo)記高免疫保護性弱毒活疫苗，尤其是對弱毒疫苗 加以分子標(biāo)記，減弱其毒力，用外源基因提高其免疫保護性，用血清學(xué)方法能將該疫苗接種 的人和動物與野毒感染的區(qū)分開來。本發(fā)明還提供了該疫苗的構(gòu)建方法，屬于分子生物學(xué) 技術(shù)與疫苗生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由小球桿狀布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病， 該嚴(yán)重危害了公共衛(wèi)生安全，每年因此病造成的損失達百億元。當(dāng)前的布魯氏菌疫苗種類較多。重組蛋白疫苗與DNA疫苗保護性能有限，滅活疫 苗保護期短。目前人和動物多用弱毒疫苗來防治該病，弱毒疫苗較前幾種疫苗保護作用及 效果好，但它同樣存在著缺陷，致使人們不敢、不愿也不能對其廣泛應(yīng)用。主要原因是其 一，接種后人們無法區(qū)別自然感染和人工接種免疫。其二，毒性大。其三，也是最關(guān)鍵的一 點是，它保護性能低。所以研制一株能用血清學(xué)方法區(qū)分人與動物是自然感染還是人工接 種免疫，毒力弱、安全性能好，保護性能高的布魯氏菌病弱毒疫苗具有重要的實踐意義。所以構(gòu)建一株能區(qū)分是自然感染還是人工接種免疫，保護性能好，毒力弱的布魯 氏菌弱毒疫苗是本發(fā)明的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種布魯氏菌分子標(biāo)記高免疫保護性弱毒活疫苗，用血清學(xué)方法可區(qū) 分自然感染或野毒感染的加上分子標(biāo)記、高保護性能的布魯氏菌弱毒疫苗，解決了常規(guī)的 布魯氏菌疫苗不能區(qū)分人與動物是人工免疫接種還是野生菌感染、保護性能低的問題。本發(fā)明還提供了該疫苗的構(gòu)建方法，建立起結(jié)核病快速診斷檢測方法。本發(fā)明的布魯氏菌分子標(biāo)記高免疫保護性弱毒活疫苗，特征在于該疫苗是用外源基因30KD基因代替布魯氏菌弱毒疫苗株S19的VirB5基因，對 S19加以分子標(biāo)記。本發(fā)明所述弱毒疫苗的構(gòu)建方法，包括以下步驟以布魯氏菌的弱毒疫苗株S19為起始材料，用PCR的方法從S19的染色體中擴增 出要改造的目的基因VirB5的引導(dǎo)序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改造；通過分 子克隆將結(jié)核桿菌外分泌蛋白30KD替換VirB5基因，再克隆到ρΒΚ-CMV上而成重組質(zhì)粒 PBK-VIRB5,并在pBK-VirB5加上sacB基因，最終成為同源重組載體pBVs ；用電轉(zhuǎn)化法把同源重組載體pBVs轉(zhuǎn)入布魯氏菌S19中，使其線性化，而后插入受 菌體S19的基因組中，并與VirB5基因發(fā)生置換；篩選出單交換子后，再篩選同源重組雙交 換子，即得疫苗。本發(fā)明的積極效果在于提供布魯氏菌分子標(biāo)記、高免疫性弱毒活疫苗，及提供基
3于所說的突變株疫苗的方法。這對布魯氏菌病監(jiān)測、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有 廣泛的應(yīng)用實踐價值。


圖1、在基因打靶引誘臂上，用PCR方法分別從S19基因組中擴贈出30KD基因片段 電泳圖，證實了 30KD基因替換了 virB5基因。圖2、VIRB5蛋白純化電泳圖。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解 到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本 發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實施例1一、同源重組載體(自殺性質(zhì)粒)的構(gòu)建1材料與方法1. 1菌株、質(zhì)粒、載體布魯氏菌S19株、DH5a、T_sacB、pBluescript SK+本研究室保 存；pBK-CMV購自 Stratagene 公司；pSP-Luc NF+購自 Promega公司；pMD18_T simplevector 購自TakaRa公司。1.2試劑限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I (Klenow大片段)，大腸 桿菌 DNA 聚合酶 I，LA-Taq DNA polymerase、Ikbp DNA Ladder Marker、質(zhì)粒 DNA 提取試劑 盒、DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品。1.3PCR 擴增1. 3. 1含有VirB5基因同源重組指導(dǎo)序列的擴增根據(jù)VirB5基因的序列以及 pMD18-Tsimple vector和pBK_CMV噬菌粒載體特點分別設(shè)計引物。從布魯氏菌S19的基因 組中擴增。1. 3. 2結(jié)核桿菌30KD基因擴增 設(shè)計引物從結(jié)核桿菌基因組中擴增。1. 3. 3sacB基因的擴增 分別設(shè)計5'端含有限制性內(nèi)切酶BamH I的上游引物 與含有Sal I酶切位點的下游引物。上游引物GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAG ACAT ；下游 弓丨物 GGATCCTGGGATTCAC CTTTATGTTGATAAG,以 95"C 預(yù)變性 5min，94"C變性 75s，60"C退火 75s, 72°C延伸90s反應(yīng)條件，最后72°C延伸IOmin,以質(zhì)粒pIP279為模板，擴增sacB基因。1.4自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建把1. 3. 1中的擴增出的的基因片段(其中包含VirB5基因)，與pMD18_T相連得 到重組質(zhì)粒P VirB5。把1. 3. 3擴增出的30KD與pMD18_T相連而成重組質(zhì)粒p30KD。把 1. 3. 4擴增出sacB基因片段與pMD18_T相連而成重組質(zhì)粒pSacB。最后按照設(shè)計方案組成 自殺質(zhì)粒pBVs。2 結(jié)果2. IPCR擴增結(jié)果從布魯氏菌S19株基因組擴增出含有VirB5基因；可觀察到與 理論值大小相符條帶。2. 2質(zhì)粒pBVs酶切電泳鑒定經(jīng)Xho I單酶切，在7100bp左右有一電泳帶，與預(yù)
4期值相符；經(jīng)XbaI單酶切，在5400bp左右有一電泳帶，與預(yù)期值相符；經(jīng)EcoR I單酶切，在 12000bp左右有一條帶，與預(yù)期值相符。二、布魯氏菌分子標(biāo)記、毒力缺失疫苗株Δ S19-30KD的構(gòu)建1.1試劑 試劑同上。1. 2肝湯培養(yǎng)基 取新鮮的牛肝去脂肪、筋膜后絞碎，秤取500g，加自來水 IOOOmL與之混合，置鍋中煮沸l(wèi)h，過濾，加水補足原量，加入NaCl 5g，蛋白胨10g。肝湯瓊 脂配制取上述肝湯培養(yǎng)基IOOOmL,加入瓊脂20g，高壓滅菌備用1. 3電轉(zhuǎn)化1. 3. 1感受態(tài)的制備 取240mL對數(shù)生長前中期(0D_ = 0. 15)布魯氏菌液體 培養(yǎng)物放入預(yù)冷的250mL離心管中，迅速將培養(yǎng)物置于冰水混和物中15 30min，不時的緩 慢搖勻保證內(nèi)容物充分冷卻。然后4°C IOOOXg離心15min，回收細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，用冰冷 10%的丙三醇重懸沉淀，以IOOOXg離心15min洗滌細(xì)胞3次。最后用3mL 10%的丙三醇 重懸沉淀制成感受態(tài)。1. 3. 2電轉(zhuǎn)化操作步驟 取0. 5 μ g自殺質(zhì)粒加入100 μ L上述制作的布魯氏菌 電轉(zhuǎn)感受態(tài)中混勻，加入電擊杯中，以E = 12. 5kv/cm電擊，然后立即加入37°C預(yù)熱的ImL 的肝湯培養(yǎng)基中。放入搖床以37°C 180r/min振蕩培養(yǎng)24h。取出200mL涂布于含有篩選 標(biāo)記的肝湯瓊脂平板上，3d后篩選出重組子，挑選出單菌落，進一步培養(yǎng)鑒定。1. 4同源重組子的篩選1.4. 1單交換子的篩選 把電轉(zhuǎn)化受體菌涂布在含有篩選標(biāo)記(Amp 100mg/L， Kan50mg/L)的肝湯瓊脂平板上，因同源重組載體上帶有篩選標(biāo)記基因，所以很容易的篩選 出單交換子。1. 4. 2雙交換子的篩選 將獲得的同源重組單交換子液體培養(yǎng)3d，適當(dāng)稀釋， 涂布于添加5%蔗糖的肝湯培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)4d。因自殺質(zhì)粒上含有sacB基因，該 基因編碼的果糖蔗糖酶，能將蔗糖水解為果糖并生成大相對分子量質(zhì)的果聚糖，在G-細(xì)菌 周質(zhì)空間(極少數(shù)G+細(xì)菌的假周質(zhì)空間結(jié)構(gòu))累積，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長或死亡，挑取單菌 落即為陽性同源重組雙交換子(丟失sacB基因和抗性等載體序列)命名為AS19-30KD。1.5雙交換子的驗證1. 5. IPCR方法的驗證 在VirB5基因的同源臂上設(shè)計引物，同時在S19與雙交 換子Δ S19-30KD基因組中擴增目標(biāo)基因片段，比較其大小。2 結(jié)果2. IPCR法法驗證同源載體pBVs插入S19染色體上與AS19-30KD雙交換子正確性 用PCR方法分別從S19、同源載體插入后的S19、A S19-30KD的基因組中分別擴增出不同片
段，與預(yù)期目標(biāo)一樣。2. 2PCR方法驗證改造后的virB5基因在Δ S19-30KD雙交換子的正確性在基因打 靶引誘臂上，設(shè)計一對引物，用PCR方法分別從S19基因組中擴贈出30KD基因片段。證實 了 30KD基因替換了 virB5基因，電泳圖見附圖1。2. 4AS19-30KD遺傳穩(wěn)定性分析 將Δ S19-30KD傳至20代，用PCR驗證，結(jié)果 同上述(2. 4PCR方法驗證)。證明Δ S19-30KD具有遺傳穩(wěn)定性。試驗例1
布魯氏菌VIRB5蛋白基因的克隆、表達及純化布魯氏菌VIRB5蛋白是一種具有強免疫原性的外周漿蛋白。使用VIRB5蛋白作為 檢測抗原，應(yīng)該有較高的準(zhǔn)確性。本發(fā)明克隆了布魯氏菌的VIRB5蛋白基因，并進行了表達，表達產(chǎn)物通過親和層 析進行了純化。1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1菌株與、質(zhì)粒、載體布魯氏菌S19、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21和pET28a+本研究室保存； pMD18-Tsimple vector 購自 TakaRa 公司。1.1.2 儀器分光光度計Lambda 3B (UV/V/S)，Perkin-ELMER ；脫色搖床 TY-80B，南京大學(xué)。1. 1. 3限制性內(nèi)切酶及其它試劑限制性內(nèi)切酶 NdeI、EcoRI、SacI、Hind III、SalI 和 T4DNA 連接酶均購自 TaKaRa 公司。DNA回收試劑盒同第一章；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自鼎國生物公司； RNase購于華美生物工程公司；IPTG及TMB購自Sigma公司；PVDF膜為Millipore公司 產(chǎn)品；丙烯酸胺、雙甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker購自TaKaRa公司；布魯氏菌陽性 牛血清本室研制，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG購自鼎國生物公司；金屬鰲合層析介質(zhì) Sepharose-4-B _ 自 Pharmacia ^W]。1. 2 方法1. 2. 1目的基因的擴增與克隆根據(jù)VirB5基因的序列以及pMD18-T simple vector和pET28a+表達載體的特點 分別設(shè)計引物用PCR的方法從S19基因組中擴增出VirB5基因片段。重組質(zhì)粒pMDVirB5 送上海生工生物公司進行測序。1. 2. 2重組表達質(zhì)粒pETVirB5的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶同時消化pMDVirB5與pET28a+，分別凝膠回收純化VirB5與 pET28a+基因片段。取目的片段lyL、載體3ul混合后，加IOXLigation buffer 2μ1，Τ4 DNA連接酶。1. 2. 3表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21表達菌將質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化受體菌將1 μ L質(zhì)粒加入到冰浴的已融化的BL21感受態(tài)細(xì)菌中， 輕輕混勻。繼續(xù)冰浴30min，42°C熱休克90s后，立即冰浴3min。將處理過的全部感受態(tài)菌 鋪到預(yù)先在37°C預(yù)熱的含50ug/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均勻涂布菌液，至平板 表面的菌液被全部吸收。37°C孵箱過夜培養(yǎng)。1. 2. 4融合蛋白VIRB5_His的表達。取單個轉(zhuǎn)化菌落接種到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培養(yǎng)液中。于搖床 中37°C，轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)4h至OD6tltl值達0.38。取出ImL未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移到另一管中， 12000轉(zhuǎn)離心lmin，棄上清，保留菌體作為未誘導(dǎo)的對照。剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃 度lmmol/L進行誘導(dǎo)，37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。4h后，收集菌體。1.2.重組蛋白的親和層析
6
每克菌(濕重)加入3ml 裂解緩沖液(pH7. 920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L imidazole，0. 5mmol/L NaCl)，重懸細(xì)菌沉淀。按每毫升裂解緩沖液加入10 μ 1 MgSO4 (Imo 1/ L)，10 μ IDnase (2mg/mL)，2 μ 1 PMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三種試劑，冰上孵育 30min 5000轉(zhuǎn)離心15min收集沉淀，按每克菌濕重加入5ml結(jié)合緩沖液的比例，將沉淀用結(jié) 合緩沖液重懸，-70°C放置過夜。將-70°C放置的菌液冰上融化后，超聲破碎菌體。5000rpm, 4°C離心15min，收集上清。-70°C保存或立即用于純化。將待純化的樣品加到金屬鰲合的柱中，并以最佳流速讓其流過柱床。加入洗脫緩 沖液，待紫外監(jiān)測儀數(shù)值上升時開始接樣，隨數(shù)值上升可分段接樣。直到數(shù)值回落后一段時 間停止接樣。2 結(jié)果2. lVirB5基因的擴增與克隆用PCR方法從布魯氏菌基因組中擴增與VirB5理論大小值相符把目標(biāo)基因克隆到 T載體上，提取質(zhì)粒，與環(huán)形pMDVirB5理論大小值相符。2. 2VirB5蛋白在大腸桿菌BL21中表達及SDS-PAGE分析把重組質(zhì)粒pETVirB5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，挑選陽性克隆，培養(yǎng)到OD6tltl = 0. 38時，加入IPTG到最終濃度lmmol/L，分別誘導(dǎo)2、3、4小時，觀察VirB5蛋白在大腸桿菌 BL21中表達情況，分析認(rèn)為誘導(dǎo)4個小時的表達量最高。2. 4融合蛋白親合層析純化SDS-PAGE分析純化的VIRB5蛋白可見只有一條帶，如附圖2所示，凝膠薄層掃描分 析純度為89%。實驗例2Δ S19-30KD分子標(biāo)記功能的驗證用純化的VIRB5蛋白可以區(qū)別開野毒株感染與Δ S19-30KD接種動物。為了進一 步驗證這一理論，用S19與Δ S19-30KD接種小鼠實驗，而后驗證。1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 菌株布魯氏菌S19本研究室保存；Δ S19-30KD見前述。1. 1. 2ELISA 試劑配制:(1)包被液碳酸鹽緩沖液Na2CO3 (無水碳酸鈉)1. 6g，NaHCO3 (碳酸氫鈉)2. 9g，加去離子水至1000mL。(2)洗滌液pH9· 2磷酸鹽緩沖液(Tween-2O)Na2HPO4 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g, KH2PO4 0. 2g, NaCl 18g，吐溫-20 0. 5mL 加去離子 水至IOOOmL(3)甲液 0. lmol/L 檸檬酸 4. 2g/200mL,乙液 0. 2mol/L Na2HPO4 · 12H20 14. 3g/200mL，取甲液24. 3mL與乙液25. 7mL混合，臨用前加20mg鄰苯胺(OPD)，加過氧化氫 (H2O2) 0. 02mL。(4)終止液2mol/L H2SO4溶液取分析純濃硫酸IlOmL,加去離子水至100mL。1. 1. 3實驗動物
昆明鼠購自長春市生物制品所1. 2 方法1. 2. 1布魯氏菌接種小鼠前的處理用PBS洗兩次，然后用生理鹽水稀釋到1萬/mL。1.2. 2實驗小鼠的接種把布魯菌S19與Δ S19-30KD培養(yǎng)到對數(shù)生長期，用生理鹽水洗滌三次；用生理鹽 水稀釋到目的濃度；對小鼠采用腹腔注射。1. 2. 3被檢動物血清的制備對用S19與Δ S19-30KD免疫14天的小鼠斷尾采血，血樣在4°C冰箱放置3個小時 后，5000rpm離心5min，取上清即為制備血清。1. 2. 4檢測方法(I)ELISA檢測按常規(guī)方法進行，將純化的目的蛋白稀釋到lOng/mL后包被酶標(biāo) 板，用被檢動物血清1 300稀釋作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 1 3000 稀釋作為二抗。同時用標(biāo)準(zhǔn)陰性和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作對照。(2)操作過程用微量移液器向每個孔內(nèi)加100 μ L包被液稀釋的蛋白樣品，置濕 盒內(nèi)于37°C恒溫培養(yǎng)箱中l(wèi)h，然后于4°C冰箱中包被過夜。次日，用洗滌液洗滌二次，甩去 洗滌液，倒置在紗布上輕輕拍扣使孔內(nèi)的液體充分流出，每次間隔3min。向孔內(nèi)分別加入 用稀釋液稀釋好的1 100陽性血清、陰性血清0. lmL，置濕盒內(nèi)于37°C恒溫箱中反應(yīng)Ih 后，甩去血清，用上面的方法洗滌3次，再加入稀釋好的1 200酶標(biāo)記兔抗牛IgG 0. ImL, 置于濕盒內(nèi)于37°C恒溫箱靜置，甩去殘留的酶標(biāo)記物溶液，以同法洗滌三次。加入底物溶液 ΙΟΟμ L/mL，置濕盒內(nèi)于37°C恒溫箱中靜置30min，取出后立即向孔內(nèi)加入0. 02mL終止液， 終止反應(yīng)。(3)結(jié)果判定將培養(yǎng)板放入分光光度計讀取450吸收波的OD值。2 結(jié)果用VIRB5蛋白區(qū)分接種10萬S19與Δ S19-30KD菌體，7d后的小鼠將純化的VIRB5蛋白作抗原，用ELISA法檢測S19與Δ S19-30KD接種的小鼠血清 中是否含有VIRB5蛋白的抗體，很易容區(qū)分S19和Δ S19-30KD接種的小鼠。具體ELISA讀 數(shù)如下表。從表中數(shù)據(jù)可以明顯分辨出S19與AS19-30KD接種的差異。證實了 AS19-30KD 具有分子標(biāo)記功能。S19與Δ S19-30KD接種小鼠7d后ELISA檢測血清結(jié)果抗原稀釋的 4只接種S19的小鼠血清 PBS 4只接種AS19-30KD的小鼠血
權(quán)利要求
一種布魯氏菌分子標(biāo)記高免疫保護性弱毒活疫苗，特征在于該疫苗是用外源基因30KD基因代替布魯氏菌弱毒疫苗株S19的VirB5基因，對S19加以分子標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述弱毒疫苗的構(gòu)建方法，包括以下步驟以布魯氏菌的弱毒疫苗株S19為起始材料，用PCR的方法從S19的染色體中擴增出 要改造的目的基因VirB5的引導(dǎo)序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改造；通過分子 克隆將結(jié)核桿菌外分泌蛋白30KD替換VirB5基因，再克隆到ρΒΚ-CMV上而成重組質(zhì)粒 PBK-VIRB5,并在pBK-VirB5加上sacB基因，最終成為同源重組載體pBVs ；用電轉(zhuǎn)化法把同源重組載體PBVs轉(zhuǎn)入布魯氏菌S19中，使其線性化，而后插入受菌體 S19的基因組中，并與VirB5基因發(fā)生置換；篩選出單交換子后，再篩選同源重組雙交換子， 即得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種布魯氏菌分子標(biāo)記高免疫保護性弱毒活疫苗及構(gòu)建方法，是對弱毒疫苗加以分子標(biāo)記，減弱其毒力，用外源基因提高其免疫保護性，用血清學(xué)方法能將該疫苗接種的人和動物與野毒感染的區(qū)分開來，對布魯氏菌病監(jiān)測、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有廣泛的應(yīng)用實踐價值。
文檔編號C12N1/21GK101912607SQ201010242130
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月2日
發(fā)明者宮鵬濤, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 閆廣謀 申請人:吉林大學(xué)