本發(fā)明涉及一種羊布魯氏菌病參考血清庫，屬于生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌或稱布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。本病不但對(duì)動(dòng)物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計(jì)劃中最重要的目標(biāo)之一。布病在世界存在已有久遠(yuǎn)的歷史，人類對(duì)該病的研究認(rèn)識(shí)逐步加深，對(duì)布病的診斷方法在不斷完善，準(zhǔn)確率不斷提高?？傮w上，布魯氏菌診斷方法主要包括抗原診斷法和抗體診斷法，一般實(shí)驗(yàn)室，主要通過檢測動(dòng)物體內(nèi)的布魯氏菌抗體來判斷動(dòng)物是否感染布魯氏菌。布魯氏菌血清學(xué)方法不僅包括傳統(tǒng)的凝集試驗(yàn)(如：虎紅抗原平板凝集試驗(yàn)、試管抗原凝集試驗(yàn)、乳環(huán)凝集試驗(yàn))，還包括敏感性高、特異性強(qiáng)的ELISA方法、熒光偏振試驗(yàn)(FPA)、膠體金試紙條等新的檢測技術(shù)。凝集試驗(yàn)是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實(shí)驗(yàn)、乳環(huán)沉淀試驗(yàn)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)，其中經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(STAT)、平板凝集試驗(yàn)(PAT)，以上方法在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗(yàn)如虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價(jià)格便宜，操作方便，檢測快速，適于動(dòng)物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測的指定試驗(yàn)，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測的初篩。在布魯氏菌病血清學(xué)檢驗(yàn)中一致認(rèn)為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)在特異性上優(yōu)于其他方法，常被用來對(duì)試管凝集試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測為陽性或可疑的病例進(jìn)行定性檢測。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一直被認(rèn)為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒有一種診斷方法能取代補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在血清學(xué)診斷中的地位。但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)所需要的溶血素的制備困難，試驗(yàn)操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內(nèi)的補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體的作用，導(dǎo)致敏感性下降。ELISA是一種與CFT效果相當(dāng)?shù)脑\斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較好，一次可以完成大量樣品的檢測，既可以作為篩選試驗(yàn)應(yīng)用于動(dòng)物群體檢疫，還可以作為確診試驗(yàn)。ELISA不僅可以應(yīng)用于血清抗體的檢測，還可應(yīng)用于乳樣中抗體的檢測。牛的布魯氏菌病ELISA檢測方法已是國際貿(mào)易中指定的檢測方法之一，其他種布魯氏菌的ELISA檢測方法也是研究的熱點(diǎn)。目前，常用于羊布魯氏菌病檢測的血清學(xué)方法主要包括：試管凝集試驗(yàn)(STAT)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、布魯氏菌競爭ELISA(cELISA)抗體檢測試劑盒。除此之外，熒光偏振(FPA)診斷方法也逐步被應(yīng)用于羊布病的診斷，該方法是一種利用免疫學(xué)和生物物理學(xué)原理開發(fā)的新型快速診斷方法，其基本原理是用熒光素標(biāo)記抗原或者抗體，當(dāng)抗原與特定抗體結(jié)合后，形成抗原/抗體復(fù)合物，分子量增大，使發(fā)射光激發(fā)熒光素分子后偏振角度減小，通過計(jì)算偏振程度的大小，判斷血清是否為布魯氏菌陽性血清。不同血清學(xué)診斷方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，如何客觀評(píng)價(jià)各種血清學(xué)診斷方法的特異性和敏感性評(píng)價(jià)，離不開具有一定規(guī)模、具有代表性的、背景清楚的血清樣本庫。本發(fā)明專利為羊布魯氏菌參考血清庫，為評(píng)價(jià)各種針對(duì)羊的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是通過收集或制備具有一定規(guī)模、一定代表性的、背景清楚的羊魯氏菌不同感染狀態(tài)(自然感染、疫苗免疫、健康)的山羊和綿羊的血清，經(jīng)分裝凍干和各種血清學(xué)檢測，建成羊布魯氏菌參考血清庫，為布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法的科學(xué)評(píng)價(jià)提供參考血清。本發(fā)明的技術(shù)方案1.羊布魯氏菌參考血清庫，其特征在于含有自然感染的羊(包括綿羊和山羊)布魯氏菌陽性血清30份以上；疫苗免疫的羊布魯氏菌陽性血清30份以上(包括綿羊和山羊)；布魯氏菌陰性血清30份以上；羊抗大腸桿菌O157血清、羊抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9血清、羊抗柏林沙門氏菌血清、羊粗糙型布魯氏菌陽性血清各2份以上；本血清庫可為各類羊布病血清學(xué)診斷方法的評(píng)價(jià)提供參考物質(zhì)，其中：(1)血清庫中各份血清均精確分裝，并凍干保存。每份血清的凍干樣本數(shù)大于10，滿足不同時(shí)間使用的可重復(fù)性；(2)血清庫中的布魯氏菌陽性血清、布魯氏菌陰性血清是指用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等方法共同確認(rèn)的血清；(3)大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9、柏林沙門氏菌、粗糙型布魯氏菌陽性血清是易與布魯氏菌抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，血清庫中的羊抗大腸桿菌O157血清、羊抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9血清、羊抗柏林沙門氏菌血清、羊抗粗糙型布魯氏菌陽性血清是用相應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)物人工免疫綿羊制備而成，用以評(píng)價(jià)各種血清學(xué)診斷方法的特異性，屬于質(zhì)控陰性血清的一部分。2.權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌參考血清庫的應(yīng)用，其特征在于使用該血清庫中的參考血清能對(duì)各種羊布病血清學(xué)診斷方法的特異性和敏感性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。本發(fā)明具體實(shí)施方式收集不同背景來源(自然感染、疫苗免疫、健康群體)的山羊和綿羊血清，經(jīng)過虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)初步檢測，再經(jīng)試管凝集試驗(yàn)(SAT)進(jìn)行效價(jià)測定，以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)確診，小量分裝凍干后，分別作為羊布魯氏菌陽性參考血清、羊布魯氏菌疫苗免疫陽性參考血清、羊布魯氏菌陰性參考血清。制備易干擾布病血清學(xué)診斷的其它革蘭氏陰性菌的高免血清，主要包括羊抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9陽性血清、羊抗大腸桿菌O157陽性血清、羊抗柏林沙門氏菌陽性血清、羊抗粗糙型布魯氏菌陽性血清。上述血清小量分裝凍干后，作為羊布魯氏菌特異性陰性參考血清(質(zhì)控陰性血清)。將上述背景清楚、精確分裝凍干的血清作為羊布魯氏菌參考血清庫，用于對(duì)羊布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法進(jìn)行特性和敏感性評(píng)價(jià)。本血清庫為各種羊布病血清學(xué)診斷方法評(píng)價(jià)提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。1.篩選臨床上布病陽性的羊作為陽性血清樣本來源。采用虎紅平板凝集試驗(yàn)分別對(duì)山東地區(qū)有流產(chǎn)史的山羊場和內(nèi)蒙地區(qū)有流產(chǎn)史的綿羊場進(jìn)行布病抗體檢測，對(duì)檢測到的陽性血清，分別用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行效價(jià)測定，同時(shí)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行確診。對(duì)確診為布病陽性的羊，采集更多血清，并試管凝集試驗(yàn)重新測定效價(jià)。將各血清0.5ml/支分裝凍干。2.跟蹤監(jiān)測免疫羊群抗體水平，采集血清作為免疫陽性血清樣本來源。采用布病疫苗(S2株)對(duì)試驗(yàn)綿羊和山羊進(jìn)行口服免疫，25億CFU/頭份。免疫完成后采用虎紅平板凝集試驗(yàn)每周監(jiān)測抗體水平，在抗體水平價(jià)高階段收集部分羊的血清，按照臨床陽性血清樣本制備方法進(jìn)行效價(jià)測定和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)確診。將各血清0.5ml/支分裝凍干。3.監(jiān)測健康羊群布病抗體水平，采集抗體陰性羊的血清作為陰性血清樣本來源。對(duì)未發(fā)生流產(chǎn)的羊場進(jìn)行監(jiān)測，選擇虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)均檢測為陰性的羊，制備陰性參考血清。將各血清0.5ml/支分裝凍干。4.制備小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O、大腸桿菌O157、柏林沙門氏菌、粗糙型布魯氏菌等易與光滑型布魯氏菌抗血清產(chǎn)生干擾的革蘭氏陰性菌滅活抗原，免疫試驗(yàn)綿羊，制備相應(yīng)的抗血清，作為特異性羊布魯氏菌陰性血清樣本來源。將各血清0.5ml/支分裝凍干。5.建立上述各種血清的背景檔案。本發(fā)明涉及生物材料資源信息小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia.enterocolitica)O9W22703株(徐云明等.區(qū)別檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與布魯氏菌LAMP引物的設(shè)計(jì)與分析,中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013年1月第17卷第1期，p19-22)來自吉林大學(xué)人獸共患病研究所；大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)O157(CVCC1489)、沙門氏菌都柏林血清型(Salmonellasp.serotypedublin)C79-86株(CVCC79351)和粗糙生物型布魯氏菌(BrucellamelitensisBiotyperoughness)M111株(CVCC19)均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(請(qǐng)見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p33、p75、p109)。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種羊布魯氏菌參考血清庫，本發(fā)明的意義在于：(1)在國際上率先建成了具有一定規(guī)模的羊布魯氏菌參考血清庫；(2)為布病診斷方法的科學(xué)評(píng)價(jià)提供了殘酷物質(zhì)；(3)為開發(fā)針對(duì)牛的各類布病診斷方法提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)施例以下實(shí)施例為進(jìn)一步說明本發(fā)明，不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例1——臨床陽性參考血清的制備1.采集臨床山羊和綿羊血清各400余份，用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初步測定。取待檢血清0.03ml與等量的布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)：200901)，作平板凝集，于4分鐘內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果。結(jié)果虎紅試驗(yàn)檢測到的陽性血清共144份，其中山羊63份，綿羊81份。2.對(duì)144份虎紅檢測為陽性的樣本進(jìn)一步用試管凝集試驗(yàn)測定布魯氏菌抗體效價(jià)，保留抗體效價(jià)在1﹕100以上的血清樣本，進(jìn)一步進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。具體操作如下：將試管凝集抗原(201501批)用0.5％苯酚生理鹽水(簡稱：石鹽水)作1:20稀釋；將待檢血清分別作1:25、1:50、1:100、1:200稀釋。具體方法是：第一個(gè)管先加入2.4mL石鹽水，以后每管都加入0.5mL石鹽水，向第一個(gè)試管加入0.1mL血清混勻后取0.5mL加到第二個(gè)試管中作1:1稀釋。以后各管類推。第一個(gè)試管應(yīng)棄去1.5ml稀釋血清；將20倍稀釋的布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗原0.5mL分別加入各個(gè)血清試管內(nèi)，搖勻，放37℃24h觀察結(jié)果。最后血清的稀釋度為1:50、1:100、1:200、1:400，同時(shí)按表1設(shè)立比濁管。試驗(yàn)設(shè)陽性血清(201501批)、陰性血清(201501批)和抗原對(duì)照(見表1)。表1試管凝集試驗(yàn)比濁管配制及透明程度表示管號(hào)稀釋菌液(mL)生理鹽水(mL)透明程度10.001.00++++20.250.75+++30.500.50++40.750.25+51.000.00-結(jié)果判定：在對(duì)照成立的前提下判定結(jié)果。待檢血清效價(jià)在1:100(++)以上者為陽性；1:50(++)為可疑，以下為陰性。結(jié)果144份陽性血清中，共監(jiān)測出119份試管凝集試驗(yàn)效價(jià)高于1：100的血清樣本。其中山羊51份，綿羊68份。3.將虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測均為陽性的113份血清，均用生理鹽水作1:10稀釋，于56℃滅能30min后，按表2進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作。最后一次水浴加溫20min后，按表3配制標(biāo)準(zhǔn)溶血管，并進(jìn)行結(jié)果判定。結(jié)果119份陽性血清中，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)共檢測112份陽性血清，其中山羊49份，綿羊63份。表2補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)各試劑加樣量及操作程序表3標(biāo)準(zhǔn)溶血管配制及判定標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施例2——疫苗免疫血清的制備跟蹤監(jiān)測免疫羊群抗體水平，采集血清作為免疫陽性血清樣本來源。采用布病疫苗(S2株)對(duì)試驗(yàn)綿羊和山羊進(jìn)行口服免疫，25億CFU/頭份。免疫完成后采用虎紅平板凝集試驗(yàn)每周監(jiān)測抗體水平，在抗體水平價(jià)高階段收集部分羊的血清，按照臨床陽性血清樣本制備方法進(jìn)行效價(jià)測定和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)確診。將各血清0.5ml/支分裝凍干。實(shí)施例3——144份血清采用三種不同檢測方法測定的結(jié)果。對(duì)144份(其中山羊63份，綿羊81份)經(jīng)虎紅初篩為陽性的血清，進(jìn)一步進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測，篩選三種方法均檢測為陽性的血清作為各陽性血清樣本，進(jìn)行凍干。三種不同方法對(duì)144份血清的檢測結(jié)果如下(表4)：表4臨床采集的羊布病陽性血清采用三種不同檢測方法測定的結(jié)果注：1.RBT：虎紅平板凝集試驗(yàn)，取待檢血清0.03ml與等量的布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)：201501)，作平板凝集，于4分鐘內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果。++++：出現(xiàn)大的凝集片或顆粒，液體完全透明；+++：有明顯的凝集顆粒，液體幾乎完全透明；++：有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明；+：稍能見到凝集，液體混濁；—：無凝集，液體均勻混濁。2.SAT：試管凝集試驗(yàn)，取待檢血清經(jīng)0.5％苯酚生理鹽水分別:25、1:50、1:100、1:200稀釋，與布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)：201501)，進(jìn)行反應(yīng)，37℃作用22～24小時(shí)，判定結(jié)果。4+：菌體完全凝集和沉淀，液體100％清亮；3+：菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體75％清亮；2+：有顯著的凝集和沉淀，液體50％清亮；1+：有清楚可見的凝集和沉淀，液體25％清亮；—：無凝集和沉淀，液體菌液混濁。3.CFT：補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；P：陽性；N：陰性。4.布病陽性血清對(duì)照：2015-1批，裝量：1ml，有效期至2025年3月26日，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所布病實(shí)驗(yàn)室。5.布病陰性血清對(duì)照：2015-1批，裝量：1ml，有效期至2025年5月9日，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所布病實(shí)驗(yàn)室。6.“S”表示來自綿羊的血清樣本；“G”表示來自山羊的血清樣本；“/”表示未檢測。實(shí)施例4——易與布魯氏菌抗血清產(chǎn)生交叉的布魯氏菌陰性參考血清(質(zhì)控陰性血清)的制備和質(zhì)量檢驗(yàn)1.大腸桿菌O157滅活抗原、都柏林沙門氏菌滅活抗原、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和粗糙型布魯氏菌M111滅活抗原的制備(1)大腸桿菌O157滅活抗原的制備將復(fù)蘇的大腸桿菌O157單個(gè)菌落接種到裝有100ml普通肉湯(培養(yǎng)基)的三角燒瓶中，37℃搖振培養(yǎng)12-18h。10000r/min離心10min收集菌體。用10mlPBS重懸菌體，加入50μl福爾馬林溶液，使甲醛含量為0.2％，置37℃滅活24h，中途搖晃3-4次。(2)都柏林沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9采用的培養(yǎng)基，抗原滅活方法與大腸桿菌O157一致；粗糙型布魯氏菌M111采用的培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，抗原滅活方法與大腸桿菌O157一致。(3)抗原的滅活檢驗(yàn)：100μl涂布LB固體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)18h，觀察有無細(xì)菌生長，如果仍有細(xì)菌生長表示滅活不完全，需要繼續(xù)搖振滅活。若如細(xì)菌生長，表示滅活完全。2.免疫抗原制備(1)取少量大腸埃希氏菌CVCC1489株的O157滅活抗原用無菌生理鹽水稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫龋瑓⒄整準(zhǔn)媳葷峁苷f明，此時(shí)細(xì)菌濃度約為8×108CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計(jì)算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至1×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?2)同上法將少量柏林沙門氏菌CVCC79351株滅活抗原稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫龋瑓⒄整準(zhǔn)媳葷峁苷f明，此時(shí)細(xì)菌濃度約為1×109CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計(jì)算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至4×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?3)同上法將少量小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌W22703株O9滅活抗原稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫?，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷f明，此時(shí)細(xì)菌濃度約為8×108CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計(jì)算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至4×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?4)同上法將少量粗糙型布魯氏菌M111株的滅活抗原稀釋至麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤瑵岫龋瑓⒄整準(zhǔn)媳葷峁苷f明，此時(shí)細(xì)菌濃度約為3×109CFU/ml，根據(jù)稀釋比例，計(jì)算滅活菌液原始濃度。據(jù)此，將制備的原始抗原調(diào)整至1×1010CFU/ml，作為免疫用抗原，2～8℃保存?zhèn)溆谩?.免疫免疫一般只需進(jìn)行兩次。初免：用2ml滅活抗原(1×1010CFU/ml)頸部皮下免疫布病陰性羊。加強(qiáng)免疫：初免3個(gè)月后，雙倍劑量頸部皮下加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后2周采血，用試管凝集試驗(yàn)測定凝集效價(jià)應(yīng)不低于1:200。若效價(jià)達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，繼續(xù)加強(qiáng)免疫1～2次，15日后再試血，直至效價(jià)合格。3.血清制備二免14日后采血測定試管凝集效價(jià)，若效價(jià)滿足要求，則頸靜脈采血，分離血清，用0.45μm濾器過濾除菌，加入proclin300至終濃度為0.05％，無菌分裝凍干。4.檢驗(yàn)對(duì)制備完成的布魯氏菌特異性質(zhì)控陰性血清按如下項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)：(1)性狀觀察各凍干制品色澤，加入1ml蒸餾水觀察其溶解性。(2)無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會(huì)，中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，以下稱《中國獸藥典》)附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。(3)特異性檢驗(yàn)1)對(duì)布魯氏菌的特異性將各質(zhì)控陰性血清分別作為待檢血清，用布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算PI，均應(yīng)低于30％。2)對(duì)相應(yīng)病原的特異性4份質(zhì)控陰性血清(SN1～SN4)各作1:100稀釋，分別相應(yīng)的滅活抗原(濃度為2×109CFU/ml)進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)，應(yīng)判為陽性。實(shí)施例5.——布魯氏菌特異性陰性質(zhì)控血清質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果參照實(shí)施例4制備各布魯氏菌特異性陰性質(zhì)控血樣，其中SN1、SN2、SN3和SN4號(hào)分別表示免疫大腸桿菌O157滅活抗原、都柏林沙門氏菌滅活抗原、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和粗糙型布魯氏菌滅活抗原制備的抗血清。陰性質(zhì)控血清，分裝凍干后。抽取血清樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如下：1.性狀均為淡黃色疏松團(tuán)塊，加入1ml蒸餾水后能迅速溶解。2.無菌檢驗(yàn)隨機(jī)各抽取5瓶陰性血清，用1ml無菌蒸餾水復(fù)溶后，全部轉(zhuǎn)移到50ml的硫乙醇酸鹽(T.G)小瓶中，混勻后至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3日后，從T.G小瓶中吸取0.2ml培養(yǎng)物分別接種T.G小管和G.A斜面各2支，1支置25℃培養(yǎng)，另一支置37℃培養(yǎng)；另取0.2ml接種一支G.P小管，置25℃培養(yǎng)，以上試管均培養(yǎng)5日。記錄檢驗(yàn)結(jié)果(見表5)。表5羊布病參考血清庫中特異性陰性質(zhì)控血清無菌檢驗(yàn)結(jié)果“－”表示無菌生長；“+”表示有菌生長。3.特異性檢驗(yàn)(1)對(duì)布魯氏菌特異性采用競爭ELISA方法進(jìn)行。將各質(zhì)控陰性參考血清用布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，根據(jù)OD450值計(jì)算PI，低于30％為布魯氏菌陰性血清。檢測結(jié)果見表6。表6布魯氏菌質(zhì)控陰性血清特異性檢驗(yàn)結(jié)果(2)對(duì)相應(yīng)病原的特異性從質(zhì)控陰性血清SN1、SN2、SN3、SN4中各隨機(jī)抽取3瓶血清，分別用1m無菌蒸餾水復(fù)溶，將各復(fù)溶血清用相應(yīng)試管凝集試驗(yàn)抗原，進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)和結(jié)果判定，檢驗(yàn)結(jié)果見表7。表7布魯氏菌特異性陰性質(zhì)控血清試管凝集效價(jià)檢驗(yàn)結(jié)果結(jié)果說明：4+：菌體完全凝集和沉淀，液體100％清亮；3+：菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體75％清亮；2+：有顯著的凝集和沉淀，液體50％清亮；1+：有清楚可見的凝集和沉淀，液體25％清亮；—：無凝集和沉淀，液體菌液混濁。2++:凝集強(qiáng)度介于3+與2+之間，但更接近2+；2+-:凝集強(qiáng)度介于2+與1+之間，但更接近2+。當(dāng)前第1頁1 2 3